PROGETTO“POR SICILIA 2000/2006”

1999.IT.16.1.PO.011/4.17b/8.3.7/0056

Università degli Studi di Palermo C.I.R.I.T.A.

PRESENTAZIONE DEI RISULTATI FINALI DEL PROGETTO

“Studio della struttura genetica e demografica di Parapenaeus longirostris (gambero rosa) per il

monitoraggio e la realizzazione di piani di gestione delle risorse ittiche”

Il progetto è stato condotto in collaborazione con la Provincia Regionale di Palermo che ha svolto funzioni di capofila e il C.I.R.I.T.A. (Centro Interdipartimentale di Ricerche sulla Interazione Tecnologie-Ambiente) dell’ Università di Palermo che ha effettuato l’attività di ricerca.

Hanno collaborato:

Prof. Marco Arculeo (responsabile scientifico)

Dr.ssa Maria Concetta Alessi

Dr.ssa Sabrina Lo Brutto

Dr.ssa Teresa Maggio

Dr.ssa Rosalia Pellerito

Dr.ssa Mariagrazia Benfante

Sig.na Ornella Marullo

Sigg. Giovanni e Francesco Zizzo

LA RICERCA E’ STATA ARTICOLATA IN TRE DIFFERENTI LINEE

BIOMETRIA E BIOLOGIA

Analisi delle distribuzioni di taglia e del ciclo riproduttivo attraverso dati di sbarco

CATTURE

Analisi dei rendimenti di pesca attraverso dati di sbarco

GENETICA

Analisi della variazione genetica attraverso marker molecolari: 1) DNA mitocondriale(regione D-loop); 2) DNA genomico(AFLP)

METODOLOGIE

Biometria Ciclo riproduttivo Catture Genetica

b) Peso ponderale di ogni individuo. Bilancia tecnica con approssimazione dello 0,1 gr

a) Lunghezza del carapace (cefalotorace) in mm misurato a partire dal margine anteriore dell’ orbita al margine posteriore del cefalotorace (L C)

METODOLOGIADATI BIOMETRICI Attraverso:

a) Incisione del tratto dorsale del primo segmento addominale dell'animale per visualizzare le gonadi

b) Identificazione dello stadio di maturità gonadico secondo la colorazione della gonade

METODOLOGIAMATURITA’ GONADICA Attraverso:

METODOLOGIAINDICE

GONADOSOMATICO (IGS)

Il rapporto tra il peso gonadico (PG) ed il peso corporeo (PC), indice gonadosomatico (IGS), (PG/PC-PG)*100 - fornisce un’espressione quantitativa e, pertanto, non soggettiva dello stato di maturità sessuale nei crostacei.

Peso umido della gonade con approssimazione dello 0,001 gr utilizzando una bilancia analitica.

TECNICA PCRLa PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica di amplificazione che usa specifici oligonucleotidi per amplificare molte migliaia di volte uno specifico segmento di DNA con una procedura automatizzata. Tali oligonucleotidi, detti primers, vengono fatti sinteticamente; essi fiancheggiano il segmento di DNA e permettono l’aggancio di una speciale DNA polimerasi, resistente al calore, chiamata Taq polimerasi, che non fa altro che copiare ripetutamente il segmento. Ogni copia fatta servirà nuovamente da templato per la duplicazione successiva, in questo modo il numero di copie della sequenza target crescerà esponenzialmente. La reazione prevede essenzialmente tre passaggi: denaturazione del DNA, associazione dei primers ed estensione dei primers ad opera della taqpolimerasi .

PCR

METODOLOGIAANALISI GENETICA

Dna mitocondrialeIn azzurro viene evidenziata la porzione non codificante della regione di controllo (D-loop) utilizzantanella ricerca.

Gel d’agarosio 1% nel quale è visualizzato il Dna estratto da alcuni individui.

Migrazione in gel d’agarosio 2% e TBE 1 X di alcuni prodotti di amplificazione della regione di controllo.

DNA mitocondriale -regione di controllo (D-loop)

AFLP (Amplified FragmentLenght Polimorphism)

Questa tecnica è basata sulla combinazione di due fasi: la digestione del DNA genomico con due enzimi di restrizione e l’amplificazione selettiva dei frammenti ottenuti mediante la digestione con l’ausilio di primerspecifici complementari alla sequenza di taglio.

