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PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 test per l'utilizzo con Autostainer Link 48

Sommario

1. Uso previsto.................................................................................................................................................................................... 2 2. Riepilogo e spiegazione................................................................................................................................................................. 2

2.1 NSCLC .......................................................................................................................................................................................2 2.2 Melanoma ..................................................................................................................................................................................2

3. Principio della procedura .............................................................................................................................................................. 2 4. Materiali forniti ................................................................................................................................................................................ 2 5. Materiali necessari ma non forniti ................................................................................................................................................ 4 6. Precauzioni...................................................................................................................................................................................... 4 7. Conservazione ................................................................................................................................................................................ 5 8. Preparazione dei campioni ............................................................................................................................................................ 5

8.1 Sezioni incluse in paraffina .....................................................................................................................................................5 8.2 Conservazione consigliata per le sezioni tagliate.................................................................................................................5

9. Preparazione dei reagenti .............................................................................................................................................................. 5 10. Procedura di colorazione sul sistema Autostainer Link 48........................................................................................................ 6 11. Controllo di qualità ......................................................................................................................................................................... 6 12. Verifica del saggio.......................................................................................................................................................................... 6 13. Interpretazione del punteggio ....................................................................................................................................................... 7

13.1 NSCLC .....................................................................................................................................................................................7 13.2 Melanoma ................................................................................................................................................................................7

14. Valutazione dei vetrini.................................................................................................................................................................... 8 15. Limiti generali ............................................................................................................................................................................... 10 16. Limitazioni specifiche del prodotto ............................................................................................................................................ 10 17. Valutazione delle prestazioni ...................................................................................................................................................... 11

17.1 Valutazione delle prestazioni non cliniche: tessuti normali e neoplastici......................................................................11 17.2 Valutazione delle prestazioni cliniche: NSCLC .................................................................................................................13 17.3 Valutazione delle prestazioni non cliniche: NSCLC..........................................................................................................16 17.4 Valutazione delle prestazioni non cliniche: melanoma ....................................................................................................18

18. Risoluzione dei problemi ............................................................................................................................................................. 19 19. Bibliografia .................................................................................................................................................................................... 20

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PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 test per l'utilizzo con Autostainer Link 48

1. Uso previsto

Per uso diagnostico in vitro. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è un saggio immunoistochimico qualitativo che utilizza Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3, destinato all'uso nella rilevazione della proteina PD-L1 in tessuto di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) e di melanoma fissato in formalina, incluso in paraffina (FFPE), con il sistema di visualizzazione EnVision FLEX su Autostainer Link 48. Cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) L'espressione della proteina PD-L1 viene determinata utilizzando il punteggio TPS (Tumor Proportion Score), che rappresenta la percentuale di cellule tumorali vitali che mostrano una colorazione di membrana parziale o totale a qualunque intensità. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è indicato come ausilio nell'identificazione di pazienti affetti da NSCLC idonei al trattamento con KEYTRUDA® (pembrolizumab). Vedere l'etichetta del prodotto KEYTRUDA® per i valori di cut-off dell'espressione che determinano la terapia in condizioni cliniche specifiche.

2. Riepilogo e spiegazione

Il legame dei ligandi di PD-1, PD-L1 e PD-L2, al recettore PD-1, localizzato sulle cellule T, inibisce la proliferazione delle cellule T e la produzione di citochine. In alcuni tumori si verifica una sovraregolazione dei ligandi di PD-1 e la relativa via di trasduzione del segnale può contribuire a inibire la sorveglianza immunitaria delle cellule T attive dei tumori. KEYTRUDA è un anticorpo monoclonale umanizzato che si lega al recettore PD-1 e ne blocca l'interazione con PD-L1 e PD-L2, rilasciando l'inibizione della risposta immunitaria mediata dalla via di trasduzione del segnale di PD-1, inclusa la risposta immunitaria anti-tumorale. In modelli tumorali murini singenici, il blocco dell'attività di PD-1 ha portato a una riduzione della crescita tumorale (1).

2.1 NSCLC

Nello studio clinico sponsorizzato da Merck Sharp & Dohme, KEYNOTE-024 (KN024), è stata analizzata la validità clinica di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx nell'identificazione di pazienti affetti da NSCLC non precedentemente trattati, con espressione di PD-L1 (TPS ≥ 50%), che potrebbero mostrare una risposta al trattamento con KEYTRUDA. I pazienti con NSCLC che esprimevano PD-L1 (TPS ≥ 50%) trattati con KEYTRUDA hanno mostrato un miglioramento degli esiti clinici rispetto a quanto osservato con il trattamento chemioterapico standard. Fare riferimento alla sezione "Valutazione delle prestazioni cliniche (NSCLC)" di seguito per i dettegli dello studio KN024. Nello studio clinico sponsorizzato da Merck Sharp & Dohme, KEYNOTE-010 (KN010), è stata analizzata la validità clinica di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx nell'identificazione di pazienti affetti da NSCLC precedentemente trattati, con espressione di PD-L1 (TPS ≥ 1%), che potrebbero mostrare una risposta al trattamento con KEYTRUDA. I pazienti con NSCLC che esprimevano PD-L1 (TPS ≥ 1%) trattati con KEYTRUDA hanno mostrato un miglioramento degli esiti clinici rispetto a quanto osservato con il trattamento con docetaxel. Fare riferimento alla sezione "Valutazione delle prestazioni cliniche (NSCLC)" di seguito per i dettagli dello studio KN010.

2.2 Melanoma

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx può essere utilizzato per determinare lo stato di PD-L1 in pazienti con melanoma considerati candidati per il trattamento (2).

3. Principio della procedura

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx include il protocollo e i reagenti ottimizzati necessari per l'esecuzione di una procedura di colorazione IHC di campioni FFPE con Autostainer Link 48. Una volta eseguita l'incubazione con l'anticorpo monoclonale primario anti-PD-L1 o con il reagente di controllo negativo Negative Control Reagent (NCR), i campioni vengono incubati con un anticorpo Linker specifico per la specie ospite dell'anticorpo primario, quindi vengono incubati con un reagente di visualizzazione pronto per l'uso che consiste di molecole di anticorpo secondario e molecole di perossidasi di rafano legate a uno scheletro di polimeri di destrano. La conversione enzimatica del cromogeno aggiunto successivamente causa la precipitazione di un prodotto di reazione visibile nel sito dell'antigene. Il colore della reazione cromogena viene modificato da un reagente di potenziamento del cromogeno. Il campione può quindi essere sottoposto a colorazione di contrasto e coperto con un vetrino coprioggetto. L'interpretazione dei risultati avviene per mezzo di un microscopio ottico.

4. Materiali forniti

Ogni kit contiene 19,5 mL di anticorpo primario contro PD-L1 (concentrazione proteica pari a circa 3 µg/mL) e include i reagenti necessari per effettuare 50 test in un massimo di 15 cicli di colorazione singoli. I materiali elencati di seguito sono sufficienti per 50 test (50 vetrini incubati con Primary Antibody contro PD-L1 e 50 vetrini incubati con corrispondente Negative Control Reagent; 100 vetrini in totale). Il numero dei test è basato sull'uso di 2 x 150 µL per vetrino di ciascun reagente ad eccezione di DAB+ e Target Retrieval Solution. Il kit fornisce materiale sufficiente per un massimo di 15 cicli di colorazione singoli.

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Quantità Descrizione 1 x 34,5 mL Peroxidase-Blocking Reagent

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

Soluzione tamponata contenente perossido di idrogeno, detergente e sodio azide 0,015 mol/L.

1 x 19,5 mL

Anticorpo primario: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3

MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3

Anti-PD-L1 monoclonale murino (IgG1) in soluzione tamponata, contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/L.

1 x 15 mL

Negative Control Reagent

NEGATIVE CONTROL REAGENT

Anticorpo monoclonale IgG murino di controllo in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/L.

1 x 34,5 mL Mouse LINKER

LINKER, ANTI-MOUSE

Anticorpo secondario di coniglio diretto contro immunoglobuline murine in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/L.

1 x 34,5 mL Visualization Reagent-HRP

VISUALIZATION REAGENT-HRP

Destrano legato a molecole di perossidasi e molecole di anticorpi secondari di capra diretti contro immunoglobuline di coniglio e di topo in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e un agente antimicrobico.

15 x 7,2 mL DAB+ Substrate Buffer

DAB+ SUBSTRATE BUFFER

Soluzione tamponata, contenente perossido di idrogeno e un agente antimicrobico.

1 x 5 mL DAB+ Chromogen

DAB+ CHROMOGEN 3,3’-diaminobenzidina tetraidrocloruro in solvente organico.

1 x 34,5 mL DAB Enhancer

DAB ENHANCER Solfato rameico in acqua.

6 x 30 mL EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x)

EnVision™ FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

Soluzione tamponata, pH 6,1, contenente detergente e un agente microbico.

15 vetrini PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Control Slides

CONTROL SLIDES Ciascun vetrino contiene sezioni di due linee cellulari in pellet fissate in formalina e incluse in paraffina: NCI-H226* con espressione della proteina PD-L1 moderata e MCF-7 negative per l'espressione della proteina PD-L1.

P

D-L

C

1 IH

22C

3 ph

arm

Dx

XX

XX

X

MCF-7: negative per PD-L1

NCI-H226: positive per PD-L1

*Si ringraziano il Dr. AF Gazdar e il Dr. JD Minna dell'NIH per il loro contributo nello sviluppo della linea NCI-H226 (numero ATCC: CRL-5826™) (3).

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Nota: tutti i reagenti inclusi sono formulati in modo specifico per l'utilizzo con questo kit. Per eseguire il test secondo quanto specificato, non è consentito effettuare sostituzioni, ad eccezione di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) (codice K8005). PD-L1 IHC 22C3 pharmDxè stato formulato appositamente per l'uso con Autostainer Link 48. Per ulteriori informazioni, fare riferimento ai manuali utente di Autostainer Link 48 e PT Link.

5. Materiali necessari ma non forniti

PT Link Pre-treatment Module (codice PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (codice AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (codice K8007) Hematoxylin (codice K8008) Acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente) Timer Tessuti positivi e negativi da utilizzare come controlli della procedura (vedere la sezione Controllo di qualità) Vetrini per microscopio: Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020) o vetrini caricati Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini coprioggetto Mezzo di montaggio permanente e reagenti ausiliari richiesti per il montaggio dei vetrini coprioggetto Microscopio ottico (ingrandimento obiettivi 4x–40x)

6. Precauzioni

1) Per uso diagnostico in vitro. 2) Per uso professionale. 3) Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica altamente tossica in forma pura. Sebbene non sia classificato

come prodotto a rischio, il composto NaN3 alle concentrazioni indicate può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento del prodotto, far scorrere abbondante acqua nelle tubature per impedire la formazione di azidi metalliche (4).

