Perché conoscere i metodi strutturali?. ....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc...

Perché conoscere i

metodi strutturali?

....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc tgcctcctacaactagacaa gtcacaatgc aacccctttg ctccagagga aaaggagtaa gcacagagggcttctgagtc cggcaatgct ccatttcctg acaggagcat tttacagact tgcgtctgcccctctgaggg ...

From: Prof. Anna Tramontano

From genome to structure. From structure to function

Biomolecular Structures

New folds per year

NMR vs XRay

Molecule type

Protein

Protein-DNA complexes

DNA

55000

RNA2500

750

1200

Structural Tools

Strumenti per la Biologia strutturale

The Nobel Prize in Physics 1952"for their development of new methodsfor nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith”

Felix Bloch Edward Mills Purcell

The Nobel Prize in Physics 1944"for his resonance method for recording the magneticproperties of atomic nuclei"

Isidor Isaac Rabi

The Nobel Prize in Physics 1943"for his contribution to the development of the molecular ray method and his discovery of the magnetic moment of the proton"

Otto Stern

The Nobel Prize in Chemistry 1991"for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy"

Richard R. Ernst

The Nobel Prize in Chemistry 2002"for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution”

Kurt Wüthrich 1/2 of the prize

The Nobel Prize in Physics 2003”for pioneering contributions to the theory of superconductors”

Alexei A. Abrikosov Vitaly L. Ginzburg 1/3 of the prize 1/3 of the prize

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2003"for their discoveries concerning magnetic resonance imaging”

Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield

Che cosa è uno spin

Che cosa è un momento angolare

Il momento angolare o momento della quantità di moto o impulso angolare di un corpo rotante rispetto al centro attorno al quale gira (detto anche polo) è un'importante grandezza che caratterizza il moto circolare.

Fisicamente è Il momento angolare è definito come il prodotto vettoriale tra il vettore posizione (rispetto alla stessa origine) e il vettore quantità di moto:L=r X mv

Il modulo di è quindi definito da: L=rmv sin.La direzione di è perpendicolare al piano definito da r e da mv ; il verso è quello di un osservatore che vede ruotare in senso antiorario.

Che cosa è un momento angolare di spin

Lo SPIN è una forma di momento angolare.A differenza del momento angolare classico, esso NON è prodotto dalla rotazione di un oggetto intorno ad un asse ma è una intrinseca proprietà dell’oggetto studiato.

S= [S(S+1)]½ h/2

Relazione tra spin e momento angolare di spin

Spin e momento angolare di spin

[S(S+1)]½ h/2

Ad una particella, dotata di spin S(dove S ha tipicamente valore ½) è associato un momento angolare di spin dato da

Dove h/2è una costante di proporzionalità chiamata costante di Planck h/21,054x10-34 Js-1 = ħ

Che cosa è un momento magnetico Il momento magnetico è un VETTORE che misura la capacità di un oggetto di interagire con i campi magnetici

E= -B cos bussola

Il Magnetismo si occupa si studiare le proprietà magnetiche delle sostanze, ovvero da che cosa dipende il momento magnetico m di una sostanza

Minima energia quando il momento magnetico ed il campo magnetico sono paralleli

Che cosa è un momento magnetico di spin

Ad ogni momento angolare di spin viene associato un momento magnetico di spin

= -S

Figure 2.5 Levitt

La costante di proporzionalità tra il vettore momento angolare ed il vetore momento magnetico è detta RAPPORTO GIROMAGNETICO

Il rapporto giromangetico è una proprietà intrinseca di ogni particella


= -S

SPIN S=1/2

Momento angolare di spin

Momento magnetico di spin

S= [S(S+1)]½ h/2


Ogni spin quindi si comporta come un piccolo ago di una bussola.Quando viene immerso in un campo magnetico, lui tende ad orientarsi lungo il campo magnetico in modo da assumere il minimo di energia

E= -B cosS cosB

Quantizzazione Il concetto di spin è associato alla meccanica quantistica, ovvero alla fisica che descrive il comportamento dei sistemi con particelle “infinitamente piccole” ovvero non trattabili con le regole della fisica classica.