Nello specifico la tecnica consiste delle seguenti fasi:1) Digestione del DNA genomico con una coppia di enzimi di restrizione (Eco RI, Taq I, Mse I, etc);2) Ligazione di specifiche sequenze oligonucleotidiche chiamate adattatori ai frammenti ottenuti;3) Pre Amplificazione tramite PCR con primer specifici che legano gli adattatori;PCR selettiva con primer selettivi;4) Analisi dei frammenti al sequenzatoreautomatico. Schema esemplificativo delle fasi della tecnica degli AFLP

Gel d’agarosio al 2% che visualizza la fase della Ligazione. E’ evidente uno smear che corrisponde ai frammenti ottenuti dalla restrizione

Gel d’agarosio al 2% che visualizza i frammenti con la PCR selettiva. Sono evidenti dei frammenti ottenuti dalla PCR come bande che verranno successivamente analizzate al sequenziatore automatico

AFLP (Amplified FragmentLenght Polimorphism)

RISULTATI

BiometriaCiclo riproduttivo Catture Genetica

Progressione delle mode mensili (modello Von Bertallangy growth function). Femmine - Porticello

Progressione delle mode mensili (modello Von Bertallangy growth function). Femmine Terrasini

RISULTATI

Biometriasoftware FISAT II

Dimensioni femmine: a) Porticello tra 8 e 38 mm LCb) Terrasini tra 9 e 36 mm LC

Progressione delle mode mensili (modello Von Bertallangy growth function). Maschi - Porticello

Progressione delle mode mensili (modello Von Bertallangy growth function). Maschi -Terrasini

RISULTATIBiometria

software FISAT II

Dimensioni maschi: a) Porticello tra 13 e 29 mm LCb) Terrasini tra 13 e 31 mm LC

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

%L (mm)

Porticello

Terrasini

Distribuzione totale delle frequenze di taglia (LC) Maschi -Porticello vs Terrasini

0

2

4

6

8

10

12

14

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

%

L (mm)

Porticello

Terrasini

Distribuzione totale delle frequenze di taglia (LC) Femmine -Porticello vs Terrasini

RISULTATI - Biometria

I motopesca della marineria di Porticellocatturano individui di minori dimensioni rispetto a quelli di Terrasini

Scomposizione delle mode annuali (metodo Battacharya). Individui totali- Porticello (mode: 11.9; 21.6 e 27.7 mm di LC)

Scomposizione delle mode annuali (metodo Battacharya). Individui totali – Terrasini (mode: 12.0, 21.5 e 27.5 mm di LC)

RISULTATI - Biometria

Le lunghezze del Carapace (LC) sono state utilizzate per la scomposizione delle mode attraverso il software FISAT II

Sono stati identificati i seguenti stadi di maturità gonadica:

STADIO I – Gonade trasparente

STADIO II – Gonade beige

STADIO III – Gonade verde chiaro

STADIO IV – Gonade verde scuro

RISULTATI

CICLO RIPRODUTTIVO

Foto in alto: individui stadio III (sn) e IV (dx)

Foto in basso: individui stadio IV, II e III

Distribuzione percentuale mensile dei 4 stadi di maturità sessuale per mese e per marineria

RISULTATICICLO RIPRODUTTIVO

I grafici evidenziano che questa specie si riproduce quasi tutto l’anno.

Porticello

0

1

2

3

4

5

6

7

Estate Autunno Inverno Primavera

IG

1

2

3

4

Indice godanosomatico(IGS) medio per stagione e per stadio di maturità sessuale in entrambe le marinerie.

Terrasini

0

12

34

5

67

89

10

Estate Autunno Inverno Primavera

IG

1

2

3

4

RISULTATICICLO RIPRODUTTIVO

In entrambe le marinerie lo stadio IV, corrispondente alla emissione delle uova, raggiunge valori massimi di IGS nelle stagioni invernali e primaverili.

0

50

100

150

200

250

300

350

MAGGIO

'06

GIUGNO '0

6LUGLIO

'06

AGOSTO '06

SETTEMBRE '0

6OTTOBRE '0

6

NOVEMBRE '0

6DIC

EMBRE '0

6GENNAIO

'07

FEBBRAIO '0

7M

ARZO '07

APRILE '0

7

kg

Porticello

Terrasini

Sbarchi medi mensili (in kg): Poticello vs Terrasini

RISULTATI - CATTURE

Catture medie giornaliere per barca/mese e rendimenti orari medi (ROM) – Porticello - I quantitativi medi mensili sbarcati sono risultati compresi tra 235 kg (giugno) e 15 kg (ottobre). I ROM sono compresi tra 1 e 5 kg/h.

RISULTATI - CATTURE

Catture medie giornaliere per barca/mese e rendimenti orari orari medi (ROM) –Terrasini - I quantitativi medi mensili sbarcati sono risultati compresi tra 150 kg (giugno) e 21,5 kg (gennaio). I ROM sono compresi tra 1 e 4 kg/h.