4) I reagenti Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker e Visualization Reagent contengono materiale di origine animale. 5) I campioni, prima e dopo la fissazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere manipolati come potenziali vettori di

infezione e smaltiti con le opportune precauzioni (5). 6) Tempi, temperature o metodi di incubazione diversi da quelli specificati possono generare risultati erronei. 7) I reagenti sono stati diluiti nel modo ottimale. L'ulteriore diluizione potrebbe compromettere la colorazione dell'antigene. 8) I reagenti Visualization Reagent, DAB+ Chromogen liquido e la soluzione substrato-cromogeno DAB+ preparata possono subire

alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Non conservare questi componenti del sistema né eseguire la colorazione in condizioni di luce intensa, come ad esempio la luce solare diretta.

9) Residui di paraffina possono produrre risultati falsi negativi. 10) L'uso di volumi dei reagenti diversi da quelli consigliati può comportare la perdita di immunoreattività di PD-L1 visibile. 11) I risultati di un piccolo studio hanno mostrato un intervallo dinamico simile di espressione di PD-L1 in coppie di campioni di NSCLC

primario e metastatico. È possibile che vi siano delle differenze nell'espressione di PD-L1 nei tumori primari rispetto alle sedi metastatiche dello stesso paziente.

12) Sezioni di tessuto di grandi dimensioni possono richiedere 3x150 µL di reagente. 13) Di regola, non è consentito ai minori di 18 anni di lavorare con questo prodotto. È necessario preparare con attenzione gli utenti

sulle corrette procedure di lavoro, le proprietà rischiose del prodotto e le norme di sicurezza necessarie. Fare riferimento alla scheda di sicurezza (SDS) per ulteriori informazioni.

14) Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare il contatto con gli occhi e la cute. 15) La soluzione non utilizzata deve essere smaltita in conformità alle normative locali e nazionali vigenti in materia. 16) Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti.

Pericolo

DAB+ Chromogen: 1-5% di tetracloruro di bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetraammonio H350 Può provocare il cancro. H341 Sospettato di provocare alterazioni genetiche. P201 Procurarsi istruzioni specifiche prima dell’uso. P202 Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze. P280 Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. Indossare indumenti protettivi. P308 + P313 IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: consultare un medico. P405 Conservare sotto chiave. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali.

Avvertenza EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1-5% di acido citrico H319 Provoca grave irritazione agli occhi. H411 Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. P280 Proteggere gli occhi/il viso. P273 Non disperdere nell'ambiente. P264 Lavare accuratamente le mani dopo l'uso. P305 + P351 + P338

IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: risciacquare accuratamente con acqua per alcuni minuti. Se necessario e agevole, rimuovere le lenti a contatto. Continuare a risciacquare.

P337 + P313 Se l'irritazione degli occhi persiste: consultare un medico. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali.

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7. Conservazione

Conservare tutti i componenti di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, inclusi i vetrini di controllo Control Slides, al buio a 2-8 °C quando non in uso su Autostainer Link 48. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sull'esterno della confezione. Nel caso in cui i reagenti vengano conservati diversamente da quanto specificato nel presente foglietto informativo, le condizioni dovranno essere convalidate dall'utente. Non è possibile indicare segni evidenti di instabilità del prodotto, pertanto, è necessario analizzare gli opportuni controlli positivi e negativi contemporaneamente ai campioni dei pazienti.

8. Preparazione dei campioni

I campioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per la colorazione IHC. Utilizzare per tutti i campioni i metodi standard di processazione dei tessuti.

8.1 Sezioni incluse in paraffina

Tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina sono idonei all'uso. L'uso di altri fissativi non è stato convalidato e può produrre risultati erronei. Si raccomanda un tempo di fissazione di 12-72 ore in formalina neutra tamponata al 10%, tuttavia, uno studio con un numero limitato di campioni ha mostrato che un tempo di fissazione compreso tra 4 e 168 ore in NBF 10% non ha alterato in modo sistematico la rilevazione di PD-L1. Un tempo di fissazione ≤3 ore può determinare una variabilità nella rilevazione di PD-L1. I campioni devono essere suddivisi in blocchi dello spessore di 3 o 4 mm, fissati in formalina, deidratati e chiarificati in una serie di alcoli e xilene, quindi infiltrati con paraffina fusa. La temperatura della paraffina non deve superare i 60 °C. I blocchi di tessuto FFPE preparati almeno 5 anni prima possono determinare una perdita di immunoreattività di PD-L1. I campioni tissutali devono essere tagliati in sezioni di 4-5 µm. Dopo il sezionamento, i tessuti devono essere montati su vetrini Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020) o Fisherbrand Superfrost Plus e quindi incubati in forno a 58 ± 2 °C per 1 ora.

8.2 Conservazione consigliata per le sezioni tagliate

Per preservare l'antigenicità, una volta montate sui vetrini, le sezioni tissutali devono essere conservate al buio a 2-8 °C (preferibilmente) o a una temperatura ambiente massima di 25 °C. La temperatura di conservazione e di manipolazione dei vetrini in ogni fase posteriore alla preparazione non dovrà superare i 25 °C per assicurare l'integrità e l'antigenicità dei tessuti.

8.2.1 Conservazione consigliata per le sezioni tissutali di NSCLC tagliate

Le sezioni tagliate devono essere sottoposte a colorazione entro 6 mesi se conservate a 2-8 °C (preferibilmente) o a 25 °C. 8.2.2 Conservazione consigliata per le sezioni tissutali di melanoma tagliate Le sezioni tagliate devono essere sottoposte a colorazione entro 4 mesi se conservate a 2-8 °C (preferibilmente) oppure entro 2 mesi se conservate a 25 °C.

9. Preparazione dei reagenti

Prima della colorazione, è necessario preparare i reagenti indicati di seguito: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) Preparare una quantità sufficiente di Target Retrieval Solution, Low pH, 1x, diluendo la soluzione Target Retrieval Solution, Low pH, 50x 1:50 con acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente). Il pH della soluzione Target Retrieval Solution 1x deve essere 6,1 ± 0,2. Un pH della Target Retrieval Solution 1x inferiore a 5,9 può determinare la produzione di risultati errati. Con una bottiglia da 30 mL di Target Retrieval Solution, Low pH (50x) diluita 1:50 si ottengono 1,5 L di reagente 1x, quantità sufficiente per il riempimento di una tanica di PT Link, che consente di trattare fino a 24 vetrini per utilizzo. Eliminare la soluzione Target Retrieval Solution 1x dopo tre utilizzi e dopo non più di 5 giorni dalla diluizione. Se necessario, sono disponibili quantità aggiuntive di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x), con codice K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Preparare una quantità sufficiente di tampone di lavaggio diluendo Wash Buffer 20x 1:20 con acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente) per le fasi di lavaggio. Conservare la soluzione 1x inutilizzata a 2-8 °C per un periodo massimo di un mese. Eliminare il tampone se appare torbido. Per ulteriori informazioni, fare riferimento al manuale utente del sistema Autostainer Link 48 in uso. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) è disponibile con il codice K8007. Soluzione substrato-cromogeno DAB+ Questa soluzione deve essere accuratamente miscelata prima dell'uso. La formazione di precipitati nella soluzione non influisce sulla qualità della colorazione. Per preparare la soluzione substrato-cromogeno DAB+, aggiungere 1 goccia di DAB+ Chromogen liquido per mL di DAB+ Substrate Buffer e miscelare. La soluzione substrato-cromogeno preparata è stabile per 5 giorni se conservata al buio a 2-8 °C. Note importanti:

Se si utilizza una bottiglia di DAB+ Substrate Buffer intera, aggiungere 9 gocce di DAB+ Chromogen. Sebbene sull'etichetta sia riportata la dicitura 7,2 mL, questa indica il volume utilizzabile e non tiene in considerazione il "volume morto" nella bottiglia. Il colore di DAB+ Chromogen liquido nella bottiglia può variare da trasparente a color lavanda-marrone. Ciò non influisce sulle prestazioni del prodotto. Diluire secondo le linee guida fornite in precedenza. L'aggiunta di un eccesso di DAB+ Chromogen liquido a DAB+ Substrate Buffer causa una riduzione del segnale positivo.

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10. Procedura di colorazione sul sistema Autostainer Link 48

Note sulla procedura Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente le seguenti istruzioni e acquisire dimestichezza con tutti i componenti e lo strumento (vedere la sezione "Precauzioni"). Prima di procedere all'immunocolorazione, tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20-25 °C). Analogamente, tutte le fasi di incubazione devono essere eseguite a temperatura ambiente. Non consentire l'essiccazione delle sezioni tissutali durante la procedura di colorazione. Sezioni tissutali asciutte possono mostrare livelli di colorazione aspecifica superiori. Tutte le fasi e i tempi di incubazione richiesti per la colorazione sono preimpostati nel software Dako Link. Per ulteriori informazioni sulla programmazione dei protocolli e sul caricamento di vetrini e reagenti, fare riferimento ai manuali utente di Autostainer Link 48 e PT Link. Nota: i reagenti e le istruzioni forniti in questo sistema sono stati progettati per l'ottenimento di prestazioni ottimali quando utilizzati con i reagenti e i materiali consigliati. L'ulteriore diluizione dei reagenti o l'uso di tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati possono produrre risultati erronei o discordanti. Protocollo di colorazione Selezionare il protocollo di colorazione PD-L1 IHC 22C3 pharmDx dalle opzioni del menu a discesa Dako Link. Tutte le fasi e i tempi di incubazione richiesti per la colorazione sono preimpostati nell'Autostainer Link 48. Se i protocolli PD-L1 IHC 22C3 pharmDx appropriati non sono disponibili nel server in uso, contattare il rappresentante dell'assistenza tecnica locale per richiederli. Fase 1: Procedura di deparaffinazione, reidratazione e smascheramento antigenico (3-in-1) Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link. Impostare PT Link (codice PT100/PT101/PT200) con il preriscaldamento e il raffreddamento a 65 °C. Impostare il riscaldamento a 97 °C per 20 minuti. ►Riempire le taniche di PT Link con 1,5 L di soluzione di lavoro Target Retrieval Solution, Low pH, 1x, per tanica, per coprire le sezioni

di tessuto. ►Preriscaldare la soluzione Target Retrieval Solution a 65 °C. ►Immergere i rack Autostainer contenenti sezioni tissutali FFPE montate nella soluzione Target Retrieval Solution, Low pH, (soluzione

di lavoro 1x) preriscaldata, all'interno della tanica di PT Link. Incubare per 20 minuti a 97 °C. ►Una volta completata l'incubazione per lo smascheramento antigenico e portata la temperatura a 65 °C, rimuovere ciascun rack dei

vetrini Autostainer dalla tanica di PT Link e collocarlo immediatamente in una vaschetta apposita (ad esempio, PT Link Rinse Station, codice PT109) contenente tampone di lavaggio (codice K8007) diluito e a temperatura ambiente.