In accordo alla meccanica quantistica, l’energia della interazione tra il momento magnetico di spin ed il campo magnetico non puo’ essere “qualsiasi”, ma puo’ assumere solo valori definiti

NO

Quantizzazione Il concetto di spin è associato alla meccanica quantistica, ovvero alla fisica che descrive il comportamento dei sistemi con particelle “infinitamente piccole” ovvero non trattabili con le regole della fisica classica.

In accordo alla meccanica quantistica, l’energia della interazione tra il momento magnetico di spin ed il campo magnetico non puo’ essere “qualsiasi”, ma puo’ assumere solo valori definiti

E= -B cosS(S+1)]1/2 ħ B cos

E= ħ m B

m=+1/2 , -1/2

Quantizzazione Quindi, quando uno particella con uno spin S=1/2 è immersa in un campo magnetico, ci sono solo due valori di Energia possibili (permessi)

E= -B cosS(S+1)]1/2 ħ B cos

E= ħ m B

m=+1/2 , -1/2

E= ħ B

E= ħ B

Che cosa è una onda

Lunghezza d’onda = tratto corrispondente all’intero ciclo di valori

Frequenza = numero di volte per secondo in cui il vettore assume l’intero ciclo di valori

Hzc (m s-1)/(m)

Diffrazione della luce visibile da parte di un prisma e spettro della

luce.

Spettro delle radiazioni elettromagnetiche

by A

ndre

as K

amlo

wsk

i

Relazione fra energia e frequenza

E = h

h = costante di Plank 6.62 x 10-34 J s

E

Adesso cominciamo

Come è fatto un nucleo

Isotopi, IsotopomeriTabella periodica

Nota bene Un momento angolare di spin si indica generalmente con la lettera S

Molto spesso quando si trattano argomenti di questo tipo, si usano due lettere distinte per distinguere uno momento angolare o un numero quantico di spin elettronico da uno di spin nucleare

S I

Ripasso.Nuclidi

Un nuclide è un atomo caratterizzato dal numero atomico Z (numero di protoni) e dal numero di massa A (numero di neutroni e di protoni).

Il nuclide neutro ha un numero di elettroni uguale a quello di protoni.

Il numero Z caratterizza la specie atomica.

XA

Z

C12

6H

1

1 O16

8

Proprietà magnetiche delle particelle subatomiche

Ogni protone ed ogni neutrone possiede un numero quantico di spin I= +-1/2, in analogia alla situazione che voi già conoscete per gli elettroni.

Tutti gli isotopi con un numero dispari di PROTONI O DI NEUTRONI nucleoni hanno un numero quantico di spin I≠0.

Ad ogni nucleo sarà associato un numero quantico di spin nucleare che è la somma di tutti i numeri di spin dei nucleoni. Analogamente agli elettroni, i nucleoni tendono ad “appaiare” lo spin.

Per i nucleoni piu’ pesanti, la regola di “massimo appaiamento” non è sempre verificata, per cui alcuni isotopi hanno numero quantico di spin >1/2. Alcuni nucleoni con numero di massa pari possiede I=1,2,3.. Mentre alcuni isotopi con numero di nucleoni dispari possiede I=3/2, 5/2, 7/2..

Livelli Energetici di spin nucleare

p p p n n n

I=1

I=0

I=2

I=1

I=0

I=1

I=1

I=0

Spin nucelare e nuclidi

Protoni Neutroni I

pari pari 0

dispari dispari 1,2,3

pari dispari ½,3/2, 5/2, 7/2

dispari pari ½,3/2, 5/2, 7/2

NMR-active nuclei with different spin numbers

I=0

I=1/2, 3/2, 5/2

I=1,2,3

Nuclei NMR-attivi

Tutti i nuclidi con un numero quantico di spin nucleare I diverso da zero sono NMR attivi,

Ovvero possono essere studiati via NMR

Per i piu’ comuni studi NMR vengono utilizati solo quei nuclidi con spin nucleare I=1/2