Porticello

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Mag

gio'0

6Giu

gno'0

6Lugl

io'0

6Ago

sto'0

6Set

tem

bre'0

6Otto

bre'0

6Nove

mbre

'06

Dicem

bre'0

6Gen

naio'0

7Feb

braio

'07

Mar

zo'0

7April

e'07

Cattura mensile

Terrasini

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Mag

gio'0

6Giu

gno'06

Luglio'0

6Ago

sto'0

6Set

tem

bre'0

6Otto

bre'0

6Nove

mbre

'06

Dicem

bre'0

6Gen

naio'0

7Feb

braio

'07

Mar

zo'0

7April

e'07

Cattura mensile

RISULTATI - CATTURE

Le catture totali mensili considerate come numero di giorni uscite/mese sono risultate comprese tra 350 e 3.300 kg a Terrasini e tra 225 e 5.170 kg a Porticello

Cromatogramma - Il sequenziatore automatico dà come risultato il cromatogramma(vedi figura) e la lettura della sequenza di basi del tratto di DNA amplificato – Ai nucleotidi viene legato un marcatore fluorescente, in maniera da associare ogni base ad un colore.

Risultati – DNA mitocondriale (D-loop)

Allineamento Regione di controllo (D-Loop) di Parapeneus longirostris (siti variabili)1111111 1111111112 2222222222 2222222222 222222233]

111 1111112222 2333333334 4444455556 7990011344 5556778891 1234455566 6667777778 889999900]1236789013 4567890167 9123567890 1236801579 5241224409 1247790990 2053547812 4680235892 372368946]

P1 ggcacatgtc taccctatct ctgcctgaac aactg-tcag acgaacagcc gcggaaggct ccggagcaca tcatagcagt agattgctcP3 t........t .......... .......... .....-.... .......... .......... ....g..... .......... .........P6 t......... .......... .......-.. .-...-.... .......... .......... .......... .......... .........P7 t......... .......... .......... ---..-.... .......... .......... ....g..... ........t. .........P1 .......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .........P1 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .........P8 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .........P9 t.tc.....t ....t..ct. ...ttg.... ...g.-g.c. .......... .......... ....ga.-.c ..c...g.a. .....a.g.p11 t.t......t .......... ...tt..... .....-g... .......... .......... ......-..c ....g.g... g....a...P12 ttg...a..t ........g. ...gt..... .....-.... .......... .......... ....g..t.c ....g...a. g....c...P16 t......... .......... .......... .....-.... .......... ...a...... ....g..... .......... .........P18 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .........P20 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... ........t. .........P2 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .........P15 t......... ....a..... .......... .....-.... .......... ...a...... ....g..... .......... .........t3 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... ....g..... .......... .........T4 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .........T5 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... t......... .......... .........t12 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... t...g..... .......... .........T13 t......... .......... ......cctt tc...-.... .......... .......... t...g..... .......... .........T17 t.tca..t.t .c.....ct. a.attg..c. .....-.... .......... .......... .......-.c c.cc.ag.aa .a..ca.g.T18 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .........T22 t.tc...t.t .c..t..ct. ...ttg.... ..t..-.... .......... .......... .......-.c ..c...g.a. g....a.g.T10 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .....t...T19 t......... .......... .......... .....-.... .......... .......... .......... .......... .........

Allineamento di alcune sequenze della Regione di controllo (D-Loop) – Si riportano soltanto i siti variabili

Risultati – DNA mitocondriale (D-loop)

Iindici di diversità genetica di P. longirostris.

Numero Diversità Diversità

Aplotipi Aplotipica Nucleotidica

Sicilia 17 0.903 0.029

Terrasini 8 0.935 0.035

Porticello 10 0.895 0.028

Risultati – DNA mitocondriale (D-loop)

L’amplificazione della regione di controllo ha prodotto un frammento di 307 bp. L’allineamento e l’analisi delle sequenze ha permesso l’identificazione di 49 mutazioni di cui 41 siti variabili e 24 siti informativi. Il numero totale di aplotipi è stato h = 17.

Il calcolo degli indici di diversità genetica globale hanno dato i seguenti valori: diversità aplotipicaHd = 0,903, mentre per la diversità nucleotidica P = 0,029.La divergenza nucleotidica media sui due campioni analizzati (Porticello e Terrasini) è risultata pari al 2,7%. il numero di aplotipi è compreso fra 10 e 8

Risultati – DNA mitocondriale (D-loop)

Analisi dei siti polimorfici

Numero Numero Numero

Di mutazioni

Di siti variabili

Di siti informativi

Sicilia 49/307 41/307 24/307

Terrasini 38/307 36/307 18/307

Porticello 32/307 26/307 14/307

L’analisi delle sequenze per ogni popolazione ha mostrato un numero di siti variabili compreso fra 36 (Terrasini) e 26 (Porticello), mentre i siti informativi sono stati 18 (Terrasini) e 14 (Porticello).La distanza nucleotidica media calcolata con il metodo di Kimura-2-parametri, tra i campioni provenienti dai due siti è pari a 2.8 %.