►Incubare i vetrini immersi in Wash Buffer diluito e a temperatura ambiente per 5 minuti. Fase 2: Procedura di colorazione Dopo la procedura di deparaffinazione, reidratazione e smascheramento antigenico (3-in-1), i rack Autostainer con i vetrini vengono posizionati in Autostainer Link 48. Lo strumento eseguirà la procedura di colorazione applicando il reagente appropriato, monitorando il tempo di incubazione ed effettuando il lavaggio dei vetrini tra le applicazioni dei reagenti. I tempi di incubazione dei reagenti sono preimpostati nel software Dako Link. Fase 3: Colorazione di contrasto I vetrini devono essere sottoposti a colorazione di contrasto per 5 minuti con Hematoxylin (Link) (codice K8008). Il tempo di incubazione con Hematoxylin è preimpostato nel protocollo. Fase 4: Montaggio È richiesto un mezzo di montaggio permanente e non acquoso. Nota: potrebbe verificarsi una perdita di intensità della colorazione dei vetrini associata a diversi fattori che includono, a titolo esemplificativo ma non limitativo, la colorazione di contrasto, metodi e materiali di montaggio e le condizioni di conservazione. Per ridurre al minimo la perdita di intensità della colorazione, conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente (20-25 °C).

11. Controllo di qualità

I reagenti in PD-L1 IHC 22C3 pharmDx sono stati sottoposti a controllo di qualità tramite immunoistochimica utilizzando le procedure di smascheramento antigenico e colorazione descritte in precedenza. Eventuali variazioni apportate alle procedure consigliate per la fissazione, la processazione e l'inclusione dei tessuti nel laboratorio dell'utente possono produrre una significativa variabilità nei risultati. I controlli di qualità devono essere inclusi in ogni ciclo di colorazione. Tali controlli di qualità sono indicati nella tabella 1 e includono un campione tissutale del paziente con colorazione H&E, tessuti di controllo positivo e negativo forniti dal laboratorio e un vetrino Control Cell Line Slide fornito da Dako (6). Negli Stati Uniti, consultare le linee guida per il controllo della qualità dell'Accreditation Program for Immunohistochemistry del College of American Pathologists (CAP); per ulteriori informazioni, fare riferimento anche al documento del CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (6, 7, 8).

12. Verifica del saggio

Prima del primo utilizzo di un sistema di colorazione in una procedura diagnostica, l'utente deve verificare le prestazioni del saggio su una serie di tessuti forniti dal laboratorio con prestazioni IHC note e che rappresentino tessuti con positività e negatività note. Consultare le procedure di controllo di qualità descritte nella rispettiva sezione sopra riportata. Tali procedure di controllo della qualità devono essere ripetute per ogni nuovo lotto di anticorpo o ogniqualvolta venga apportata una modifica ai parametri del saggio. Opzioni per la risoluzione di potenziali problemi, relative cause e interventi correttivi consigliati sono descritti nella tabella 13.

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13. Interpretazione del punteggio

Per indicazioni sull'interpretazione dei punteggi, fare riferimento alle informazioni specifiche.

13.1 NSCLC

Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del punteggio per PD-L1. Sul vetrino colorato per PD-L1 devono essere presenti un minimo di 100 cellule vitali perché il campione si possa considerare valido per la valutazione di PD-L1. La valutazione dei vetrini deve essere eseguita da un patologo per mezzo di un microscopio ottico. Per la valutazione della colorazione immunoistochimica e del punteggio, è consigliato l'impiego di un obiettivo con ingrandimento di 10-40x. Deve essere inclusa nel punteggio ogni colorazione percepibile delle membrane di cellule tumorali. L'espressione della proteina PD-L1 viene determinata utilizzando il punteggio TPS (Tumor Proportion Score), che rappresenta la percentuale di cellule tumorali vitali che mostrano una colorazione di membrana parziale o totale a qualunque intensità.

Attribuire un punteggio alla colorazione parziale o completa della membrana cellulare (≥ 1+) percepita come distinta dalla colorazione citoplasmatica. La colorazione citoplasmatica deve essere considerata aspecifica ed è esclusa dalla valutazione dell'intensità della colorazione. Le cellule normali e le cellule immunitarie associate al tumore, quali i linfociti o i macrofagi infiltranti, non devono essere inclusi nel punteggio per la determinazione della positività di PD-L1. I campioni di tumore colorati con NCR devono mostrare colorazione specifica 0 e una colorazione di fondo ≤ 1+.

Il campione deve essere considerato con espressione di PD-L1 se per un punteggio TPS delle cellule tumorali vitali ≥ 1% mostra una colorazione della membrana, di qualunque intensità. Il campione deve essere considerato con espressione di PD-L1 elevata se per un punteggio TPS delle cellule tumorali vitali ≥ 50% mostra una colorazione della membrana, di qualunque intensità.

Punteggio TPS (Tumor Proportion Score)

Livelli di espressione di PD-L1

TPS < 1% TPS = 1-49% TPS ≥ 50%

Stato di espressione di PD-L1

Nessuna espressione di PD-L1

Espressione di PD-L1 Espressione di PD-L1 elevata

Gli elementi inclusi e/o esclusi nella determinazione del punteggio TPS (Tumor Proportion Score) sono riportati nelle tabella di seguito.

Elemento Incluso nel punteggio TPS

per NSCLC Escluso dal punteggio TPS per NSCLC

Cellule tumorali

Colorazione parziale o totale significativa della membrana cellulare (di qualsiasi intensità) delle cellule tumorali vitali

Esclusione di qualunque colorazione citoplasmatica

Cellule immunitarie

Non incluse

Esclusione di qualsiasi colorazione delle cellule immunitarie, quali: Cellule infiammatorie mononucleate (grandi linfociti,

monociti, macrofagi polmonari) Plasmacellule Neutrofili

Altro Non incluse

Esclusione di qualsiasi colorazione di: Cellule normali adiacenti a cellule tumorali Cellule stromali (fibroblasti) Cellule necrotiche e/o detriti cellulari Pigmento antracotico

Per ogni ciclo di colorazione, i vetrini devono essere esaminati nell'ordine indicato nella tabella 1 per determinare la validità del ciclo di colorazione e per consentire la valutazione della colorazione del tessuto del campione. Per ulteriori indicazioni, fare riferimento al documento PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual (Manuale per l'interpretazione di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx).

13.2 Melanoma

Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del punteggio per PD-L1. Sul vetrino colorato per PD-L1 devono essere presenti un minimo di 100 cellule vitali perché il campione si possa considerare valido per la valutazione di PD-L1. La valutazione dei vetrini deve essere eseguita da un patologo per mezzo di un microscopio ottico. Per la valutazione della colorazione immunoistochimica e del punteggio, è consigliato l'impiego di un obiettivo con ingrandimento di 10-40x.

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L'espressione della proteina PD-L1 viene determinata utilizzando il punteggio MEL (Melanoma Score), che rappresenta il rapporto di cellule tumorali e cellule immunitarie associate con espressione di PD-L1 di qualunque intensità (colorazione lieve, moderata o forte) rispetto a tutte le cellule tumorali vitali e cellule immunitarie associate positive per PD-L1. Il punteggio MEL viene riportato come segue:

Punteggio MEL

Punteggio MEL 0 Punteggio MEL 1 Punteggio MEL 2 Punteggio MEL 3 Punteggio MEL 4 Punteggio MEL 5

% di cellule colorate

0% < 1% ≥ 1% - < 10% ≥ 10% - < 33% ≥ 33%- < 66% ≥ 66%

Deve essere inclusa nel punteggio MEL la colorazione parziale o totale della membrana delle cellule tumorali. La colorazione citoplasmatica delle cellule tumorali deve essere considerata aspecifica ed è esclusa dalla valutazione dell'intensità della colorazione. Deve essere inclusa nel punteggio MEL la colorazione parziale o totale citoplasmatica e/o della membrana cellulare delle cellule immunitarie associate al tumore. Le cellule immunitarie associate al tumore sono cellule infiammatorie mononucleate che si inseriscono nei nidi tumorali o in prossimità di questi. NOTA: durante l'interpretazione dei campioni dei pazienti affetti da melanoma può essere riscontrata una pigmentazione marrone dovuta alla melanina. L'eventuale presenza di melanina alla linea di base sia nelle cellule tumorali sia nei macrofagi (melanofagi) può rendere difficoltosa l'interpretazione dei risultati. Nell'assegnazione del punteggio alla colorazione della membrana plasmatica, la melanina deve essere esclusa. Si consiglia vivamente di eseguire un confronto del vetrino sottoposto a colorazione di PD-L1 con una sezione sequenziale sottoposta a colorazione con NCR per l'identificazione e l'esclusione di contenuto di melanina. Se un contenuto elevato di melanina impedisce l'assegnazione del punteggio alla colorazione della membrana plasmatica delle cellule tumorali, la valutazione dell'espressione di PD-L1 può rimanere indeterminata. I campioni di tumore colorati con NCR devono mostrare colorazione specifica 0 e una colorazione di fondo ≤1+. Gli elementi inclusi e/o esclusi nella determinazione del punteggio MEL sono riportati nella tabella di seguito.

Elemento Incluso nel punteggio MEL per melanoma Escluso nel punteggio MEL per melanoma

Cellule tumorali Colorazione parziale o totale significativa della membrana cellulare (di qualsiasi intensità) delle cellule tumorali vitali

Esclusione di qualunque colorazione citoplasmatica

Cellule immunitarie

Colorazione della membrana e/o citoplasmatica (di qualsiasi intensità) delle cellule immunitarie o delle cellule infiammatorie mononucleate (MIC) nei nidi tumorali e nello stroma di supporto adiacente (tumorali - infiltranti), quali:

Grandi linfociti (aggregati linfocitari) Monociti

Esclusione di qualsiasi colorazione di: Cellule immunitarie all'interno dello stroma non

correlato ai nidi tumorali Plasmacellule Neutrofili

Altro Non incluse

Esclusione di qualsiasi colorazione di: Cellule normali adiacenti a cellule tumorali Cellule stromali (fibroblasti) Cellule necrotiche e/o detriti cellulari Melanina endogena

Per ogni ciclo di colorazione, i vetrini devono essere esaminati nell'ordine indicato nella tabella 1 per determinare la validità del ciclo di colorazione e per consentire la valutazione della colorazione del tessuto del campione. Per ulteriori indicazioni, fare riferimento al documento PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual (Manuale per l'interpretazione di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx).

