ANALISI AUTOMATICA DI MARCATORI GENETICI ANALISI AUTOMATICA DI MARCATORI GENETICI

POLIMORFICI DEL DNA (STR,SNP) POLIMORFICI DEL DNA (STR,SNP)

E SUE APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICOE SUE APPLICAZIONI IN CAMPO BIOMEDICO

Laboratorio di Oncoematologia Pediatrica (BO)Dott.ssa Virginia Libri

MARCATORE GENETICOMARCATORE GENETICO

Qualsiasi carattere polimorfico mendeliano che Qualsiasi carattere polimorfico mendeliano che

può essere impiegato per seguire l’ereditarietà può essere impiegato per seguire l’ereditarietà

di un segmento cromosomico attraverso un di un segmento cromosomico attraverso un

albero genealogicoalbero genealogico

POLIMORFISMOPOLIMORFISMO

I polimorfismi genetici sono I polimorfismi genetici sono variazionivariazioni nelle nelle

sequenze di DNA presenti in una popolazione sequenze di DNA presenti in una popolazione

con una con una frequenza maggiore dell’1%frequenza maggiore dell’1%. Quando la . Quando la

frequenzafrequenza e' e' inferioreinferiore a tale valore arbitrario, si a tale valore arbitrario, si

preferisce parlare di preferisce parlare di varianti genetiche rarevarianti genetiche rare, che , che

in molti loci sono presenti in aggiunta ai in molti loci sono presenti in aggiunta ai

polimorfismi. polimorfismi.

RFLPRFLP

La regione del genoma di La regione del genoma di interesse viene interesse viene amplificata tramite PCR e amplificata tramite PCR e i prodotti ottenuti i prodotti ottenuti vengono incubati con un vengono incubati con un enzima di restrizione in enzima di restrizione in grado di riconoscere una grado di riconoscere una sequenza specifica e di sequenza specifica e di catalizzare una reazione catalizzare una reazione di taglio al suo internodi taglio al suo interno

I primi marcatori molecolari ad essere studiati furono I primi marcatori molecolari ad essere studiati furono gli gli RFLPRFLP ((RRestriction estriction FFragment ragment LLenght enght PPolymorphism):particolari tratti di DNA presenti olymorphism):particolari tratti di DNA presenti nella popolazione e trasmessi in modo ereditarionella popolazione e trasmessi in modo ereditario

RFLP: Gel di ElettroforesiRFLP: Gel di Elettroforesi Mediante elettroforesi su gel di agarosio si è in grado di Mediante elettroforesi su gel di agarosio si è in grado di

determinare se il frammento amplificato è stato tagliato determinare se il frammento amplificato è stato tagliato o meno, cioè se la sequenza specifica riconosciuta o meno, cioè se la sequenza specifica riconosciuta dall’enzima è presente inalterata oppure nodall’enzima è presente inalterata oppure no

DirezioneDirezionedi di MigrationeMigratione

DirezioneDirezionedi di MigrationeMigratione

I I frammentiframmentipiù grandi più grandi migrano migrano più più lentamente lentamente rispetto a rispetto a quelli più quelli più corticorti

RFLPRFLP

I frammenti possono avere I frammenti possono avere

lunghezza diversa nei lunghezza diversa nei

diversi individui ma anche diversi individui ma anche

tra i due cromosomi di uno tra i due cromosomi di uno

stesso individuo, ciò è stesso individuo, ciò è

possibile se tra due siti di possibile se tra due siti di

restrizione è presente una restrizione è presente una

sequenza che può variare sequenza che può variare

in lunghezza (VNTR)in lunghezza (VNTR)o se o se

esiste una variante esiste una variante

polimorfa che introduce o polimorfa che introduce o

elimina un altro sito di elimina un altro sito di

restrizione per lo stesso restrizione per lo stesso

enzima modificando la enzima modificando la

grandezza dei frammenti grandezza dei frammenti

ottenuti per digestione.ottenuti per digestione.

Considerazioni sulla metodicaConsiderazioni sulla metodica Uno svantaggio di questo tipo di marcatori è dato dalla Uno svantaggio di questo tipo di marcatori è dato dalla

loro bassa informativitàloro bassa informatività

Infatti gli RFLP presentano solo due alleli possibili: il sito Infatti gli RFLP presentano solo due alleli possibili: il sito di restrizione può essere intatto oppure nodi restrizione può essere intatto oppure no

L’impiego di questi marcatori per eseguire la mappa L’impiego di questi marcatori per eseguire la mappa genetica di patologie è poco attuabile in quanto troppo genetica di patologie è poco attuabile in quanto troppo spesso delle meiosi chiave in una famiglia risultano non spesso delle meiosi chiave in una famiglia risultano non informativeinformative

Occorre un pedigree completo con entrambi genitori e un Occorre un pedigree completo con entrambi genitori e un precedente figlioprecedente figlio