11H, 2

1H, 42He, 12

6C, 136C, 14

7N, 157N,

168O, 17

8O, 199F, 23

11Na,

2713Al 31

15P, 3517Cl, 54

26Fe


I=0

I=1/2, 3/2, 5/2

I=1,2,3

42He, 12

6C, 168O, 54

26Fe

11H, 13

6C, 157N, 17

8O, 199F,

2311Na, 27

13Al 3115P, 35

17Cl,

21H, 14

7N,


I=1/2 11H, 13

6C, 3115P, 19

9F, 157N

I=3/2 2311Na 35

17Cl

I=5/2 178O 27

13Al

• Fine Lezione 1 15/03/2010

Isotopi

C12

6 C14

6

Nuclidi con lo stesso Z ma differente A possono esistere e si chiamano isotopi.

Una stessa specie atomica ha, di norma, diversi isotopi: si parla di miscela isotopica naturale.

C13

6

NMR e tabella periodica

Su questa base, quasi tutti gli elementi avranno almeno 1 isotopo NMR attivo

C12

6 C14

6C13

6

98,9 % 1,11 % tracce

Isotopi naturali di alcuni elementi

Nuclide Massa relativa % di nuclidi

1H 1,007825 99,9852H 2,014102 0,015

3He 3,016030 ~ 10-4

4He 4,002604 ~ 1006Li 6,015126 7,427Li 7,01605 92,589Be 9,012186 ~ 100

10Be 10,013535 tracce10B 10,012939 19,611B 11,009305 80,411C 11,011433 tracce12C 12, 98,8913C 13,003354 1,1114C 14,003142 tracce

Alcuni Isotopi e loro proprietà

Momento Magnetico

=I

Ad un momento angolare di spin I è sempre associato un momento

magnetico di spin

Un momento magnetico può essere considerato come una piccola calamita. Come tale, se immersa in un campo magnetico, essa puo’ orientarsi in modo parallelo o antiparallelo al campo magnetico applicato esterno.

B0

Momento Magnetico

=I

Ad un momento angolare di spin I è sempre associato un momento

magnetico di spin

Il rapporto giromagnetico è una costante di proporzionalità tra il numero quantico di spin ed il momento magnetico. In pratica, due nuclidi con stesso valore di I (es: 1

1H e 136C) hanno un diverso

momento magnetico perché ogni nuclide ha un proprio valore di .

B0

Rapporto giromagneticoE= ħ m B E= ħ B

La separazione in energia dipende dal valore del rapporto giromagnetico

L’energia della transizione NMR

B0

Em=+1/2

m=-1/2

I due livelli energetici sono degeneri se B0=0

Il campo magnetico B0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

Come si distribuiscono gli spin nei vari livelli energetici?

B0

B0 B0

Statistica di Boltzmann

N up

N low= e -E/kT

N up - N low

N up + N low= E/2kT ca. 10-4-10-5

La differenza di popolazione tra il livello fondamentale ed il livello eccitato è molto piccola

D- Me ne importa qualcosa? R- ECCOME!

La differenza di popolazione determina il numero di spin che effettivamente prendono parte alla transizione

La differenza di popolazione dipende dalla differenza di energia tra i due livelli

Magnetizzazione osservabile

B0

• Fine lezione 2 marzo 9 2011

Magnetizzazione osservabile

B0

Momento Magnetico

m=+1/2 m=-1/2

E=+1/2ħ B E=-1/2ħ B

Momento Magnetico

Il momento magnetico non è un oggetto statico, ma puo’ essere descritto come una trottola, che possiede una certa velocità angolare , tipica di ogni spin

Momento Magnetico

L’energia di ogni spin è data, in termini fisici, dal prodotto scalare tra il campo magnetico applicato B0 ed il momento magnetico della particella

E=- •B0

Momento Magnetico

Questo prodotto scalare dipende dall’orientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dell’energia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo’ essere +1/2 oppure -1/2

