oncoematologia
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Ana Valencia Martinez
Università degli Studi di Firenze
CITOGENETICA CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
La parte della genetica responsabile dello studio microscopico dei cromosomi. Consente l’identificazione degli individui con un numero anomalo di cromosomi o di cambiamenti strutturali. I citogenetisti fanno uso di tre caratteristiche per l’identificazione e classificazione dei cromosomi:
• Elementi morfologici: grandezza, forma
• Bandeggio: G, Q, R
Citogenetica
Posizione del centromero
braccio corto
braccio lungo
Bandeggio cromosomico
AB
C
D E
F G
Bandeggio cromosomico
La colorazione dei cromosomi con opportune sostanze permette di ottenere lungo ciascun cromosoma una serie di bande specifiche di intensità variabile secondo un modello costante e riproducibile. Bandeggi generali: G, Q, R
Bandeggio cromosomico
Bandeggio cromosomico
Bandeggio cromosomico
Bandeggio cromosomicoInterfase
Profase
Metafase
Anafase
Telofase
Citocinesi
FISH
CARIOTIPO
Anomalie cromosomicheAnomalie di numero
Anomalie di struttura
Anomalie strutturali
DELEZIONE: perdita di un segmento cromosomico, terminale o interstiziale
Anomalie strutturaliDUPLICAZIONE di un segmento cromosomico, diretta o inversa a seconda che conservi l’originale disposizione
rispetto al centromero o ruoti di 180°
Anomalie strutturali
INSERZIONE: inserimento di un segmento di cromosoma, terminale o interstiziale.
Anomalie strutturali
TRASLOCAZIONE: trasferimento reciproco di una parte di un cromosoma sull’altro cromosoma
a b a b
Cariotipo
International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN, 2009)
La formula del cariotipo si scrive utilizzando una nomenclatura standard internazionale.
46,XY[20]45,XX,-7[20]47,XY,+21[20]46,XX,t(9;22)(q34;q11)[20]46,XX,t(9;22)(q34;q11)[5]/47,idem,+8[15]
Anomalie cromosomiche
XX,del(5)(q12q34),-13,der(17),t(17;18)(p12;q11),-18,der(19),t(1;19)(q12;p13),-21,+2mar45,
Colorazione (bandeggio)
Selezione e cattura immagini
Elaborazione e cariotipizzazione
Conclusione diagnostica
(CC)Cariotipo Convenzionale
Aspirato midollare
Conteggio nucleate
Semina in terreno
Coltura per 24 - 48h
Colchicina
Fissazione e lavaggi
Allestimento dei vetrini
Proprietà del DNA di catena singola di ibridare con sequenze complementari.
Le sonde di DNA vengono marcate con fluorocromi e si visualizzano al microscopio.
Permette l’analisi di un maggiore numero di cellule.
Si può applicare in cellule in interfase (SP o MO).
FISH
Colorazione (bandeggio)
Selezione e cattura immagini
Elaborazione e cariotipizzazione
Conclusione diagnostica
(CC)Cariotipo Convenzionale
Aspirato midollare(sangue periferico)
Conteggio nucleate
Semina in terreno
Coltura per 24 - 48h
Colchicina
Fissazione e lavaggi
Allestimento dei vetrini
Scelta delle sonde
Denaturazione e Ibridazione over night
Lavaggi econtrocolorazione
Valutazione immagini
Cattura / elaborazione
Conclusione diagnostica
(FISH)Ibridazione in Situ
Citogenetica oncoematologica
L’analisi citogenetica in ematologia:
- definizione diagnostica - stratificazione prognostica
- comprensione dei meccanismi patogenetici
SINDROMI MIELODISPLASTICHE
Definizione Le sindromi mielodisplastiche sono un gruppo di malattie del midollo osseo
caratterizzate dalla incapacità delle cellule progenitrici di maturare normalmente:
- midollo oseo: ematopoiesi clonale e inefficace - sangue periferico: citopenie periferiche
- progressiva insufficienza midollare- rischio di progressione in LAM
Patofisiologia
Celulla progenitrice
SMD
Stroma/Factori
angiogenici
Mutazioni/Danno del DNA
Epigenetica
Differenziazione
Apoptosi
Sistema inmune
Tossicitàdiretta
ambientale
Valutazione morfologica (qualitativa, quantitativa)
Istologia su biopsia osteomidollare
Immunofenotipo
Citogenetica
Biologia Molecolare
Inquadramento diagnostico
CITOGENETICA CONVENZIONALE
Alterazioni cromosomiche sono dimostrabili nel:
In generale, le alterazioni ricorrenti nelle SMD sono le delezioni cromosomiche, ma anche le perdite o le acquisizioni di interi cromosomi.
Alterazioni citogenetiche
30-50% SMD de novo70-80% SMD secondarie
Alterazioni citogenetiche
Favorevole del(5q) del(20q)
-Y del(12p) del(9q)
+21 del(15q)
-X
Intermedio +8
t(11q23) Rea 3q
-7/del(7q) del(11q) del(15q) del(17q)
-5
Sfavorevole t(5q)
complesso
Morel P. Leukemia. 1993 Sep;7(9):1315-23. (n= 408) ToyamaK. Leukemia. 1993 Apr;7(4):499-508. (n= 401)
Sole F. Haematologica. 2005 Sep;90(9):1168-78. (n= 908) Hasse D. Blood. 2007 Dec 15;110(13):4385-95.(n= 2124)
Pozdnyakova O. Cancer. 2008 Dec 15;113(12):3331-40. (n= 1024)
del(5q)
del(5q), isolata o in combinazione, osservata nel 15% dei casi totali e 30% dei casi alterati.