Occorre trovare un enzima di restrizione che nel genitore Occorre trovare un enzima di restrizione che nel genitore affetto frammenti il DNA in modo tale da creare una affetto frammenti il DNA in modo tale da creare una situazione di eterozigosisituazione di eterozigosi

The human genomeThe human genome

10100%0%

30%30%

IntersperdIntersperdrepetitiverepetitive

SINEs(<500b

p) LINEs(>500b

p)

Gene/gene related sequencesGene/gene related sequences Extragenic DNAExtragenic DNA

Coding regionsCoding regions

7070%%

Introns,promoter,Introns,promoter,Pseudogenes,gene fragmentsPseudogenes,gene fragments

3%3%

2727%%

UniqueUnique

5555%%

RepetitiveRepetitive

15%15%

TandemlyTandemlyrepeatedrepeatedSatelliteSatellite

MicrosatelliteMicrosatelliteMinisatelliteMinisatellite

TelomericTelomeric HypervariableHypervariable

Sequenzial breakdown of the genome into component DNA typesSequenzial breakdown of the genome into component DNA types (Bennett P: (Bennett P: Demystified...Microsatellites. Demystified...Microsatellites. J Clin Pathol:Mol Pathol 2000,53:177-183)J Clin Pathol:Mol Pathol 2000,53:177-183)

DNA ripetitivo interspersoDNA ripetitivo intersperso

Le singole unità ripetute non sono raggruppate ma Le singole unità ripetute non sono raggruppate ma sparsesparse in più punti del genoma. Gli esempi più comuni in più punti del genoma. Gli esempi più comuni sono le sequenze sono le sequenze SINEs SINEs ((SShort hort IInterspersed nterspersed NNuclear uclear EElement) e lement) e LINEs LINEs ((LLong ong IInterspersed nterspersed NNuclear uclear EElement)lement)

LINEsLINEs Sono associate prevalentemente a DNA genomico Sono associate prevalentemente a DNA genomico

ricco in ricco in A/TA/T perché tendono a posizionarsi in regioni perché tendono a posizionarsi in regioni del cromosoma povere di geni allo scopo di imporre il del cromosoma povere di geni allo scopo di imporre il minimo impatto mutazionale al genoma.minimo impatto mutazionale al genoma.

SINEsSINEs Sono associate prevalentemente a DNA genomico Sono associate prevalentemente a DNA genomico

ricco in ricco in G/CG/C. . Perché? Sembra che tali sequenze Sembra che tali sequenze svolgano una qualche funzione positiva per il genoma: svolgano una qualche funzione positiva per il genoma: esse sarebbero espresse in condizioni di stress ed i esse sarebbero espresse in condizioni di stress ed i risultanti RNA legherebbero una particolare protein risultanti RNA legherebbero una particolare protein chinasi PKR e bloccherebbero la sua capacità di chinasi PKR e bloccherebbero la sua capacità di inattivare la traduzione.inattivare la traduzione.

DNA ripetuto in tandemDNA ripetuto in tandem DNA costituto da DNA costituto da blocchiblocchi di di

sequenzesequenze che possono trovarsi che possono trovarsi in poche o in molte in poche o in molte localizzazioni cromosomiche localizzazioni cromosomiche differenti. A seconda delle differenti. A seconda delle dimensioni mediedimensioni medie del blocco di del blocco di unità ripetute è possibile unità ripetute è possibile suddividere questo DNA non suddividere questo DNA non codificante in subclassi: codificante in subclassi: satellitesatellite,,minisatelliteminisatellite e e microsatellite.microsatellite.

DNA satelliteDNA satellite comprende un comprende un grande gruppogrande gruppo di blocchi di di blocchi di DNA ripetuto in tandem con DNA ripetuto in tandem con singole unità ripetute più o singole unità ripetute più o meno complesse. Il DNA di meno complesse. Il DNA di questo tipo non è trascritto questo tipo non è trascritto e praticamente costituisce il e praticamente costituisce il grosso dell’eterocromatina grosso dell’eterocromatina del genoma localizzata al del genoma localizzata al centromero (eterocromatina centromero (eterocromatina pericentrica)pericentrica)

DNA DNA satellitesatellite

DNA minisatelliteDNA minisatellite comprende due tipi di comprende due tipi di sequenze di DNA ripetuto sequenze di DNA ripetuto in tandem, non trascritto, in tandem, non trascritto, di di modeste dimensionimodeste dimensioni e e disperso nel genoma disperso nel genoma nucleare: nucleare: minisatelliti minisatelliti telomericitelomerici e e minisatelliti minisatelliti ipervariabiliipervariabili

DNA TELOMERICODNA TELOMERICO

Questo tipo di DNA è localizzato all’estremità dei Questo tipo di DNA è localizzato all’estremità dei cromosomi, nei telomericromosomi, nei telomeri

Il costituente principale del DNA telomerico è Il costituente principale del DNA telomerico è rappresentato da 10-15kb di unità rappresentato da 10-15kb di unità esanucleotidicheesanucleotidiche ripetute in tandem, in particolare TTAGGG, che vengono ripetute in tandem, in particolare TTAGGG, che vengono aggiunte da un enzima specializzato, la aggiunte da un enzima specializzato, la telomerasitelomerasi

Tali ripetizioniTali ripetizioni sono responsabili della funzione dei sono responsabili della funzione dei telomeri in quanto agiscono come protezioni delle telomeri in quanto agiscono come protezioni delle estremità dei cromosomi dalla degradazione e dalle estremità dei cromosomi dalla degradazione e dalle perdite di materialeperdite di materiale

Inoltre forniscono un meccanismo per la replicazione Inoltre forniscono un meccanismo per la replicazione delle estremità lineari del DNA cromosomicodelle estremità lineari del DNA cromosomico

DNA minisatellite ipervariabile oDNA minisatellite ipervariabile o VNTRVNTR((VVariableariable NNumberumber ofof TTandemandem RRepeat)epeat)

Sono sequenze altamente polimorfiche ed organizzate in Sono sequenze altamente polimorfiche ed organizzate in oltre 1000 gruppi (lunghi da 0.1 a 20 kb) di corte unità oltre 1000 gruppi (lunghi da 0.1 a 20 kb) di corte unità ripetute in tandem, che variano considerevolmente per ripetute in tandem, che variano considerevolmente per dimensioni ma posseggono una sequenza comune dimensioni ma posseggono una sequenza comune centrale (centrale (corecore),GGGCAGGA),GGGCAGGAXGG

Molti di questi gruppi si trovano vicino ai telomeriMolti di questi gruppi si trovano vicino ai telomeri

La maggior parte di queste sequenze La maggior parte di queste sequenze nonnon sono trascritte sono trascritte eccetto alcuni elementi all’interno di sequenze eccetto alcuni elementi all’interno di sequenze intrageniche non codificantiintrageniche non codificanti

Il significato non è ancora chiaro, ma Il significato non è ancora chiaro, ma indipendentemente dalla loro reale funzione nel genoma indipendentemente dalla loro reale funzione nel genoma umano, esiste un utilizzo pratico di questi gruppi, ma in umano, esiste un utilizzo pratico di questi gruppi, ma in genere delle sequenze ripetute, nel genere delle sequenze ripetute, nel DNA fingerprinting DNA fingerprinting (impronta digitale del DNA)(impronta digitale del DNA)

DNA fingerprintingDNA fingerprinting

La molecola del DNA possiede caratteristiche che La molecola del DNA possiede caratteristiche che consentono di differenziare i diversi individui consentono di differenziare i diversi individui perché,diversamente da un impronta digitale perché,diversamente da un impronta digitale convenzionale,l’impronta digitale del DNA non può convenzionale,l’impronta digitale del DNA non può essere alterata da alcun trattamento conosciuto essere alterata da alcun trattamento conosciuto

Queste differenze vengono utilizzate per studi che Queste differenze vengono utilizzate per studi che trovano sviluppo in diversi ambiti:trovano sviluppo in diversi ambiti:

ForenseForense: risoluzione dei crimini: risoluzione dei crimini

identificazione vittimeidentificazione vittime

MedicoMedico: diagnosi dei disordini ereditati: diagnosi dei disordini ereditati

cure di sviluppo per i disordini ereditaticure di sviluppo per i disordini ereditati

test di paternitàtest di paternità

EvoluzionisticoEvoluzionistico:comportamento degli animali:comportamento degli animali

popolazioni genetichepopolazioni genetiche

Minisatelliti: Riconosciuti su gel Minisatelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCRdopo amplificazione con PCR

DNA minisatellite ipervariabile DNA minisatellite ipervariabile PROBLEMIPROBLEMI

I VNTR presentano delle difficoltà relative alla I VNTR presentano delle difficoltà relative alla genotipizzazione in quanto vista la loro genotipizzazione in quanto vista la loro lunghezza tali marcatori vengono amplificati lunghezza tali marcatori vengono amplificati con difficoltà in una reazione di PCRcon difficoltà in una reazione di PCR

Non sono uniformemente distribuiti in tutto il Non sono uniformemente distribuiti in tutto il genomagenoma

ALTRA CATEGORIA ALTRA CATEGORIA

DI MARCATORI MOLECOLARIDI MARCATORI MOLECOLARI

DNA Microsatellite o STR (DNA Microsatellite o STR (SShort hort TTandem andem RRepeat)epeat)Le famiglie di DNA Le famiglie di DNA

microsatellite includono microsatellite includono piccoli blocchipiccoli blocchi di di ripetizioni in tandem,da ripetizioni in tandem,da 15-50 volte,semplici nella 15-50 volte,semplici nella sequenza (1-6bp)e sequenza (1-6bp)e dispersi nel genomadispersi nel genoma

Sono numerosi, con una Sono numerosi, con una densità media stimata densità media stimata intorno ad 1 STR ogni intorno ad 1 STR ogni 30,000-10,000bp30,000-10,000bp

Il numero di ripetizioni Il numero di ripetizioni varia frequentemente tra varia frequentemente tra gli alleli portando ad un gli alleli portando ad un alto grado di alto grado di polimorfismopolimorfismo

Sono abbastanza Sono abbastanza comuni le comuni le ripetizioni ripetizioni mononucleotidichemononucleotidiche (A)n o (T)n che (A)n o (T)n che arrivano a costituire arrivano a costituire in tutto ca 10 in tutto ca 10 Mb,ovvero lo 0.3% del Mb,ovvero lo 0.3% del genoma nuclearegenoma nucleare

Le ripetizioni di (G)n e Le ripetizioni di (G)n e di(C)n sono, al di(C)n sono, al contrario,più rarecontrario,più rare

DNA Microsatellite o STRDNA Microsatellite o STRLe Le ripetizioni ripetizioni

dinucleotidichedinucleotidiche CA/TG CA/TG (TG sul filamento (TG sul filamento complementare)sono complementare)sono molto comuni; molto comuni; costituiscono infatti ca costituiscono infatti ca lo 0.5% del genomalo 0.5% del genoma

Sono Sono altamentealtamente polimorfichepolimorfiche

Sono diffuse anche le Sono diffuse anche le ripetizioni CT/AG che si ripetizioni CT/AG che si verificano in media verificano in media ogni 50 kb e ogni 50 kb e costituiscono ca lo costituiscono ca lo 0.2% del genoma0.2% del genoma

Le ripetizioni CG/GC Le ripetizioni CG/GC risultano molto rare, risultano molto rare, questo perché i residui questo perché i residui C affiancati in 3’da un C affiancati in 3’da un residuo G (cioè residuo G (cioè CpG)sono soggetti a CpG)sono soggetti a metilazione e a metilazione e a successiva successiva deaminazione, deaminazione, diventando TpG (o CpA diventando TpG (o CpA sull’altro filamento)sull’altro filamento)

DNA Microsatellite o STRDNA Microsatellite o STRLe ripetizioni in tandem di Le ripetizioni in tandem di tre tre

nucleotidinucleotidi nel DNA codificante nel DNA codificante possono essere siti soggetti ad possono essere siti soggetti ad espansione patologicaespansione patologica..

EsempioEsempio: : Caso del Caso del sito fragile dell’Xsito fragile dell’X (causata (causata

da una mutazione nel gene da una mutazione nel gene FMR1FMR1, , che codifica per una proteina che codifica per una proteina implicata nello sviluppo delle implicata nello sviluppo delle sinapsi) sinapsi) Corea di HuntingtonCorea di Huntington (patologia (patologia

ereditaria causata dalla ereditaria causata dalla degenerazione di neuroni degenerazione di neuroni localizzati in specifiche aree del localizzati in specifiche aree del cervello)cervello)

Distrofia miotonicaDistrofia miotonica (chr 19, CTG è (chr 19, CTG è ripetuta da 50 fino a migliaia di ripetuta da 50 fino a migliaia di volte nei soggetti patologici) e volte nei soggetti patologici) e certi tipi di atassia cerebellarecerti tipi di atassia cerebellare

(Bennett P: Demystified... (Bennett P: Demystified... Microsatellites. Microsatellites. J Clin Pathol:Mol J Clin Pathol:Mol Pathol 2000,53:177-183)Pathol 2000,53:177-183)

I I trinucleotiditrinucleotidi e i e i tetranucleotiditetranucleotidi ripetuti in tandem ripetuti in tandem sono relativamente sono relativamente rari ma spesso rari ma spesso polimorfici e polimorfici e potenzialmente utili potenzialmente utili per l’identificazione per l’identificazione di marcatori di marcatori altamente polimorficialtamente polimorfici

I microsatelliti sono I microsatelliti sono evidenziabili non solo evidenziabili non solo nel DNA intergenico nel DNA intergenico o dentro gli introni o dentro gli introni ma esempi ne sono ma esempi ne sono stati riportati anche stati riportati anche all’interno di regioni all’interno di regioni codificanticodificanti

VANTAGGIVANTAGGI

Tecnicamente gli STR, a Tecnicamente gli STR, a confronto con altri confronto con altri marcatori,presentano il marcatori,presentano il vantaggio di essere:vantaggio di essere:

1.1. NumerosiNumerosi

2.2. Equamente distribuiti Equamente distribuiti in tutta la parte in tutta la parte eucromatica del eucromatica del genomagenoma

3.3. Altamente polimorfici e Altamente polimorfici e quindi informativiquindi informativi

4.4. Analizzabili facilmente Analizzabili facilmente tramite PCRtramite PCR

Questa relativa facilità di Questa relativa facilità di studio ha portato ad un studio ha portato ad un rapido incremento del rapido incremento del numero degli STRs esaminatinumero degli STRs esaminati

Catalogazione standard: es Catalogazione standard: es D12S324D12S324,dove ,dove 1212 è il è il cromosoma sul quale il cromosoma sul quale il marker è localizzato e marker è localizzato e 324324 è è un codice un codice identificativo(identificativo(Bennett P: Bennett P: Demystified...Microsatellites. Demystified...Microsatellites. J Clin J Clin Pathol:Mol Pathol 2000,53:177-Pathol:Mol Pathol 2000,53:177-

183183))

ANALISI degli STRANALISI degli STR

Attualmente si utilizzano Attualmente si utilizzano tecniche di PCR tecniche di PCR (Polymerase Chain (Polymerase Chain Reaction)Reaction)

I I primersprimers, progettati , progettati esterni alla sequenza esterni alla sequenza ripetuta ed utilizzati ripetuta ed utilizzati per amplificare le per amplificare le sequenze dei sequenze dei microsatelliti, sono microsatelliti, sono marcatimarcati covalentemente covalentemente con differenti con differenti fluoroforifluorofori

Tali molecole assorbono Tali molecole assorbono l’energia fornita da un l’energia fornita da un laser per poi laser per poi riemetterla a riemetterla a lunghezze d’onda lunghezze d’onda differenti specifiche differenti specifiche per ciascun fluoroforoper ciascun fluoroforo

Stutter o Shadow BandsStutter o Shadow Bands

Un problema da affrontare Un problema da affrontare nell’analisi dei nell’analisi dei microsatelliti è la microsatelliti è la formazione, durante il formazione, durante il processo di processo di amplificazione, di prodotti amplificazione, di prodotti aspecifici chiamati“aspecifici chiamati“stutterstutter o shadowo shadow bandsbands””

La formazione dei prodotti La formazione dei prodotti aspecifici è legata alla aspecifici è legata alla processività della Taq processività della Taq Polimerasi(Polimerasi(Lawyer F. et Lawyer F. et al.al.PCR Methods Appl.,1993 PCR Methods Appl.,1993 May; 2 (4): 275-287May; 2 (4): 275-287)) piuttosto piuttosto che alla struttura che alla struttura secondaria del DNAsecondaria del DNA

InfattiInfatti l’utilizzo di una l’utilizzo di una DNA polimerasi DNA polimerasi termostabile con un’alta termostabile con un’alta processività può ridurre processività può ridurre notevolmente la notevolmente la formazione di prodotti formazione di prodotti aspecificiaspecifici

ELETTOFORETOGRAMMA

Stutter o Shadow BandsStutter o Shadow Bands

Nel caso delle ripetizioni dinucleotidiche,la stutter Nel caso delle ripetizioni dinucleotidiche,la stutter band prevalente è di 2 bp più piccola rispetto al picco band prevalente è di 2 bp più piccola rispetto al picco principale,con in più la formazione di statter bands di principale,con in più la formazione di statter bands di 4 e 6bp più piccole anche visibili4 e 6bp più piccole anche visibili((Murray V. et al. Murray V. et al. Nucleic Nucleic AcidsAcids Res,1993,21:2395-2398Res,1993,21:2395-2398))

Questo comporta che per ciascun allele si abbia un Questo comporta che per ciascun allele si abbia un pattern con più bande il che rende complicata pattern con più bande il che rende complicata l’interpretazione dei dati, in modo particolare per l’interpretazione dei dati, in modo particolare per campioni di DNA che sono una miscela di due o più campioni di DNA che sono una miscela di due o più individuiindividui

La tendenza, adesso, è di utilizzare marcatori tri- o La tendenza, adesso, è di utilizzare marcatori tri- o tetra-nucleotidici che danno risultati più evidentitetra-nucleotidici che danno risultati più evidenti

Stutter BandsStutter Bands In seguito alla reazione di In seguito alla reazione di

PCR si osserva la PCR si osserva la formazione di soltanto una formazione di soltanto una singola stutter band in una singola stutter band in una posizione di 4bp più piccola posizione di 4bp più piccola rispetto a ciascun allele e rispetto a ciascun allele e l’intensità della stutter l’intensità della stutter band è generalmente <10% band è generalmente <10% rispetto al picco principalerispetto al picco principale

Tale percentuale dipende Tale percentuale dipende però anche dalla però anche dalla dimensione del picco dimensione del picco principale nel senso che,per principale nel senso che,per esempio,per alleli compresi esempio,per alleli compresi in un range di 166bp, la in un range di 166bp, la stutter band è ca il 4% del stutter band è ca il 4% del picco principale (picco principale (P.Sean P.Sean

Walsh etWalsh et al. al. Nucleic Acids Nucleic Acids

Res,1996,24 (14): 2807-2812Res,1996,24 (14): 2807-2812))

Le statter bands sono anche Le statter bands sono anche utiliutili però nell’assegnazione però nell’assegnazione manuale dei picchi relativi manuale dei picchi relativi agli alleli perché la loro agli alleli perché la loro presenza serve a presenza serve a discriminare i picchi degli discriminare i picchi degli alleli principali rispetto a alleli principali rispetto a picchi isolati che sono picchi isolati che sono probabilmente dovuti ad probabilmente dovuti ad aspecificiaspecifici

TRAPIANTOTRAPIANTO

Il trapianto allogenico di midollo osseo (BM) o di Il trapianto allogenico di midollo osseo (BM) o di cellule staminali periferiche (PBSC) spesso cellule staminali periferiche (PBSC) spesso rappresenta il solo approccio terapeutico curativo rappresenta il solo approccio terapeutico curativo utilizzabile in diverse malattie neoplastiche e nonutilizzabile in diverse malattie neoplastiche e non

Inizialmente il trapianto veniva effettuato soltanto in Inizialmente il trapianto veniva effettuato soltanto in caso di“caso di“related donorsrelated donors”, negli utlimi anni viene ”, negli utlimi anni viene ampliamente utilizzato il trapianto di BM o di PBSC ampliamente utilizzato il trapianto di BM o di PBSC da “da “HLA-MAtched Unrelated DonorsHLA-MAtched Unrelated Donors”(MUD)”(MUD)

Inoltre da quando l’“Inoltre da quando l’“acute graft-versus host disease” acute graft-versus host disease” (aGVHD) rappresenta una maggiore complicazione, (aGVHD) rappresenta una maggiore complicazione, specialmente in caso di trapianto da PBSC, viene specialmente in caso di trapianto da PBSC, viene effettuata frequentemente la deplezione delle cellule T effettuata frequentemente la deplezione delle cellule T del graft del graft

TRAPIANTOTRAPIANTO

Molte di queste procedure sono però associate con un Molte di queste procedure sono però associate con un sostanziale rischio di incremento di rigetto e di sostanziale rischio di incremento di rigetto e di ripresa di malattia, quindi risulta necessario ripresa di malattia, quindi risulta necessario monitorare strettamente il grado di attecchimento del monitorare strettamente il grado di attecchimento del trapiantotrapianto ( (Thiede C. et al. Thiede C. et al. Leukemia,2001,15:293-Leukemia,2001,15:293-

302302))

Diversi approcci sono stati utilizzati a tale scopo ma Diversi approcci sono stati utilizzati a tale scopo ma quello che si è rilevato più utile perché più quello che si è rilevato più utile perché più informativo consiste nell’utilizzo di una informativo consiste nell’utilizzo di una multiplex PCRmultiplex PCR mediante la quale è possibile la co-amplificazione in mediante la quale è possibile la co-amplificazione in una singola reazione di 9 o più differenti STR e una singola reazione di 9 o più differenti STR e dell’dell’amelogeninaamelogenina, che è il , che è il locus del sessolocus del sesso

CO-AMPLIFICAZIONECO-AMPLIFICAZIONE

In commercio esistono dei kit che consento di co-In commercio esistono dei kit che consento di co-amplificare contemporaneamente 10 o più amplificare contemporaneamente 10 o più microsatellitimicrosatelliti

In particolare nel nostro laboratorio viene In particolare nel nostro laboratorio viene utilizzato: utilizzato: AmpFAmpFllSTR PROFILERSTR PROFILER dell’Applied dell’Applied BiosystemsBiosystems

Il kit contiene:Il kit contiene: Buffer Buffer Set di 10 coppie di primers.Un primer di Set di 10 coppie di primers.Un primer di

ogni coppia è marcato con un fluorocromo: ogni coppia è marcato con un fluorocromo: 5-FAM5-FAM (5-carbossifluoresceina), (5-carbossifluoresceina),JOEJOE ee NEDNED che vengono rispettivamente rilevati come che vengono rispettivamente rilevati come blu,verde e giallo blu,verde e giallo

AmpliTaq GoldAmpliTaq Gold

STR systemSTR system ChromosomesChromosomes Common Sequence MotifCommon Sequence Motif Range Range (bp)(bp) FluorophoresFluorophores

D3S1358 3p TCTA(TCTG)1-3(TCTA)n 114-142 5-FAM

vWA 12p12-pter TCTA(TCTG)3-4(TCTA)n 157-197 5-FAM

FGA 4q28(TTTC)3TTTTTTCT(CTTT)n

CTCC(TTCC)2

219-267 5-FAM

AmelogeninaX: p22.1-22.3

Y: p11.2/ 107-113 JOE

TH01 11p15.5 (AATG)n 169-189 JOE

TPOX 2p23-2per (AATG)n 218-242 JOE

CSF1PO 5q33.3-34 (AGAT)n 281-317 JOE

D5S818 5q21-31 (AGAT)n 135-171 NED

D13S317 13q22-31 (GATA)n 206-234 NED

D7S820 7q (GATA)n 258-294 NED

Nella seguente tabella sono indicati: il Nella seguente tabella sono indicati: il tipo di STRtipo di STR, la , la localizzazione cromosomicalocalizzazione cromosomica, il , il corecore,gli intervalli (,gli intervalli (rangerange) ) possibili delle dimensioni in bp dei singoli STR ed il possibili delle dimensioni in bp dei singoli STR ed il tipo di tipo di fluorocromofluorocromo coniugato ad ognuno di essi coniugato ad ognuno di essi

cell cell nucleusnucleus

chromosomechromosome

Target Region for PCRTarget Region for PCR

IndividuaIndividual l

nucleotidnucleotideses

Double Double stranded DNA stranded DNA moleculemolecule

Thermal Cycling TemperaturesThermal Cycling Temperatures

95

60oC

72oC

Time

TemperatureSingle CycleSingle Cycle

Typically 25-35 cycles performed during PCR

95oC 95oC 95oC

60oC60oC

72oC72oC

The denaturation time in the first cycle is The denaturation time in the first cycle is lengthened to ~10 minutes when using lengthened to ~10 minutes when using AmpliTaq Gold to perform a “hot-start” PCR AmpliTaq Gold to perform a “hot-start” PCR

95oC

PCR Copies DNA Exponentially through Multiple Thermal Cycles

Original DNA target region

Thermal cycleThermal cycleThermal cycle

In 32 cycles at 100% efficiency, 1.07 billion copies of targeted DNA region are created

In 32 cycles at 100% efficiency, 1.07 billion copies of targeted DNA region are created

PCR Copies DNA Exponentially through Multiple Thermal Cycles

Thermal cycle

ELETTROFORETOGRAMELETTROFORETOGRAMMAMA

Calcolo del chimerismoCalcolo del chimerismo

Per procedere al calcolo del chimerismo, occorre tenere Per procedere al calcolo del chimerismo, occorre tenere presente che:presente che:

La valutazione viene effettuata sulla base dei dati La valutazione viene effettuata sulla base dei dati rilevati nel ricevente post-trapiantorilevati nel ricevente post-trapianto

Sono da considerarsi solo i loci in cui si osserva Sono da considerarsi solo i loci in cui si osserva chimerismo misto (tra i 10 complessivamente chimerismo misto (tra i 10 complessivamente analizzati)analizzati)

Gli alleli condivisi tra donatore e ricevente non sono Gli alleli condivisi tra donatore e ricevente non sono considerati informativiconsiderati informativi

Occorre tenere presente diverse situazioni come di Occorre tenere presente diverse situazioni come di seguito riportato (seguito riportato (Chiede C. et al.Chiede C. et al.Bone Marrow Bone Marrow Transplatation,1993,23:1055-1060Transplatation,1993,23:1055-1060):):

Schematic illustration of calculations Schematic illustration of calculations performed for the quantitative assessment of performed for the quantitative assessment of mixed chimerismmixed chimerism

II IIII IIIIII

I.I. Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno alleli in comunealleli in comune

Esempio: caso I

I.I. Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno alleli in comunealleli in comune

II.II. Ricevente e donatore sono eterozigoti ed hanno un allele in Ricevente e donatore sono eterozigoti ed hanno un allele in comunecomune

Schematic illustration of calculations Schematic illustration of calculations performed for the quantitative assessment of performed for the quantitative assessment of mixed chimerismmixed chimerism

II IIII IIIIII

Esempio: caso II

Schematic illustration of calculations Schematic illustration of calculations performed for the quantitative assessment of performed for the quantitative assessment of mixed chimerismmixed chimerism

II IIII IIIIII

I.I. Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno Ricevente e donatore sono omo o eterozigoti e non hanno alleli in comunealleli in comune

II.II. Ricevente e donatore sono eterozigoti ed hanno un allele in Ricevente e donatore sono eterozigoti ed hanno un allele in comunecomune

III.III.Ricevente è omozigote ed il donatore è eterozigote ed Ricevente è omozigote ed il donatore è eterozigote ed hanno un allele in comunehanno un allele in comune

Esempio: caso III

ALTRA CATEGORIA ALTRA CATEGORIA

DI MARCATORI MOLECOLARIDI MARCATORI MOLECOLARI

SNPSNP

((SSingleingle N Nucleotideucleotide P Polymorfismolymorfism)) Gli SNPs,scoperti negli anni 80, sono variazioni di Gli SNPs,scoperti negli anni 80, sono variazioni di

sequenza del DNA che si verificano quando è alterato sequenza del DNA che si verificano quando è alterato un un singolo nucleotidesingolo nucleotide della sequenza genomica della sequenza genomica

Affinchè una variazione nella sequenza nucleotidica Affinchè una variazione nella sequenza nucleotidica sia considerata uno SNP, deve essere presente in sia considerata uno SNP, deve essere presente in almeno l’1% della popolazione per cui almeno l’1% della popolazione per cui l’inserzione/delezione di una singola base non deve l’inserzione/delezione di una singola base non deve essere considerata uno SNPessere considerata uno SNP

A differenza delle VNTR e degli STRs, gli A differenza delle VNTR e degli STRs, gli SNPs non SNPs non sono sequenze ripetutesono sequenze ripetute e possono trovarsi sia nelle e possono trovarsi sia nelle regioni codificanti che non-codificanti del genoma regioni codificanti che non-codificanti del genoma ((Dwight H.O.et al.Dwight H.O.et al.Journal of Molecular Diagnostics, 2000, Journal of Molecular Diagnostics, 2000, 2(4):202-2082(4):202-208))

SNPSNP

Attualmente sono i marcatori molecolari più utilizzati Attualmente sono i marcatori molecolari più utilizzati perché il grande vantaggio nell’utilizzarli è dato perché il grande vantaggio nell’utilizzarli è dato dall’elevato numero di polimorfismi che possono dall’elevato numero di polimorfismi che possono essere genotipizzati e dalla loro elevata densità lungo essere genotipizzati e dalla loro elevata densità lungo tutto il genomatutto il genoma

Costituiscono ca il 90% di tutti i polimorfismi presenti Costituiscono ca il 90% di tutti i polimorfismi presenti nel genoma umano. A giugno del 2004 nell’uomo è nel genoma umano. A giugno del 2004 nell’uomo è stata stimata una frequenza per gli SNP pari a 1/700bpstata stimata una frequenza per gli SNP pari a 1/700bp

Il recente progresso della genomica ha messo in luce Il recente progresso della genomica ha messo in luce come una parte rilevante della variabilità tra individui come una parte rilevante della variabilità tra individui sia da attribuirsi a polimorfismi a singolo nucleotidesia da attribuirsi a polimorfismi a singolo nucleotide

SNPSNP Gli SNP acquistano particolare rilevanza in campo Gli SNP acquistano particolare rilevanza in campo

biomedico quando possono essere messi in relazione a biomedico quando possono essere messi in relazione a patologie che non presentano una trasmissione patologie che non presentano una trasmissione genetica semplicegenetica semplice

Confrontando lo schema e le frequenze degli SNP su Confrontando lo schema e le frequenze degli SNP su geni potenzialmente coinvolti in patologie e i fenotipi geni potenzialmente coinvolti in patologie e i fenotipi esibiti dai soggetti portatori, è possibile utilizzare tali esibiti dai soggetti portatori, è possibile utilizzare tali sequenze come marcatori molecolarisequenze come marcatori molecolari

PROBLEMIPROBLEMI Attualmente sono poco conosciute le distribuzioni degli Attualmente sono poco conosciute le distribuzioni degli

SNP all’interno di diverse popolazioniSNP all’interno di diverse popolazioni

Non essendo uguali tutti gli SNP,per capire il loro Non essendo uguali tutti gli SNP,per capire il loro effetto sarà importante eseguire un’analisi effetto sarà importante eseguire un’analisi computazionale prima di eseguire uno studio relativo al computazionale prima di eseguire uno studio relativo al loro eventuale coinvolgimento in una patologialoro eventuale coinvolgimento in una patologia

Individuazione degli SNPIndividuazione degli SNP

Il più semplice approccio consiste nell’eseguire il Il più semplice approccio consiste nell’eseguire il sequenziamento diretto dei prodotti di PCR di regioni sequenziamento diretto dei prodotti di PCR di regioni genomiche contenenti il gene di interesse in individui genomiche contenenti il gene di interesse in individui diversidiversi

Tale approccio è però molto costoso in quanto Tale approccio è però molto costoso in quanto richiede lo studio di primers specifici ed inoltre è richiede lo studio di primers specifici ed inoltre è limitato a regioni di cui è nota la sequenza. Quando limitato a regioni di cui è nota la sequenza. Quando si presentano doppi picchi, come negli eterozigoti, si presentano doppi picchi, come negli eterozigoti, non è facile discernere tra artefatti dovuti al non è facile discernere tra artefatti dovuti al sequenziamento e polimorfismi realisequenziamento e polimorfismi reali

Individuazione degli SNPIndividuazione degli SNP

Per ottenere un elevato numero di SNP nell’uomo, Per ottenere un elevato numero di SNP nell’uomo, recentemente viene utilizzato un nuovo approccio recentemente viene utilizzato un nuovo approccio chiamato chiamato Reduced Representation ShotgunReduced Representation Shotgun

Il DNA proveniente da diversi individui viene mischiato Il DNA proveniente da diversi individui viene mischiato e vengono prodotte delle librerie plasmidiche e vengono prodotte delle librerie plasmidiche composte da sottoinsiemi di frammenti di restrizione composte da sottoinsiemi di frammenti di restrizione purificati tramite elettroforesi su gel. Viene quindi purificati tramite elettroforesi su gel. Viene quindi eseguito un sequenziamento di tipo eseguito un sequenziamento di tipo shotgunshotgun su tali su tali librerie e le sequenze che risultano sovrapponibili librerie e le sequenze che risultano sovrapponibili vengono allineate, mediante l’impiego di specifici vengono allineate, mediante l’impiego di specifici programmi,andando ad evidenziare i polimorfismiprogrammi,andando ad evidenziare i polimorfismi

Genotipizzazione degli Genotipizzazione degli SNPSNP mediante mediante microarraymicroarray...tale ...tale metodica dovrebbe ridurre i problemi associati ai metodica dovrebbe ridurre i problemi associati ai segnali aspecifici migliorando la qualità dei risultati segnali aspecifici migliorando la qualità dei risultati ottenutiottenuti