E=-mħ B

Momento Magnetico

m=+1/2 m=-1/2

E=+1/2ħ B E=-1/2ħ B

Momento Magnetico

m=+1/2 m=-1/2

E=+1/2ħ B E=-1/2ħ BStato fondamentalePiù popolato

Stato eccitatoMeno popolato

B0

E = B0

E = mB0

: m = +½

+½

E½B0

: m = ½½

E½B0

Ogni momento magnetico precede intorno al campo magnetico statico B0

Spin equivalenti precedono tutti con la stessa velocità 0 anche se ciascuno con una fase diversa

equivalenti significa nuclidi di atomi identici

CH3CH2OH

La frequenza di precessione di Larmor

B0

M0

E = B0

E = mB0

: m = +½

+½

E½B0

: m = ½½

E½B0

kT

E

eP

P

M0 = = Mz

Mx = My = 0

La frequenza di precessione di LarmorPoiche il numero dei momenti magnetici allineati con il campo magnetico é leggermente maggiore di quelli anti allineati la risultante é un vettore magnetizzazione M allineato lungo l’asse z

La differenza tra le due popolazioni é tanto maggiore quanto piu’ elevata e la differenza di energia tra i due livelli

B0

E = B0

E = mB0

: m = +½

+½

E½B0

: m = ½½

E½B0

E = B0 = h

La differenza di energia,(E-E), dipende dal tipo di nucleo (ogni nuclide a un diverso valore di g) e dal campo magnetico applicato

La differenza di energia é anche legata alla frequenza di precessione, ovvero alla velocità angolare con cui tutti I nuclidi equivalenti ruotano intorno a B0

La frequenza di precessione di Larmor

Il rapporto giromagnetico

E=(h/2)B0

z=Iz =(h/2)mz

Non tutti gli isotopi con I=1/2 hanno le stesse proprietà magneticheIl momento magnetico è diverso per ogni isotopo e dipende dalla costante

Tanto maggiore è , tanto piu’ alta sarà la differenza di energia tra i 2 livelli della transizione NMR.Ovvero tanto maggiore sarà la sensibilità dell’esperimento

Effetto di un campo magnetico su uno spin nucleare

Mo


E= - •B bussola

E= - mħB quantizzazione

E2- E1 =E= - ħB= h

= B/2 Frequenza di risonanza di uno spin nucleare


Se non applico un campo magnetico esterno non succede nullaQuando gli spin nucleare sono immersi in un cmpo magnetico,Ciascun spin assume una propria frequenza di risonanza che è tanto piu’ alta quanto maggiore è il campo magnetico applicato

Frequenze di risonanza

LEZIONE 2

Different Isotopes Absorb at Different Frequencies

low frequency high frequency

15N 2H 13C 19F 1H

50 MHz 77 MHz 125 MHz 200 MHz 470 MHz 500 MHz

31P

I parametri NMR

Il chemical shift

Le costanti di accoppiamento

La intensità dei segnali

La frequenza di precessione di un determinato nucleo ad un determinato campo magnetico è detta FREQUENZA DI PRECESSIONE DI LARMOR

Frequenza di precessione

0 = - B0 /2π

Se cosi fosse, ogni nucleo attivo entrerebbe in risonanza con il campo esterno alla sua frequenza e tutti gli isotopi uguali si comporterebbero allo stesso modo (un unico segnale).

Es: al campo magnetico di 11.7 T, La FREQUENZA DI PRECESSIONE DI LARMOR del nuclide 1H è 500 MHz.

La costante di schermo

Costante di schermo

= Costante di schermo

Dipende dall’intorno elettronico

Chemical shift

refrefppm

Es: 1= 500.131 MHz 0=500.13 MHz1-0=1000 Hz

= 1000/500.13x106

(ppm)= 2.0

Campi magnetici elevati determinano un aumento della risoluzione e della sensibilità

Chemical shift

Spettro 1H NMR di Vanillina

750 MHz 1H NMR Spettro di Tyrosine Kinase

1H NMR Spettro di vari solventi

13C NMR del Fullerene (C60)