14. Valutazione dei vetrini

Tabella 1. Ordine consigliato per la valutazione dei vetrini

Campioni Principio Requisiti

1. H&E (componente fornito dal laboratorio)

Una colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) del campione tissutale viene analizzata per prima per valutare l'istologia e il livello di preservazione del tessuto.

La colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx e quella H&E devono essere eseguite su sezioni seriali provenienti dallo stesso blocco in paraffina del campione. I campioni tissutali devono essere integri, con un buon livello di preservazione e devono confermare l'indicazione del tumore.

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2. Vetrino Control Cell Line Slide (componente fornito da Dako)

Il vetrino Control Cell Line Slide sottoposto a colorazione con l'anticorpo primario contro PD-L1 di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx deve essere esaminato per confermare il corretto funzionamento di tutti i reagenti. Il vetrino Control Cell Line Slide contiene il pellet di una linea cellulare positiva per PD-L1 e il pellet di una linea cellulare negativa per PD-L1.

Un vetrino Control Cell Line Slide deve essere sottoposto a colorazione con Primary Antibody contro PD-L1 in ogni ciclo di colorazione. Criteri di accettazione per NCI-H226 (linea cellulare di controllo positiva per PD-L1): Colorazione della membrana cellulare di una percentuale di cellule ≥ 70%, con un'intensità della colorazione media ≥ 2+. Colorazione aspecifica con intensità < 1+. Criteri di accettazione per MCF-7 (linea cellulare di controllo negativa per PD-L1): Nessuna colorazione specifica. Colorazione aspecifica con intensità < 1+. Tenere presente che nel pellet cellulare MCF-7 occasionalmente è possibile osservare la colorazione di alcune cellule. Si applicano i seguenti criteri di accettazione: la presenza di un totale di cellule con colorazione caratteristica della membrana plasmatica ≤ 10 o una colorazione citoplasmatica con intensità ≥ 1+ entro i bordi del pellet cellulare MCF-7 è considerata accettabile. Se una delle linee cellulari di controllo non soddisfa tali criteri, tutti i risultati relativi ai campioni del paziente devono essere considerati non validi.

3. Vetrini con tessuto di controllo positivo (componente fornito dal laboratorio)

Successivamente devono essere esaminati i vetrini con tessuto di controllo positivo sottoposti a colorazione sia con l'anticorpo primario anti-PD-L1 sia con Negative Control Reagent. Questi vetrini consentono di verificare che il metodo di fissazione e il processo di smascheramento antigenico siano efficaci. I controlli basati su tessuti positivi noti devono essere utilizzati solo per il monitoraggio della correttezza delle prestazioni dei tessuti sottoposti alla procedura e dei reagenti di test e NON come ausilio nella formulazione di una diagnosi specifica dei campioni del paziente.

I controlli devono essere campioni bioptici/chirurgici della stessa indicazione tumorale del campione del paziente, fissati, sottoposti a processazione e inclusi prima possibile con le stesse modalità adottate per i campioni del paziente. Per l'interpretazione dei risultati della colorazione, utilizzare campioni integri poiché cellule necrotiche o deteriorate spesso presentano colorazioni aspecifiche. I tessuti selezionati per l'uso come controlli positivi devono presentare una colorazione positiva da debole a moderata quando sottoposti a colorazione con PD-L1, per consentire la rilevazione di variazioni anche lievi nella sensibilità del saggio. Due vetrini con tessuto di controllo positivo devono essere inclusi in ogni ciclo di colorazione. Vetrino sottoposto a colorazione con PD-L1: si deve riscontrare la presenza di colorazione marrone della membrana plasmatica. La colorazione aspecifica deve essere ≤ 1+. Vetrini sottoposti a colorazione con Negative Control Reagent: nessuna colorazione della membrana. La colorazione aspecifica deve essere ≤ 1+. Se i controlli con tessuto di controllo positivo non presentano la colorazione positiva appropriata, i risultati relativi ai campioni di test devono essere considerati non validi.

4. Vetrini con tessuto di controllo negativo (componente fornito dal laboratorio)

Successivamente devono essere esaminati i vetrini con tessuto di controllo negativo (con negatività per PD-L1 nota) sottoposti a colorazione sia con l'anticorpo primario anti-PD-L1 sia con Negative Control Reagent, per verificare la specificità della marcatura dell'antigene bersaglio con l'anticorpo primario. In alternativa, è possibile usare porzioni di tessuto di controllo positivo come tessuto di controllo negativo, tuttavia ciò deve essere verificato dall'utente.

I controlli devono essere campioni bioptici/chirurgici della stessa indicazione tumorale del campione del paziente, fissati, sottoposti a processazione e inclusi prima possibile con le stesse modalità adottate per i campioni del paziente. Due vetrini con tessuto di controllo negativo devono essere inclusi in ogni ciclo di colorazione. Vetrino sottoposto a colorazione con PD-L1: nessuna colorazione della membrana nelle cellule tumorali. La colorazione aspecifica deve essere ≤ 1+. Vetrini sottoposti a colorazione con Negative Control Reagent: nessuna colorazione della membrana. La colorazione aspecifica deve essere ≤ 1+. Se si osserva una colorazione specifica della membrana cellulare nei vetrini con tessuto di controllo negativo, i risultati relativi ai campioni del paziente devono essere considerati non validi.

5. Tessuto di controllo tonsillare (facoltativo) (componente fornito dal laboratorio)

Utilizzare tessuto tonsillare umano sottoposto a fissazione, processazione e inclusione in modo analogo ai campioni del paziente, come materiale di controllo aggiuntivo per verificare la sensibilità, la specificità e la colorazione aspecifica di fondo del saggio.

Si dovrebbe rilevare una colorazione fortemente positiva in alcune porzioni dell'epitelio criptico e una colorazione da debole a moderata dei macrofagi follicolari nei centri germinativi. Si dovrebbe osservare una colorazione negativa nell'endotelio, nei fibroblasti e nell'epitelio superficiale.

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6. Vetrino del tessuto del paziente sottoposto a colorazione con Negative Control Reagent

Esaminare i campioni del paziente sottoposti a colorazione con il reagente Negative Control Reagent di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Questo reagente viene utilizzato al posto dell'anticorpo primario e fornisce un ausilio nell'interpretazione della colorazione specifica nel sito dell'antigene.

L'assenza della colorazione della membrana cellulare consente di verificare la marcatura specifica dell'antigene bersaglio con l'anticorpo primario. La colorazione aspecifica deve essere ≤ 1+.

7. Vetrino del tessuto del paziente sottoposto a colorazione con l'anticorpo primario anti-PD-L1

Infine, esaminare l'intero vetrino dei campioni del paziente sottoposto a colorazione con l'anticorpo primario anti-PD-L1 di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Per informazioni specifiche sull'immunoreattività di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, fare riferimento alle sezioni Cenni introduttivi, Limiti e Caratteristiche di prestazione.

L'intensità della colorazione positiva deve essere valutata nel contesto della colorazione aspecifica di fondo osservata sul vetrino del paziente trattato con Negative Control Reagent nello stesso ciclo. Come per ogni test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l'antigene non è stato rilevato ma non necessariamente che l'antigene era assente nelle cellule/tessuti analizzati. Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino del paziente sottoposto alla colorazione di PD-L1 devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del punteggio per PD-L1. Nel campione devono essere presenti un minimo di 100 cellule vitali perché questo si possa considerare valido per la valutazione di PD-L1. Fare riferimento alla sezione 13 per le linee guida sull'interpretazione del punteggio nell'espressione di PD-L1.

15. Limiti generali

1) L'immunoistochimica è una tecnica diagnostica multifase che richiede una formazione specifica per quanto riguarda la selezione dei reagenti appropriati, la scelta dei tessuti, la fissazione, la processazione e la preparazione dei vetrini per immunoistochimica nonché l'interpretazione dei risultati della colorazione.

2) La colorazione dei tessuti è correlata alle modalità di manipolazione e processazione del tessuto precedenti alla colorazione. Procedure errate di fissazione, congelamento, scongelamento, lavaggio, asciugatura, riscaldamento e sezionamento oppure la contaminazione con altri tessuti o liquidi possono produrre artefatti, intrappolare l'anticorpo o generare risultati falsi negativi. Risultati incoerenti possono essere dovuti a variazioni nei metodi di fissazione e di inclusione o a irregolarità intrinseche del tessuto.

3) Una colorazione di contrasto eccessiva o incompleta può compromettere la correttezza dell'interpretazione dei risultati. 4) L'interpretazione clinica di qualsiasi colorazione positiva o della sua assenza deve essere effettuata tenendo in considerazione la

presentazione clinica, la morfologia e altri criteri istopatologici. L'interpretazione clinica di una colorazione o della sua assenza deve essere integrata da studi morfologici e da controlli adeguati, nonché da altri test diagnostici. La colorazione deve essere interpretata da un patologo qualificato con un'approfondita conoscenza degli anticorpi, dei reagenti e dei metodi impiegati. La colorazione deve essere eseguita in un laboratorio autorizzato certificato, sotto la supervisione di un patologo, il quale esaminerà i vetrini colorati e garantirà l'adeguatezza dei controlli positivi e negativi.

5) I tessuti delle persone infette dal virus dell'epatite B e contenenti l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) potrebbero evidenziare una colorazione aspecifica con perossidasi di rafano (8).

6) I reagenti possono provocare reazioni impreviste in tipi di tessuto che non sono mai stati analizzati prima. Non si può escludere completamente la possibilità di reazioni impreviste anche in tipi di tessuto già analizzati in precedenza, a causa della variabilità biologica dell'espressione antigenica nelle neoplasie o in altri tessuti patologici. Si invita a documentare le reazioni impreviste e a comunicarle all'Assistenza tecnica Dako.

7) È possibile che vengano generati risultati falsi positivi a causa del legame non immunologico di proteine o prodotti di reazione con il substrato. Risultati falsi positivi possono essere causati anche dall'attività della pseudoperossidasi (eritrociti) e dall'attività della perossidasi endogena (citocromo C) (8).

8) I reagenti e le istruzioni forniti in questo sistema sono stati concepiti per l'ottenimento di prestazioni ottimali. L'ulteriore diluizione dei reagenti o l'uso di tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati possono produrre risultati erronei o discordanti.

16. Limitazioni specifiche del prodotto

1) Il deterioramento dell'antigene nel tessuto, nel tempo, può provocare risultati falsi-negativi. Per la colorazione dei campioni, attenersi alle indicazioni relative alla conservazione delle sezioni tagliate (fare riferimento alla sezione 8.2).

2) Per garantire risultati ottimali e riproducibili, la proteina PD-L1 richiede un pretrattamento di smascheramento antigenico quando i tessuti sono fissati come di routine (in formalina tamponata neutra) e inclusi in paraffina.

3) Non sostituire i reagenti con reagenti di numeri di lotto diversi di questo prodotto o di kit di altri produttori. L'unica eccezione è rappresentata da EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x) che, se necessario, è disponibile con il codice K8005.

4) Le linee cellulari di controllo sottoposte a colorazione devono essere utilizzate esclusivamente per la convalida del ciclo di colorazione e non devono essere utilizzate per l'assegnazione del punteggio alla reazione di colorazione nelle sezioni tissutali.

5) L'uso di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx su tessuti trattati con fissativi diversi dalla formalina non è stato convalidato. 6) L'uso di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx su agoaspirati non è stato convalidato. 7) L'uso di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx su tessuti decalcificati non è stato convalidato e non è consigliato.

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17. Valutazione delle prestazioni

17.1 Valutazione delle prestazioni non cliniche: tessuti normali e neoplastici

Tessuti normali: la tabella 2 fornisce un quadro dell'immunoreattività dell'anticorpo Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 relativamente a tessuti normali selezionati. È stata osservata colorazione della membrana plasmatica sulle cellule immunitarie e di origine epiteliale. È stata osservata colorazione citoplasmatica in alcuni tipi di cellule ma non è stata registrata come colorazione positiva. Tutti i tessuti analizzati sono stati fissati in formalina e inclusi in paraffina e successivamente colorati con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, secondo le istruzioni riportate nel presente foglietto informativo. Non sono stati riscontrati risultati inattesi nei tipi di cellule e di tessuti analizzati. La colorazione osservata è risultata compatibile con la letteratura disponibile per l'espressione IHC di PD-L1 nei tessuti normali (9, 10). Tabella 2: Reattività dei tessuti normali a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Tipo di tessuto (q.tà testata)

Colorazione positiva della membrana plasmatica: elementi del tessuto

Colorazione positiva citoplasmatica: elementi del tessuto

Colorazione aspecifica

Cellule mesoteliali (2) 0/2 0/2 0/2 Cerebrum (3) 0/3 0/3 0/3 Cervelletto (3) 0/3 0/3 0/3 Cervice (3) 1/3 epitelio 0/3 0/3 Colon (3) 2/3 macrofagi 0/3 0/3 Cute (3) 0/3 0/3 0/3 Esofago (3) 0/3 0/3 0/3 Fegato (3) 1/3 macrofagi

1/3 epatociti 0/3 0/3

Ghiandola salivare (3) 0/3 0/3 0/3 Intestino tenue (3) 0/3 0/3 0/3 Ipofisi (3) 1/3 ipofisi anteriore

1/3 ipofisi posteriore 1/3 ipofisi anteriore 1/3 ipofisi posteriore

0/3

Mammella (3) 0/3 0/3 0/3 Midollo osseo (3) 3/3 megacariociti 3/3 megacariociti 0/3 Milza (3) 2/3 macrofagi 0/3 0/3 Muscolo, cardiaco (3) 0/3 0/3 0/3 Muscolo, scheletrico (3) 0/2 0/2 0/2 Nervo, periferico (3) 0/3 1/3 tessuto connettivo/vasi 0/3 Ovaio (3) 0/3 0/3 0/3 Pancreas (3) 0/3 0/3 0/3 Paratiroide (3) 1/3 epitelio ghiandolare 0/3 0/3 Polmone (3) 3/3 macrofagi alveolari 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 epitelio 0/2 0/2 Rene (3) 1/3 epitelio tubulare 0/3 0/3 Stomaco (3) 2/3 linfociti

1/3 ghiandole gastriche 1/3 ghiandole gastriche 0/3

Surrene (3) 0/3 1/3 cellule della midollare 0/3 Testicolo (3) 0/3 0/3 0/3 Timo (3) 3/3 epitelio midollare 0/3 0/3 Tiroide (3) 0/3 0/3 0/3 Tonsilla (3) 3/3 epitelio criptico

2/3 centro germinale (macrofagi) 0/3 0/3

Utero (3) 0/3 0/3 0/3

Tessuti neoplastici: la tabella 3 fornisce un quadro dell'immunoreattività dell'anticorpo Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 relativamente a tessuti neoplastici. È stata osservata colorazione della membrana plasmatica sulle cellule immunitarie e di origine epiteliale. È stata osservata colorazione citoplasmatica in alcuni tipi di cellule ma non è stata registrata come colorazione positiva. Tutti i tessuti analizzati sono stati fissati in formalina e inclusi in paraffina e successivamente colorati con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, secondo le istruzioni riportate nel presente foglietto informativo. Non sono stati riscontrati risultati inattesi nei campioni tumorali analizzati. La colorazione osservata è risultata compatibile con la letteratura disponibile per l'espressione IHC di PD-L1 nei tessuti neoplastici (9-12). Tabella 3: Reattività dei tessuti neoplastici a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Tipo di tumore Posizione Positivi per PD-L1/totale (N=159)

Appendice 0/1 Cervice, tipo endocervicale 0/1 Cistifellea 1/5 Colon 0/5 Colon, metastatico al fegato 0/1 Colon, mucinoso 0/1 Esofago 0/1 Ghiandola salivare/parotide 0/2 GI, metastatico al polmone 0/1 Intestino tenue 0/2 Mammella, DCIS 0/2 Mammella, duttale invasivo 0/7 Mammella, duttale invasivo metastatico ai linfonodi

0/1

Adenocarcinoma

Ovaio 0/1

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Tipo di tumore Posizione Positivi per PD-L1/totale (N=159)

Ovaio, endometrioide 0/1 Ovaio, mucinoso 0/1 Ovaio, sieroso 0/1 Pancreas 0/2 Pancreas, duttale 0/3 Polmone 1/4 Prostata 0/5 Retto 0/4 Stomaco 0/6 Stomaco, mucinoso 0/1 Testa e collo, palato duro 0/1 Tiroide, follicolare 0/1 Tiroide, follicolo-papillare 0/1 Tiroide, papillare 0/3 Utero, a cellule chiare 0/1 Utero, endometrio 0/3

Astrocitoma Cervello 0/3 Carcinoma Nasofaringeo, NPC 0/1

Carcinoma a cellule ad anello con castone del colon metastatico all'ovaio

0/1

Colon 0/1 Carcinoma a cellule ad anello con castone

Rene 0/1 Carcinoma a cellule di transizione Vescica 0/6

Carcinoma a cellule squamose esofageo metastatico al linfonodo

0/1

Cervice 2/5 Cute 0/2 Esofago 0/7 Polmone 1/2 Testa e collo 0/2

Carcinoma a cellule squamose

Utero 0/1 Carcinoma a piccole cellule Polmone 0/1 Carcinoma adrenocorticale Surrenale 0/1 Carcinoma delle cellule basali Cute 0/1 Carcinoma delle cellule renali Cellule chiare Rene 0/6 Papillare Rene 0/1 Carcinoma embrionale Testicolo 0/1 Carcinoma epatocellulare Fegato 0/5 Carcinoma midollare Tiroide 0/1 Condrosarcoma Osso 0/1 Cordoma Cavità pelvica 0/1 Epatoblastoma Fegato 0/1 Ependimoma Cervello 0/1 Feocromocitoma Surrenale 0/1 Glioblastoma Cervello 0/1

Tessuto molle, parete toracica 0/1 Leiomiosarcoma

Vescica 0/1 Linfoma Anaplastico a grandi cellule Linfonodo 0/1 Diffuso a cellule B Linfonodo 0/4 Hodgkin Linfonodo 2/2 Non-Hodgkin Linfonodo 1/1 Medulloblastoma Cervello 0/1

Cavità nasale 0/1 Melanoma

Retto 0/1 Meningioma Cervello 0/2 Mesotelioma Peritoneo 0/1 Neuroblastoma Retroperitoneo 0/1 Neurofibroma Tessuto molle, lombare 0/1 Osteosarcoma Osso 0/2

Prostata 0/1 Retroperitoneo 0/1 Rabdomiosarcoma Tessuto molle, embrionale 0/1

Sarcoma sinoviale Cavità pelvica 0/1

Seminoma Testicolo 0/2

Spermatocitoma Testicolo 0/2 Timoma Mediastino 1/1 Tumore delle cellule insulari Pancreas 0/1

Colon 0/1 Intestino tenue 0/1 Tumore interstiziale Retto 0/1

Tumore neuroectodermico primitivo (PNET)

Retroperitoneo 0/1

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17.2 Valutazione delle prestazioni cliniche: NSCLC

KEYNOTE-024: Controlled trial of NSCLC patients naïve to treatment (Studio controllato su pazienti affetti da NSCLC non trattati in precedenza) La sicurezza e l'efficacia di pembrolizumab sono state analizzate nello studio multicentrico controllato KEYNOTE-024 sul trattamento di pazienti affetti da NSCLC metastatico e non trattati in precedenza. I pazienti presentavano un'espressione di PD-L1 con punteggio TPS (Tumor Proportion Score) ≥ 50% in base a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (14). I pazienti sono stati randomizzati (1:1) in modo da ricevere una dose di 200 mg di pembrolizumab ogni 3 settimane (n=154) o chemioterapia contenente platino a scelta del ricercatore (n=151), quale pemetrexed+carboplatino, pemetrexed+cisplatino, gemcitabina+cisplatino, gemcitabina+carboplatino o paclitaxel+carboplatino. I pazienti affetti da tumore non squamoso potevano essere sottoposti a terapia di mantenimento con pemetrexed. I pazienti sono stati trattati con pembrolizumab fino a livelli di tossicità inaccettabili o alla progressione della malattia. Il trattamento poteva essere proseguito anche oltre la progressione della malattia se il paziente risultava clinicamente stabile e il ricercatore riteneva che ottenesse un beneficio clinico. Sono stati esclusi dallo studio i pazienti che presentavano aberrazioni genomiche tumorali di EGFR o ALK, malattie autoimmuni che richiedevano una terapia sistemica entro 2 anni dal trattamento, una condizione medica che richiedeva immunosoppressione o che avevano ricevuto più di 30 Gy di radiazioni al torace nelle 26 settimane precedenti. La valutazione dello stato del tumore è stata effettuata ogni 9 settimane. È stato possibile trasferire al trattamento con pembrolizumab i pazienti sottoposti a chemioterapia che manifestavano una progressione della malattia verificata in modo indipendente. I 305 pazienti inclusi nello studio KEYNOTE-024 presentavano le seguenti caratteristiche di riferimento: età mediana di 65 anni (il 54% aveva un'età di 65 anni o più), 61% maschi, 82% bianchi e 15% asiatici, con stato delle prestazioni ECOG 0 e 1 rispettivamente nel 35% e nel 65% dei casi. Le caratteristiche della malattia erano: tumore squamoso (18%) e non squamoso (82%), M1 (99%) e metastasi cerebrali (9%). La misura principale dell'efficacia era data dalla sopravvivenza libera da progressione (PFS, Progression-Free Survival), determinata tramite una revisione centrale indipendente in cieco (BICR, Blinded Independent Central Review) secondo la versione 1.1 dei criteri di valutazione della risposta nei tumori solidi (RECIST, Response Evaluation Criteria on Solid Tumors). La misura secondaria dell'efficacia era data dalla sopravvivenza totale (OS, Overall Survival) e dal tasso di risposta oggettiva (ORR, Objective Response Rate), valutati tramite BICR applicando i criteri RECIST 1.1. La tabella 4 riassume gli endpoint principali di efficacia nell'intera popolazione ITT (Intention to Treat). Tabella 4: Risultati sull'efficacia ottenuti nello studio KEYNOTE-024

Endpoint KEYTRUDA

200 mg ogni 3 settimane n=154

Chemioterapia n=151

PFS* Numero (%) di pazienti con evento 73 (47%) 116 (77%) Rapporto di rischio† (IC 95%) 0,50 (0,37, 0,68) --- Valore P‡ < 0,001 --- Mediana in mesi (IC 95%) 10,3 (6,7, N/D) 6,0 (4,2, 6,2) OS Numero (%) di pazienti con evento 44 (29%) 64 (42%) Rapporto di rischio† (IC 95%) 0,60 (0,41, 0,89) --- Valore P‡ 0,005 --- Mediana in mesi (IC 95%) Non raggiunta

(N/D, N/D) Non raggiunta (9,4, N/D)

Tasso di risposta oggettiva* ORR % (IC 95%) 45% (37, 53) 28% (21, 36) % di risposta completa 4% 1% % di risposta parziale 41% 27% Durata della risposta§ Mediana in mesi (intervallo) Non raggiunta

(1,9+, 14,5+) 6,3 (2,1+, 12,6+)

% con durata ≥ 6 mesi 88%¶ 59%#

* Valutato mediante revisione centrale indipendente in cieco (BICR), utilizzando i criteri RECIST 1.1 † Rapporto di rischio (confronto tra KEYTRUDA e chemioterapia) basato sul modello dei rischi proporzionali di Cox

stratificato ‡ Basato sul test dei ranghi logaritmici stratificato § In base ai pazienti con risposta completa o parziale confermata come miglior risposta complessiva ¶ In base alle stime di Kaplan-Meier; include 43 pazienti con risposta di 6 mesi o superiore # In base alle stime di Kaplan-Meier; include 16 pazienti con risposta di 6 mesi o superiore N/D = Non disponibile

Figura 1: Curva di Kaplan-Meier per la sopravvivenza totale nello studio KEYNOTE-024

0 3 6 9 12 15 18 21

Time in Months

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ove

rall

Sur

viva

l (%

)S

opra

vviv

enza

tota

le (

%)

Treatment armKEYTRUDAChemotherapy

154 136 121 82 39 11 2 0

151 123 106 64 34 7 1 0

isk

EYTRUDA:

rapy:

TrattamentoKEYTRUDA Chemioterapia

Tempo in mesi Number at R

K

Chemothe

Numero a rischio A

erapia

KEYTRUD Chemiot

KEYNOTE-010: Controlled trial of NSCLC patients previously treated with chemotherapy (Studio controllato su pazienti affetti da NSCLC e precedentemente trattati con chemioterapia) Il beneficio clinico di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è stato esaminato nello studio clinico multicentrico randomizzato in aperto KEYNOTE-010, condotto per valutare la sicurezza e l'efficacia di KEYTRUDA in pazienti affetti da NSCLC in stadio avanzato e precedentemente sottoposti a chemioterapia contenente platino (15). I pazienti presentavano un'espressione di PD-L1 con punteggio TPS ≥ 1% in base a una versione CTA (Clinical Trial Assay, saggio dello studio clinico) di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. I pazienti con mutazione attivante di EGFR o traslocazione di ALK presentavano anche una progressione della malattia in seguito alla somministrazione della terapia approvata per tali mutazioni, prima di ricevere il pembrolizumab. I pazienti sono stati randomizzati (1:1:1) in modo da ricevere una dose di 2 (n=344) o 10 mg/kg (n=346) di pembrolizumab ogni 3 settimane oppure una dose di 75 mg/m2 di docetaxel ogni 3 settimane (n=343) fino alla progressione della malattia o a livelli di tossicità inaccettabili. Sono stati esclusi dallo studio i pazienti che presentavano malattie autoimmuni, una condizione medica che richiedeva immunosoppressione o che avevano ricevuto più di 30 Gy di radiazioni al torace nelle 26 settimane precedenti. La valutazione dello stato del tumore è stata effettuata ogni 9 settimane. La misura principale dell'efficacia era data dalla sopravvivenza totale (OS) e dalla sopravvivenza libera da progressione (PFS) valutate tramite BICR applicando i criteri RECIST 1.1. Sulla base del CTA, nello studio sono stati randomizzati in totale 1.033 pazienti affetti da NSCLC. Per valutare l'utilità clinica di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, alcuni campioni archiviati da studi clinici sono stati analizzati retrospettivamente con questo saggio presso un laboratorio di riferimento negli Stati Uniti. Sono stati analizzati retrospettivamente i tessuti tumorali di 529 pazienti su 1.033 utilizzando il saggio PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. I campioni di 413 pazienti presentavano espressione di PD-L1 (≥ 1% delle cellule tumorali vitali mostrava colorazione della membrana a una qualunque intensità), mentre i campioni di 94 pazienti non mostravano alcuna espressione di PD-L1 (< 1% delle cellule tumorali vitali mostrava colorazione della membrana a qualunque intensità). Tra questi 413 pazienti con espressione di PD-L1, i campioni provenienti da 163 pazienti presentavano un'espressione elevata di PD-L1 (≥ 50% delle cellule tumorali vitali mostrava colorazione della membrana a qualunque intensità). Il livello di concordanza raggiunto tra il CTA e PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è mostrato nella tabella 5.

Tabella 5: Concordanza tra CTA e PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Tassi di concordanza PD-L1 Cut-off

Percentuale di concordanza negativa (intervallo di confidenza (IC) al 95%)

Percentuale di concordanza positiva (intervallo di confidenza (IC) al 95%)

TPS ≥ 1% 94,5% [91,4%-96,6%] 80,0% [76,9%-82,8%] CTA rispetto a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx TPS ≥ 50% 98,3% [97,1%-99,0%] 73,2% [67,9%-77,9%]

Tra i pazienti randomizzati con espressione di PD-L1 in base al saggio PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, le caratteristiche demografiche e le altre caratteristiche di base erano ben bilanciate tra i bracci di trattamento. L'età mediana era di 63 anni (44% di 65 anni di età o più). La maggior parte dei pazienti era bianca (77%) e di sesso maschile (58%); lo stato delle prestazioni ECOG alla linea di base era 0 (29%) o 1 (71%). Il 78% dei pazienti era stato o era fumatore. Il 22% dei pazienti presentava istologia squamosa e il 69% non squamosa. Le caratteristiche basali e demografiche erano parimenti ben bilanciate nei bracci pembrolizumab e docetaxel nella popolazione generale dello studio clinico. I risultati sull'efficacia sono riassunti nelle tabelle 6 e 7. KEYTRUDA ha dimostrato di apportare benefici clinici di lunga durata nei pazienti affetti da NSCLC con espressione di PD-L1 (TPS ≥ 1%), che risultavano amplificati nei pazienti con espressione di PD-L1 elevata (TPS ≥ 50%), come determinato mediante PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. L'entità del beneficio era paragonabile a quella osservata nella popolazione generale dello studio clinico. Le tabelle che seguono riassumono gli endpoint principali di efficacia nell'intera popolazione con espressione di PD-L1 (TPS ≥ 1%) e nel sottoinsieme con espressione di PD-L1 elevata (TPS ≥ 50%) per la popolazione generale dello studio clinico (TPS ≥ 1% mediante CTA) e nella popolazione con espressione di PD-L1 in base a

P03928IT_05/SK00621-2/2017.02 p. 14/20

P03928IT_05/SK00621-2/2017.02 p. 15/20

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. La curva di Kaplan-Meier per l'OS (TPS ≥ 1%), determinata in base a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è illustrata nella figura 2. I risultati sull'efficacia ottenuti per i bracci che utilizzavano 2 mg/kg e 10 mg/kg di KEYTRUDA sono simili. Tabella 6: Risposta a KEYTRUDA in pazienti affetti da NSCLC e trattati in precedenza: popolazione generale dello studio clinico e pazienti positivi in base a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx: TPS PD-L1 ≥ 1%

Endpoint KEYTRUDA 2 mg/kg ogni 3 settimane

KEYTRUDA 10 mg/kg ogni 3 settimane

Docetaxel 75 mg/m2 ogni 3 settimane

Studio clinico PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Studio clinico

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Studio clinico

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Numero di pazienti 344 140 346 142 343 131 OS Decessi (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Rapporto di rischio* (IC 95%)

0,71 (0,58, 0,88)

0,54 (0,37, 0,78)

0,61 (0,49, 0,75)

0,57 (0,39, 0,82)

--- ---

Valore P† < 0,001 < 0,001 < 0,001 0,00115 --- --- Mediana in mesi (IC 95%)

10,4 (9,4, 11,9)

11,8 (9,6, N/D)

12,7 (10,0, 17,3)

12,0 (8,7, N/D)

8,5 (7,5, 9,8)

7,5 (6,3, 9,9)

PFS‡ Eventi (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Rapporto di rischio* (IC 95%)

0,88 (0,73, 1,04)

0,68 (0,50, 0,92)

0,79 (0,66, 0,94)

0,79 (0,59, 1,06)

--- ---

Valore P† 0,068 0,00578 0,005 0,05767 --- --- Mediana in mesi (IC 95%)

3,9 (3,1, 4,1)

4,9 (4,1, 6,2)

4,0 (2,6, 4,3)

4,0 (2,2, 4,6)

4,0 (3,1, 4,2)

3,8 (2,2, 4,2)

Tasso di risposta complessiva‡

ORR %§ (IC 95%) 18% (14, 23)

24% (17, 32)

18% (15, 23)

20% (14, 28)

9% (7, 13)

5% (2, 11)

* Rapporto di rischio (KEYTRUDA in confronto a docetaxel) basato sul modello dei rischi proporzionali di Cox stratificato † Basato sul test dei ranghi logaritmici stratificato ‡ Valutato mediante revisione centrale indipendente in cieco (BICR), utilizzando i criteri RECIST 1.1 § Tutte le risposte erano risposte parziali