I risultati ottenuti mostrano una maggiore differenziazione dei campioni provenienti dal sito di Terrasini, anche se questa differenziazione non sembra essere supportata dalla presenza di una strutturazione genetica, come dimostrato dalla non significatività dell’indice di fissazione Fst nell’analisi della varianza molecolare AMOVA.

Elettroferogrammi ottenuti con le quattro coppie di primer selettivi in cinque individui di P. longirostris. Ogni picco mostrato in figura corrisponde ad un allele e/o frammento.

COMBINAZIONI DI PRIMER SELETTIVE PER P. longirostrisEco RI AAA / TaqI AGG (A)Eco RI AAA / TaqI ATG (C)Eco RI ATT / TaqI AGG (R) Eco RI ATT / TaqI ATG (T)

Risultati – AFLP (Amplified Fragment Lenght Polimorphism)

L’eterozigosità media all’interno dei due campioni è di 0.194 per Porticello e 0.248 per Terrasini. La percentuale di loci polimorfici media tra campioni è pari a81.51% (Porticello 78.77% e Terrasini 84.25%). La distanza genetica tra i campioni calcolata secondo l’indice di Nei è 0.072. L’Analisi della VarianzaMolecolare (AMOVA) ha messo in evidenza che la maggior parte della variazione genetica risiede all’interno delle popolazioni (95%) piuttosto che tra le popolazioni.

I due campioni (Terrasini e Porticello) sono stati analizzati utilizzando la coppia di primer selettivi Eco RI AAA / TaqI ATG. Nei campioni analizzati sono stati evidenziati 146 frammenti variabili.

Risultati – AFLP (Amplified Fragment Lenght Polimorphism)

CONCLUSIONI

- I dati ottenuti sulla biometria e la maturazione sessuale di Parapenaeuslongirostris non si discostano in maniera significativa da quelli riscontrati in altri settori del Mediterraneo.

CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE ED OBIETTIVI RAGGIUNTI

- I dati relativi alle frequenze di taglia hanno mostrato una lieve differenza tra le due marinerie mostrando che i motopesca di Porticello catturano individui di dimensioni (8 mm di LC) inferiori rispetto a quelli di Terrasini. Anche se in Italia non esistono particolari normative sulla taglia minima di cattura, bisogna segnalare che, per le acque della Sardegna, è in vigore una normativa che stabilisce in 20 mm di LC la taglia minima di cattura (Decreto Assessore Difesa Ambiente n. 412 del 10/5/95).

- I quantitativi catturati, intesi come rendimenti orari medi, risultano bassi anche se questi non hanno mostrato sensibili variazioni tra le due marinerie e con alcune ricerche condotte nell’ultimo ventennio nelle stesse aree.

- L’area studiata, per le sue peculiarità biologiche ed oceanografiche, se razionalmente sfruttata potrebbe mantenere e garantire, nel tempo, una attività con standard socio-economici di buon livello rispetto anche alle altre marinerie regionali e nazionali.

- Dai dati sulle catture possono emergere alcune indicazioni di tipo gestionale che dovranno tener conto della dimensione della maglia del sacco, delle aree sottoposte a sfruttamento e del numero di motopesca che si dedicano quasi esclusivamente alla cattura di questa specie.

- Nessuno studio finalizzato all’analisi della struttura di popolazione con marcatori molecolari è stato fatto fino ad oggi. Le sequenze ottenute del D-Loop (regione del DNA mitocondriale) saranno depositate nella banca mondiale del genoma (GenBank).

- Riconoscendo che l’obiettivo principale della gestione delle risorse di pesca è il loro uso sostenibile, le Amministrazioni locali dovrebbero adottare misure appropriate basate su dati scientifici che evidenziano la necessità di provvedimenti a breve ed a lungo termine allo scopo di garantire livelli ottimali di cattura.

- Questo studio rappresenta un primo passo per la creazione di una banca dati per il monitoraggio dello stock di gambero rosa al fine di comprendere e verificare, nel tempo, eventuali cambiamenti sulla distribuzione, biologia, dinamica e sulla struttura genetica.

- I dati genetici non hanno messo in evidenza alcuna differenza tra le aree di campionamento esaminate indicando che esiste una unica unità popolazionaleo stock o pool genico di gambero rosa. Quindi, in termini gestionali, bisognerà adottare politiche di programmazione e/o di gestione uguali nelle due marinerie.

- La realizzazione di una banca dati, estensibile a tutte le aree siciliane, risulta indispensabile e di fondamentale importanza per la creazione di un sistema di monitoraggio delle risorse di pesca a patto che le Amministrazioni locali garantiscano il costante aggiornamento affinché possano rispondere al meglio a tutte le “sollecitazioni” provenienti dal comparto pesca.