Typical 1H NMR Spectrum

Ab

so

rba

nc

e

Spettro 1H NMR di Citocromo c

TMS (Tetramethylsilane)

chemical shift

Fattori che influenzano il chemical shift

Caratteristiche funzionaliEffetti attraverso lo spazioEffetti paramagnetici

Perché ogni spin 1H ha una frequenza diversa?

eff=(1-)B0

CH3Cl

CH3Br

Effetti induttivi

Effetto della Sostituzione sul Chemical Shift

CHCl3 CH2Cl2 CH3Cl 7.26 5.32 3.05 ppm

-CH2-Br -CH2-CH2Br -CH2-CH2CH2Br 3.30 1.69 1.25 ppm

Effetti Mesomeri

Competizione traeffetto mesomero ed effetto induttivo

Fattori che influenzano il chemical shift

Caratteristiche funzionaliEffetti attraverso lo spazioEffetti paramagnetici

Anisotropia di schermo indotta dai legami chimici

Correnti d’anello

Some paradigmatic examples

NMR in macromolecole NMR in macromolecole biologichebiologiche

The amount of shielding the nucleus experiences will vary with the density of the surrounding electron cloud If a 1H nucleus is bound to a more electronegative atome.g. N or O as opposed to C, the density of the electron cloud will be lower and it will be less shielded or “deshielded”. These considerations extend beyond what is directly bonded to the H atom as well.

Simple shielding effects--electronegativity

N

H

C

H

more electronwithdrawing--less shielded

less electronwithdrawing--more shielded

less shielded higher resonance frequency

more shielded lower resonance frequency

amides (HN) aliphatic/alpha/beta etc.(HC)

most HN nuclei come between 6-11 ppm while mostHC nuclei come between -1 and 6 ppm.

Simple shielding effects--electronegativity

One consequence of these effects is that aromatic protons, which are attached to aromatic rings, are deshielded relative to other HC protons. In fact, aromatic ring protons overlap with the amide (HN) region.

aromatic region (6-8 ppm)

amide region (7-10 ppm)

More complex shielding effects:Aromatic protons

It should now be apparent to you that different types of proton ina protein will resonate at different frequencies based on simple chemical considerations. For instance, H protons will resonate in a region centered around the relatively high shift of 4.4 ppm, based on the fact that they are adjacent to a carbonyl and an amine group, both of which withdraw electron density. But not all H protons resonate at 4.4 ppm: They are dispersed as low as ~3 and as high as ~5.5. Why?

“H region”

“Average” or “random coil” chemical shifts in proteins

One reason for this dispersion is that the side chains of the 20 aminoacids are different, and these differences will have some effect on the H shift.

The table at right shows “typical” values observed for different protons in the 20 amino acids. These were measured in unstructured peptides to mimic the environment experienced by the proton averaged over essentially all possible conformations. These are sometimes called “random coil” shift values.

Note that the Hshifts range from ~4-4.8, but Hshifts in proteins range from ~3 to 5.5. So this cannot entirely explain the observed dispersion.

Amino acid structures and chemical shifts

note: the shifts are somewhat different from theprevious page because they are measured on the free aminoacids, not on amino acids within peptides

Tabella 1H chemical shift in

peptidi e proteine

chemical shifts in proteins. Secondary structure

Note that the Ha shifts range from ~4-4.8, but Ha

shifts in proteins range from ~3 to 5.5. So this cannot entirely explain the observed dispersion.

A simple reason for the increased shift dispersion is that the environment experienced by 1H nuclei in a folded protein (B) is not the same as in a unfolded, extended protein or “random coil” (A).

shift of particular proton in folded protein influenced by groups nearby in space, conformation of the backbone, etc. Not averaged among many structures because there is only one folded structure.

So, some protons in folded proteins will experience very particular environments and will stray far from the average.

shift of particular proton in unfolded protein is averaged over many fluctuating structures

will be nearrandom coilvalue

Regions of the 1H NMR Spectrumare Further Dispersed by the 3D Fold

What would the unfolded protein look like?