Tabella 7: Risposta a KEYTRUDA in pazienti affetti da NSCLC e trattati in precedenza: popolazione generale dello studio clinico e pazienti positivi in base a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx: TPS PD-L1 50%

Endpoint KEYTRUDA 2 mg/kg ogni 3 settimane

KEYTRUDA 10 mg/kg ogni 3 settimane

Docetaxel 75 mg/m2 ogni 3 settimane

Studio clinico PD-L1 IHC 22C3 pharmDx



Numero di pazienti 139 56 151 60 152 47

OS

Decessi (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%)

Rapporto di rischio* (IC 95%)

0,54 (0,38, 0,77)

0,45 (0,24, 0,84)

0,50 (0,36, 0,70)

0,29 (0,15, 0,56)

--- ---

Valore P† <0,001 0,00541 <0,001 <0,001 --- ---

Mediana in mesi (IC 95%)

14,9 (10,4, N/D)

Non raggiunta (9,3, N/D)

17,3 (11,8, N/D)

Non raggiunta (8,3, N/D)

8,2 (6,4, 10,7)

7,2 (4,4, 8,3)

PFS‡

Eventi (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%)

Rapporto di rischio* (IC 95%)

0,58 (0,43, 0,77)

0,47 (0,28, 0,80)

0,59 (0,45, 0,78)

0,41 (0,24, 0,70)

--- ---

Valore P† < 0,001 0,00221 < 0,001 < 0,001 --- ---

Mediana in mesi (IC 95%)

5,2 (4,0, 6,5)

5,9 (4,2, 9,0)

5,2 (4,1, 8,1)

4,8 (2,8, N/D)

4,1 (3,6, 4,3)

3,9 (2,0, 4,3)

Tasso di risposta complessiva‡

ORR %§ (IC 95%) 30% (23, 39)

37% (25, 52)

29% (22, 37)

28% (18, 41)

8% (4, 13)

4% (1, 15)

* Rapporto di rischio (KEYTRUDA in confronto a docetaxel) basato sul modello dei rischi proporzionali di Cox stratificato † Basato sul test dei ranghi logaritmici stratificato ‡ Valutato mediante revisione centrale indipendente in cieco (BICR), utilizzando i criteri RECIST 1.1 § Tutte le risposte erano risposte parziali

Figura 2: Curva di Kaplan-Meier per la sopravvivenza totale per braccio di trattamento (TPS ≥ 1% in base a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, popolazione Intent To Treat)

Sop

ravv

iven

za t

otal

e (%

) Sop

ravv

iven

za t

otal

e (%

)

Docetaxel 75 mg/m2 Q3W MK-3475 2 mg/kg Q3W MK-3475 10 mg/kg Q3W

Docetaxel 75 mg/m2 Q3W MK-3475 2 mg/kg Q3W MK-3475 10 mg/kg Q3W

Sono state condotte analisi aggiuntive di affidabilità per tenere in considerazione l'impatto potenziale di dati mancanti dovuti alla presenza di pazienti con espressione di PD-L1 (TPS ≥ 1%) in base a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, ma che risultavano privi di espressione di PD-L1 (TPS < 1%) in base al CTA. I pazienti che presentano tali risultati fanno parte della popolazione destinataria/Intent To Diagnose (ITD) di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, ma sono stati esclusi dallo studio clinico perché non presentavano espressione di PD-L1 in base allo screening CTA. Per tenere conto di questi dati mancanti, è stata condotta un'analisi di sensibilità per capire quale fosse l'intervallo plausibile per il rapporto di rischio (HR) stimato sulla base di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx nelle sottopopolazioni con TPS ≥ 1% e TPS ≥ 50% in un contesto ITD per verificare la coerenza con l'HR osservato in base all'arruolamento con il CTA. I risultati dell'analisi di sensibilità dell'HR hanno mostrato che le stime dell'HR sono affidabili anche tenendo conto di ipotetiche attenuazioni dell'effetto del trattamento in un contesto ITD.

17.3 Valutazione delle prestazioni non cliniche: NSCLC

Sensibilità/specificità analitica: NSCLC La sensibilità analitica di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è stata valutata su 127 casi unici di campioni FFPE di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) negli stadi da I a IV utilizzando un lotto di produzione industriale. La valutazione dell'espressione di PD-L1 ha evidenziato una colorazione in un intervallo dallo 0 al 100% di cellule tumorali positive e un'intensità di colorazione compresa tra 0 e 3.

Precisione: NSCLC La precisione di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx su campioni di NSCLC è stata valutata presso Dako. I dati delle prestazioni sono forniti nelle tabelle 8 e 9. Per gli studi sulla precisione condotti presso Dako, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa (NPA)/media di concordanza negativa (ANA), la percentuale di concordanza positiva (PPA)/media di concordanza positiva (APA) e la concordanza totale (OA) per i cut-off ≥ 1% e ≥ 50%, come mostrato nelle tabelle 8 e 9. Gli studi sulla precisione sono stati valutati utilizzando un metodo bootstrap a percentili, al fine di calcolare gli intervalli di confidenza per le concordanze medie. Per gli studi che hanno mostrato una concordanza del 100%, gli intervalli di confidenza sono stati calcolati con il metodo del punteggio di Wilson, in base al numero di confronti a coppie indipendenti (gradi di libertà effettivi). Tabella 8: Precisione di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in un sito (≥ 1%)

Studio sulla precisione Cut-off diagnostico Disegno dello studio % di concordanza (IC 95%)

Inter-strumento

≥ 1% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato su ciascuno di sei strumenti Autostainer Link 48.

NPA 100% (94,0-100%) PPA 100% (94,0-100%) OA 100% (96,9-100%)

Inter-operatore

≥ 1% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato da sei analisti sul medesimo strumento Autostainer Link 48.

NPA 100% (93,9-100%) PPA 100% (94,0-100%) OA 100% (96,9-100%)

Inter-giorno

≥ 1% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei giorni non consecutivi sullo strumento Autostainer Link 48.

NPA 100% (94,0-100%) PPA 100% (94,0-100%) OA 100% (96,9-100%)

n a rischio Docetaxel 75 mg/m2 Q3W

131 MK-3475 2 mg/kg Q3W

140 MK-3475 10 mg/kg Q3W

142

n a rischio Docetaxel 75 mg/m2 Q3W

131 MK-3475 2 mg/kg Q3W

140 MK-3475 10 mg/kg Q3W

142

Tempo in mesiTempo in mesi

P03928IT_05/SK00621-2/2017.02 p. 16/20

P03928IT_05/SK00621-2/2017.02 p. 17/20


Inter-lotto ≥ 1% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (13 PD-L1 negativi e 11 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in tre repliche e con ciascuno di tre lotti di reagenti sullo strumento Autostainer Link 48.

ANA 98,3% (95,9-100%) APA 97,9% (94,6-100%) OA 98,1% (95,3-100%)

Intra-ciclo (ripetibilità) ≥ 1% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei repliche all'interno di uno stesso ciclo sullo strumento Autostainer Link 48.

NPA 100% (94,0-100%) PPA 100% (93,8-100%) OA 100% (96,8-100%)

NPA=percentuale di concordanza negativa; PPA=percentuale di concordanza positiva; OA=concordanza totale ANA=media di concordanza negativa; APA=media di concordanza positiva Tabella 9: Precisione di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in un sito (≥ 50%)


Inter-strumento

≥ 50% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato su ciascuno di sei strumenti Autostainer Link 48.

NPA 100% (94,9-100%) PPA 100% (94,9-100%) OA 100% (97,4-100%)

Inter-operatore

≥ 50% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato da sei analisti sul medesimo strumento Autostainer Link 48.

ANA 94,0% (89,3-98,6%) APA 93,1% (85,8-98,6%) OA 93,6% (87,8-98,6%)

Inter-giorno

≥ 50% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei giorni non consecutivi sullo strumento Autostainer Link 48.

NPA 100% (94,9-100%) PPA 100% (94,9-100%) OA 100% (97,4-100%)

Inter-lotto ≥ 50% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in tre repliche e con ciascuno di tre lotti di reagenti sullo strumento Autostainer Link 48.

ANA 93,3% (88,5-97,1%) APA 93,7% (88,7-97,4%) OA 93,5% (88,9-97,2%)

Intra-ciclo (ripetibilità) ≥ 50% Ciascuno di 24 campioni di NSCLC (12 PD-L1 negativi e 12 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei repliche all'interno di uno stesso ciclo sullo strumento Autostainer Link 48.

NPA 100% (94,0-100%) PPA 100% (95,6-100%) OA 100% (97,4-100%)

NPA=percentuale di concordanza negativa; PPA=percentuale di concordanza positiva; OA=concordanza totale ANA=media di concordanza negativa; APA=media di concordanza positiva; OA=concordanza totale

Riproducibilità esterna: NSCLC La riproducibilità di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è stata valutata in tre siti di analisi esterni. I dati sulle prestazioni sono riportati nelle tabelle 10 e 11. Per gli studi di riproducibilità, sono state determinate la media della percentuale di concordanza negativa (ANA), la media della percentuale di concordanza positiva (APA) e la percentuale di concordanza totale (OA) per i cut-off ≥1% e ≥50%, come mostrato nella tabella 10 e nella tabella 11. Sono state calcolate le medie delle concordanze in quanto non esiste alcun riferimento naturale per i parametri di riproducibilità quali il centro e l'osservatore. Gli intervalli di confidenza per le medie delle concordanze sono state calcolate utilizzando un metodo bootstrap a percentili. Tabella 10: Riproducibilità di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in tre siti esterni (≥ 1%)

Studio di riproducibilità Cut-off diagnostico Disegno dello studio % di concordanza (IC 95%)

Inter-sito ≥ 1% Ciascuno di 36 campioni di NSCLC (16 PD-L1 negativi e 20 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque giorni non consecutivi. L'analisi inter-sito è stata eseguita tra tre siti su un totale di 2700 confronti a coppie.

ANA 94,8% (90,3-98,4%) APA 95,5% (91,2-98,7%) OA 95,2% (90,8-98,6%)

Intra-sito ≥ 1% Ciascuno di 36 campioni di NSCLC (16 PD-L1 negativi e 20 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque giorni non consecutivi in ciascuno di tre siti dello studio. L'analisi intra-sito è stata eseguita per tre siti su un totale di 1080 confronti a coppie.

ANA 96,2% (94,1-97,5%) APA 96,7% (95,0-97,9%) OA 96,5% (95,2-97,4%)

Inter-osservatore ≥ 1% Il punteggio relativo a 62 campioni di NSCLC (28 PD-L1 negativi e 34 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi inter-osservatore è stata eseguita tra tre siti su un totale di 1674 confronti a coppie.

ANA 85,8% (79,3-91,8%) APA 88,2% (82,2-93,3%) OA 87,1% (81,0-92,6%)

P03928IT_05/SK00621-2/2017.02 p. 18/20

Intra-osservatore ≥ 1% Il punteggio relativo a 62 campioni di NSCLC (28 PD-L1 negativi e 34 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi intra-osservatore è stata eseguita per tre siti su un totale di 558 confronti a coppie.

ANA 93,7% (90,0-96,1%) APA 94,8% (91,6-96,7%) OA 94,3% (92,0-95,9%)

ANA=media di concordanza negativa; APA=media di concordanza positiva; OA=concordanza totale Tabella 11: Riproducibilità di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in tre siti esterni (≥ 50%)

Studio di riproducibilità Cut-off diagnostico Disegno dello studio % di concordanza (IC 95%)

Inter-sito ≥ 50% Ciascuno di 36 campioni di NSCLC (21 PD-L1 negativi e 15 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque giorni non consecutivi. L'analisi inter-sito è stata eseguita tra tre siti su un totale di 2700 confronti a coppie.

ANA 90,3% (84,4-95,2%) APA 85,2% (75,6-92,9%) OA 88,3% (81,4-94,3%)

Intra-sito ≥ 50% Ciascuno di 36 campioni di NSCLC (21 PD-L1 negativi e 15 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque giorni non consecutivi in ciascuno di tre siti dello studio. L'analisi intra-sito è stata eseguita per tre siti su un totale di 1080 confronti a coppie.

ANA 91,9% (88,8-94,8%) APA 87,6% (82,5-92,2%) OA 90,2% (86,3-93,7%)

Inter-osservatore ≥ 50% Il punteggio relativo a 62 campioni di NSCLC (30 PD-L1 negativi e 32 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi inter-osservatore è stata eseguita tra tre siti su un totale di 1674 confronti a coppie.

ANA 92,6% (87,8-96,7%) APA 92,8% (88,1-96,8%) OA 92,7% (88,1-96,8%)

Intra-osservatore ≥ 50% Il punteggio relativo a 62 campioni di NSCLC (30 PD-L1 negativi e 32 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi intra-osservatore è stata eseguita per tre siti su un totale di 558 confronti a coppie.

ANA 96,4% (94,0-98,5%) APA 96,5% (94,3-98,6%) OA 96,4% (94,3-98,6%)

ANA=media di concordanza negativa; APA=media di concordanza positiva; OA=concordanza totale

17.4 Valutazione delle prestazioni non cliniche: melanoma

Sensibilità analitica: melanoma La sensibilità analitica di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx è stata analizzata su 137 casi unici di campioni FFPE di melanoma utilizzando un lotto di produzione industriale. La valutazione dell'espressione di PD-L1 ha evidenziato una colorazione in un intervallo dinamico di cellule tumorali e immunitarie e un'intensità di colorazione compresa tra 0 e 3. Precisione: melanoma La precisione di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx su campioni di melanoma è stata valutata presso Dako. Sono state determinate la percentuale di concordanza negativa (NPA)/media di concordanza negativa (ANA), la percentuale di concordanza positiva (PPA)/media di concordanza positiva (APA) e la concordanza totale (OA) per i l'espressione di PD-L1 ≥ 1% (punteggio MEL ≥ 2) come mostrato nella tabella 12. Gli studi sulla precisione sono stati valutati utilizzando un metodo bootstrap a percentili, al fine di calcolare gli intervalli di confidenza per le concordanze medie. Per gli studi che hanno mostrato una concordanza del 100%, gli intervalli di confidenza sono stati calcolati con il metodo del punteggio di Wilson, in base al numero di confronti a coppie indipendenti (gradi di libertà effettivi). Tabella 12: Precisione di PD-L1 IHC 22C3 pharmDx valutata in un sito (punteggio MEL ≥ 2( ≥ 1%))

Studio sulla precisione

Punteggio MEL

Espressione di PD-L1

Disegno dello studio % di concordanza (IC 95%)

Inter-strumento

≥ 2

≥ 1% Ciascuno di 16 campioni di melanoma (7 PD-L1 negativi e 9 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato su ciascuno di sei strumenti Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,6-100%) PPA 100% (93,4-100%) OA 100% (96,2-100%)

Inter-operatore

≥ 2 ≥ 1% Ciascuno di 16 campioni di melanoma (7 PD-L1 negativi e 9 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato da sei analisti sul medesimo strumento Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,6-100%) PPA 100% (93,4-100%) OA 100% (96,2-100%)

Inter-giorno

≥ 2 ≥ 1% Ciascuno di 16 campioni di melanoma (7 PD-L1 negativi e 9 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei giorni non consecutivi sullo strumento Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,6-100%) PPA 100% (93,4-100%) OA 100% (96,2-100%)

Inter-lotto ≥ 2 ≥ 1% Ciascuno di 16 campioni di melanoma (7 PD-L1 negativi e 9 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in tre repliche e con ciascuno di tre lotti di reagenti sullo strumento Autostainer Link 48.

ANA 97,0% (92,3-100%) APA 97,4% (93,5-100%) OA 97,2% (93,1-100%)

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Studio sulla precisione

Punteggio MEL

Espressione di PD-L1

Disegno dello studio % di concordanza (IC 95%)

Intra-ciclo ≥ 2 ≥ 1% Ciascuno di 16 campioni di melanoma (7 PD-L1 negativi e 9 PD-L1 positivi) con vari livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in sei repliche all'interno di uno stesso ciclo sullo strumento Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,6-100%) PPA 100% (93,4-100%) OA 100% (96,2-100%)

Inter-osservatore

≥ 2 ≥ 1% Il punteggio relativo a 48 campioni di melanoma (18 PD-L1 negativi e 30 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato fornito da tre patologi, in tre giorni non consecutivi.

ANA 87,7% (79,3-94,7%) APA 91,8% (85,4-96,7%) OA 90,1% (83,1-95,8%)

Intra-osservatore

≥ 2 ≥ 1% Il punteggio relativo a 48 campioni di melanoma (22 PD-L1 negativi e 26 PD-L1 positivi) con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, è stato fornito da tre patologi, in tre giorni non consecutivi.

ANA 89,9% (82,9-95,7%) APA 90,7% (83,3-96,2%) OA 90,3% (83,3-95,8%)

NPA=percentuale di concordanza negativa; PPA=percentuale di concordanza positiva; OA=concordanza totale ANA=media di concordanza negativa; APA=media di concordanza positiva; OA=concordanza totale

18. Risoluzione dei problemi

Sezione 13: Risoluzione dei problemi Problema Possibile causa Intervento consigliato

1a. Errore di programmazione.

1a. Verificare che il programma PD-L1 IHC 22C3 pharmDx sia stato selezionato per la programmazione dei vetrini.

1b. Assenza di reazione con la soluzione substrato-cromogeno DAB+ (DAB)

1b. Verificare che la soluzione substrato-cromogeno DAB+ sia stata preparata in modo corretto.

1c. Sodio azide in tampone di lavaggio. 1c. Utilizzare esclusivamente Dako Wash Buffer (codice K8007).

1. Nessuna colorazione dei vetrini

1d. Deterioramento del vetrino Control Slide

1d. Controllare la data di scadenza e le condizioni di conservazione del kit sull'esterno della confezione.

2a. Colorazione debole dei vetrini con i campioni.

2a. Utilizzo di un metodo di fissazione non appropriato.

2a. Assicurarsi che vengano utilizzati solo fissativi e metodi di fissazione approvati.

2b. Colorazione debole dei vetrini dei campioni o della linea cellulare positiva sul vetrino Control Slide fornito da Dako.

2b. Smascheramento antigenico inadeguato.

2b. Verificare che la procedura di pretrattamento 3-in-1 sia stata eseguita correttamente.

3a. Paraffina rimossa in modo incompleto.

3a. Verificare che la procedura di pretrattamento 3-in-1 sia stata eseguita correttamente.

3b. Essiccazione dei vetrini durante il caricamento su Autostainer Link 48.

3b. Assicurarsi che i vetrini siano sempre bagnati con il tampone durante il caricamento e prima di iniziare il ciclo.

3. Colorazione di fondo dei vetrini eccessiva.

3c. Legame aspecifico dei reagenti alla sezione di tessuto.

3c. Verificare che la fissazione del campione sia appropriata e/o valutare l'eventuale presenza di necrosi.

4a. Utilizzo di vetrini per microscopio non appropriati.

4. Utilizzare Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020) o vetrini caricati (come Fisherbrand Superfrost Plus).

4. Distacco del tessuto dai vetrini.

4b. Preparazione inadeguata dei campioni

4b. Le sezioni tagliate devono essere collocate in un forno a 58 ± 2°C per 1 ora prima della colorazione.

5a. Utilizzo di un metodo di fissazione non appropriato.

5a. Assicurarsi che vengano utilizzati solo fissativi e metodi di fissazione approvati.

5. Colorazione specifica del vetrino eccessivamente intensa.

5b. Utilizzo di tampone di lavaggio non appropriato.

5b. Utilizzare esclusivamente Dako Wash Buffer (codice K8007).

6. La soluzione Target Retrieval Solution appare torbida quando riscaldata.

6. Quando riscaldata, la soluzione Target Retrieval Solution assume un aspetto torbido.

6. Ciò è normale e non influenza la colorazione.

NOTA: se il problema non è imputabile a nessuna delle cause sopracitate o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare l'Assistenza tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti. Ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla preparazione dei campioni sono disponibili nel documento di Dako "Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods" (Manuale di formazione: metodi di colorazione istochimica) (6) (fornito da Dako).

19. Bibliografia

1. Keytruda® package insert. 2. Daud A, , Wolchok J, Robert C, Hwu WJ, Weber J, Ribas A, et al. Programmed Death-Ligand 1 Expression and Response to

the Anti-Programmed Death 1 Antibody Pembrolizumab in Melanoma. Journal of Clinical Oncology (jco.ascopubs.org) 2016 Oct 11.

3. Phelps R, Johnson B, Ihde D, Gazdar A, Carbone D, McClintock P, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1996) 24:32-91.

4. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976.

5. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000.

6. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.

7. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999.

8. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626.

9. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. 10. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on

Dendritic Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003;170:1257. 11. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic

factor in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. 12. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and

Virus-Associated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473. 13. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell

lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28. 14. Reck, M, et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1–Positive Non–Small-Cell Lung Cancer (KEYNOTE-024). The

New England Journal of Medicine (NJEM.org) 2016 Oct 09; 1-11. 15. Herbst RS, Baas P, Kim DW, Felip E, Perez-Garcia J, Han JY, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated,

PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet online; 2015 Dec 19.

Edizione 2/17

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