Entitá clinica definita nella classificazione WHO: “sindrome 5q-”.
del(5q)
Più frequente nei soggetti di sesso femminile. Anemia macrocitica con un numero normale o aumentato di
piastrine. Displasia megacariocitica (megacariociti ipolobulati). Blasti inferiore al 5%. del(5q) come unica alterazione del cariotipo. Generalmente con prognosi favorevole.
Sindrome 5q-
Monosomia-delezione crom. 7 Anomalie riscontrabili nel 10% di forma
isolata o in combinazione.
Associata a prognosi sfavorevole.
30% dei pazienti con SMD secondaria: +8, del(5q), del(20q), del(17p).
del(7q22) in topi non ha fenotipo specifico.
Trisomia 8
Presente in forma isolata nell’8% dei casi a rischio intermedio.
Tra le alterazioni più frequenti di tutti i sottotipi WHO.
Perdita Y e del(20q) Gruppo di rischio favorevole.
10% dei pazienti presenta perdita Y: associato all’età e ad altre patologie non ematologiche.
del(20q) osservata nel 5-7%. CDR (q11-q13) include 19 geni nessuno coinvolto con la patogenesi delle SMD.
EMATOPOIESICLONALE
IPSS Favorevole
Normale del(5q) del(20q)
Sfavorevole Anomalie crom 7
Complesso (≥ 3 anomalie)
, -YIntermedio
+8 Altre anomalie
Nuova classificazione citogenetica
MoltoFavorevole Favorevole Intermedio Sfavorevole Molto
Sfavorevole
Isolata:del(11q)
-Y
NormaleIsolata:der(1;7)del(5q)
del(12p)del(20q)
Doppie con 5q-
Isolata:7q-+8
i(17p)+21+19
Altre singole
Altre doppieDoppie con
–7/7q-
Complesso3 anomalie
Isolata:der(3)(q21q26)
-7
Complesso>3 anomalie
Schanz J. JCO 2012
LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA
Definizione
È un tumore maligno caratterizzato da proliferazione di cellule immature (blasti) che hanno origine dal midollo osseo e da alterata produzione di cellule normali del sangue.
Nei blasti è presente una alterazione dei meccanismi che regolano la proliferazione e la differenziazione della cellula staminale, impedendo la maturazione della sua progenie.
Definizione
Progenitori mieloidiCMH
Eritrociti
Piastrine
Granulociti
Macrofaghi
Mutazione Mutazione Espansione clonale
EmatopoIesi normale
Leucemia Mieloide Acuta
Classificazione WHO 2008
Traslocazioni ricorrenti
Classificazione citogenetica
Classificazione citogenetica
Favorable t(8;21); inv(16), t(15;17)
Intermedio Normal, +8, +21, +22, abn(11q23), del(9q), otras
Desfavorable -5/del(5q), -7/del(7q), abn(3q), 20q, 21q, 17p, t(6;9), t(9;22), cariotipos complejos con 3(5) anomalías
RC (%) RR (%) SG (%)
84 - 91 21 - 35 55 - 65
76 - 86 51 - 67 24 - 41
63 - 22 63 - 22
Grimwade et al. Blood 1998
40 - 50%
Strategie terapeutiche
Better risk
Poor risk
Intermediate risk
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA
Leucemia Mieloide Cronica
Disordine mieloproliferativo della cellula staminale emopoietica.
Incidenza: 1-2/100000 per anno.
15-20% delle Leucemie dell’adulto. L'età media alla diagnosi è di 45-55 anni.
Rapporto M/F:1,7/1.
Leucemia Mieloide Cronica
Diagnosi facile:
- quadro ematologico caratteristico
- marcatore citogenetico specifico
+
Cromosoma Philadelphia
Cromosoma Philadelphia
t(9;22)(q34;q11)
8 9
21 22
Ph´
Citogenetica convenzionale
Metodo standard nella diagnosi della LMC. Permette la conferma della presenza della
t(9;22) e di alcune varianti. Monitoraggio della risposta al trattamento fino
alla RCC. Dopo sensibilità limitata.
Risposta citogenetica
Risp. Citogen. Completa (RCC): 0% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Parziale (RCP): 1-35% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Maggiore (RCM): 0-35% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Minore (RCm): 36-65% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Minima: 66-95% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Nulla: >95% cell. Ph(+).
Variabilità citogenetica
Traslocazioni Ph (+) criptiche Traslocazioni varianti Delezione(9q) (5’ ABL) Evoluzione clonale: Clonal cytogenetic
abnormalities (CCA)
5-10% dei casi di LMC sono Ph (-)
50%: si può dimostrare t(9;22) per FISH (Ph
“mascherato”) oppure il trascritto Bcr-Abl per biologia molecolare
I casi Ph(-)Bcr-Abl(-) costituiscono un gruppo
eterogeneo, con peggiore evoluzione clinica [LMC
Ph (-), LMCa, LMMC e altri MPNC].
Variabilità citogeneticaTraslocazioni criptiche
3-5% dei pazienti con LMC Ph (+) presentano traslocazioni varianti dove sono coinvolti altri cromosomi.
Prognosi simili ai pazienti con traslocazione classica..
Valencia et al. Advances of Hematology 2008
Variabilità citogeneticaTraslocazioni varianti
Evoluzione clonaleClonal chromosome abnormalities (CCA/Ph+)
L’acquisizione di CCA aggiuntive associate a progressione della malattia.
60-80% nelle fasi avanzate si trovano CCA Le più frequenti sono +8, der(22), +19 e i(17q). Altre: -Y, -7, +21.
Evoluzione clonaleClonal chromosome abnormalities (CCA/Ph+)
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 X Y