Example: shielding by aromatic side chains in folded proteins

Picture shows the side chain packing in the hydrophobic core of a protein--the side chains are packed in a very specific manner, somewhat like a jigsaw puzzle

a consequence of this packing is that some protons may be positioned within the shielding cone of an aromatic ring such as Phe 51. Such protons will exhibit unusually low resonance frequencies (see picture at left). Note that such effects depend upon precise positioning of side chains within folded proteins

++

shielded methylgroup

methyl regionof protein spectrum

poorlydispersed amides

poorlydispersed aromatics

poorlydispersed alphas

poorlydispersed methyls

very shielded methyl

unfoldedubiquitin

foldedubiquitin

so you can tell if your protein is folded or not by looking at the 1D spectrum...

What specifically to look for in a nicely folded protein

noticearomatic/amideprotons withshifts above 9and below 7

notice alpha protonswith shifts above 5

notice all these methyl peaks withchemical shifts around zero or evennegative

Linewidths in 1D spectra: aggregation andconformational flexibility

Linewidths get broader with larger particle size, due to faster transverse relaxation rates. We’ll learn the physical basis for the faster relaxation later. Broader than expected linewidths can indicate that the protein is aggregated. It can also indicate that the protein has conformational flexibility, i.e. that its structure is fluctuating between several slightly different forms. We’ll learn why this is when we cover the effect of protein dynamics on NMR spectra. Conformational flexibility also tends to reduce dispersion by averaging the environment experienced by a nucleus.

An example of analyzing linewidths and dispersion:

Hill & DeGrado used measurements of chemical shift dispersion and line broadening in the methyl region of 1D spectra to gauge the effect of mutations at position 7 on the conformational flexibility of 2D protein

leucine and valine mutants have poordispersion and broad lines, despite being very stably foldedand not aggregated (circular dichroism and analytical ultra- centrifugation measurements). These mutants are folded but flexible.

Hill & DeGrado (2000) Structure 8: 471-9.

Heteronuclei

13C NMR

The rules discussed for 1H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13C spins. Some general features of 13C should be pointed out:

Unlike 1H atoms, 13C atoms may form a different number and type of chemical bonds. Therefore, the

shielding/deshielding effects are much more effective. The chemical shift range of 13C spins spans more than

200 ppm

Range of observed shifts for 13C

A protein 13C NMR spectrum (low resolution)

Backbone CO and side chain COO- signals

Aromatic signals

Aliphatic

13C NMR


The amino acid dependence of chemical shift values is stronger for 13C atoms than in 1H atoms. Therefore, each amino acid has an almost unique pattern of 13C chemical

shifts

13C chemical shifts are residue-

specific

13C NMR


The chemical shift from secondary structure can be used to get the secondary structure arrangement

directly from 13C shifts of C, C and C’ spins

Fig. 1. Simulated 13C chemical-shift distribution of

(a) Ala and (b) Met. (•) Strand; ( ) coil; (

) helix.

http://www.proteinscience.org/content/vol11/issue4/images/large/45016-14f1_F1TT.jpeg

15N: backbone and side chains

H2CHS

SCH3

Cys Met

NHN

His

O

OH

OOH

Asp Glu

HO

Tyr

CH3

HO HO

Ser Thr

O

NH2

ONH2

Asn Gln

CH2 CH2CH2 CH2 CH2

H2C

CH2 CH2 HC CH2 CH2

H2C

Arg and Lys 15N side chain resonances are difficult to be detected (around 60 and 30 ppm)

Trp N at about 12 ppm in proton and 135 in 15N

Arg side chain

protonated (chloride salt) deprotonated

watera DMSOb chloroformb watera DMSOb chloroformb

terminal -NH2

(av value) 51.4 55.3c 49.3 68.1 59.2 54.2

internal -NH- 63.8 66.0 65.3 68 64.9 65.9

His side chains

NHN

CH2

NHN

CH2

1 2

Tautomeric equilibrium

170 and 260 ppm arise from the protonated and nonprotonated nitrogens, respectively

Perché conoscere i metodi strutturali?. ....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc...

Documents

Transcript of Perché conoscere i metodi strutturali?. ....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc...