UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

MARIANA CRISTINA CECHETTO

NANOEMULSÕES CONTENDO EXTRATO DOS FRUTOS DA

Rapanea ferruginea: DESENVOLVIMENTO E ATIVIDADE

ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO

Itajaí

2016

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

MARIANA CRISTINA CECHETTO

NANOEMULSÕES CONTENDO EXTRATO DOS FRUTOS DA

Rapanea ferruginea: DESENVOLVIMENTO E ATIVIDADE

ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Prof. Dr. Angélica Garcia Couto

Itajaí, setembro de 2016

FICHA CATALOGRÁFICA

C324n

Cechetto, Mariana Cristina, 1988-

Nanoemulsões contendo extrato dos frutos da Rapanea Ferruginea:

desenvolvimento e atividade anti-inflamatória in vivo [Manuscrito] /

Mariana Cristina Cechetto. – 2016.

130 f. : il. : 30 cm..

Cópia de computador (Printout(s)).

Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa

de Mestrado em Ciências Farmacêuticas Área de Concentração em

Produtos naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas 2016.

“Orientadora: Profª. Drª Angélica Garcia Couto ;

Bibliografia: f. 107-121.

Inclui: figuras, quadros e tabelas.

1. Emulsões. 2. Myrsinaceae. 3. Extratos vegetais – uso terapêutico.

4. Anti-inflamatório I. Couto, Angélica Garcia. II. Título.

CDU: 615.2

Magda Cristina Possamai – CRB 14/1122

NANOEMULSÕES CONTENDO EXTRATO DOS FRUTOS DA Rapanea ferruginea: DESENVOLVIMENTO E ATIVIDADE

ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO

Mariana Cristina Cechetto

‗Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí. ‘

___________________________________ Angélica Garcia Couto, Dra

Orientador

__________________________________________________________ Clóvis Antonio Rodrigues, Dr.

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______________________________________

Dra.Angélica Garcia Couto (UNIVALI)) Presidente

______________________________________ Dra. Ângela Malheiros (UNIVALI).

Membro

______________________________________ Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva (UNIVALI).

Membro

____________________________________ Dra. Mara Lane Carvalho Cardoso (UEM)

Membro

Itajaí (SC), setembro de 2016

Ao meu pai, meu maior exemplo,

A minha mãe, meu maior orgulho.

A eles, meu amor maior.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter me dado força, coragem e determinação

para seguir em frente e nunca desistir.

Meus maiores agradecimentos são aos meus pais, Sérgio e Eliane,

os quais sempre acreditaram em mim, na minha capacidade e potencial e

sempre me motivaram a realizar meus sonhos. Mãe, obrigada por ter me

apoiado do início ao fim, por ter sempre uma palavra de apoio e conforto

em todos os momentos de fraqueza, fazendo com que eu levantasse e

continuasse. Pai, obrigada por sempre estar ao meu lado, por tudo o que

fez por mim até os últimos dias de sua vida. Se cheguei até aqui devo a

você, sei que de onde estiver continuou torcendo por mim. Saiba que se

fui até o fim foi por você, para que se orgulhasse de mim. Obrigada, amo

vocês acima de tudo.

Não tenho palavras para agradecer ao meu companheiro de vida,

de todas as horas, meu amigo, namorado, marido, Marcel, o qual

embarcou comigo nesse sonho e juntos vencemos mais uma etapa de

nossas vidas, realizamos mais um sonho. Somente nós sabemos o quão

difícil foi chegar até aqui. Obrigada por estar sempre ao meu lado. Te amo

meu amor.

À minha irmã Liciane, que mesmo longe, sempre me apoiou e me

fez acreditar que era capaz, que nunca deixou desistir e que me ajudou a

chegar até aqui. Obrigada Lica por ser essa irmã e amiga maravilhosa.

Agradeço em especial a minha eterna melhor amiga, Karina, que o

acaso do destino fez nós estarmos juntas novamente. Obrigada Ká pelo

seu apoio diário, pelo ombro amigo de vários dias de choro, por estar

presente em todos os momentos de alegrias e tristezas, por não ter me

deixado desistir e por ter me ajudado suportar a dor da distância da

família. Sem você aqui isso não seria possível.

Obrigada a todos da minha família que me apoiaram e torceram por

mim, que mesmo longe se fizeram presentes nessa etapa.

Às minhas amigas que estão longe que me incentivaram e

acreditaram em mim, obrigada pela amizade verdadeira.

As amizades construídas nesse período, em especial à Dircéia, a

qual foi a primeira a estender a mão para me ajudar e, pela qual não tenho

palavras para agradecer. A uma grande mulher e exemplo de força e

determinação, minha amiga Roseni, a qual se tornou minha inspiração,

meu muito obrigado pelos momentos compartilhados, conhecimento

passado e pela amizade construída. Não podendo deixar de agradecer a

Ana Cristina, Lika, Luisa e Junior, os quais fizeram muito por mim e

ajudaram para o desenvolvimento desse trabalho.

Agradeço em especial aos meus chefes do trabalho, Thiago e

Daniela, os quais acreditaram no meu profissionalismo e me deram uma

grande oportunidade Obrigada pela compreensão, por todos os momentos

os quais tive que me ausentar das minhas obrigações profissionais, mas

continuaram sempre me apoiando, obrigada por tudo, se tornaram

pessoas especiais em minha vida e grandes amigos. Agradeço aos

demais colegas de trabalho que de certa forma ajudaram a concluir esse

período de estudo.

Agradeço à Prof. Dra. Angélica G. Couto, pela orientação e todo

conhecimento compartilhado, por estar ao meu lado em todos os

momentos de dúvidas e dificuldades, pela compreensão e por ter

acreditado no meu potencial, obrigada pelo carinho e amizade.

Obrigada à Prof. Isabel Daufenback Machado, por ter contribuído

com seu conhecimento para uma etapa do trabalho, pela realização e

supervisão dos experimentos, junto da sua equipe, meu muito obrigada.

Agradeço a equipe do controle microbiológico, à Prof. Dra. Josiane

de C. Vitorino, pela supervisão, e Bruna e Junior pelo auxílio na

realização, por contribuírem para a realização de uma etapa do trabalho.

Obrigada Prof. Dra. Daisy Netz, pelo conhecimento passado, pelo

tempo que disponibilizou para me ajudar.

Agradeço às Professoras Dra. Angela Malheiros, em especial pela

coleta dos frutos, e Dra. Ruth M. Lucinda Silva, pelo acompanhamento do

trabalho e conhecimento passado.

Agradeço à Professora Tania M. B. Bresolin – coordenadora do

Projeto Pronem, que financiou os materiais utilizados nesta pesquisa.

A todos, meus sinceros agradecimentos.

"Um país se constrói com homens e livros"

Monteiro Lobato

NANOEMULSÕES CONTENDO EXTRATO DOS FRUTOS DA Rapanea ferruginea: DESENVOLVIMENTO E ATIVIDADE

ANTI-INFLAMATÓRIA IN VIVO

Mariana Cristina Cechetto Setembro/2016

Orientador: Prof. Dra. Angélica Garcia Couto Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 130 Tanto o extrato etanólico dos frutos da Rapanea ferruginea assim como as nanoemulsões tem demonstrado atividades biológicas promissoras para o desenvolvimento de medicamentos, tendo-se como marcador o ácido mirsinoico A (AMA). Este trabalho teve por objetivo desenvolver sistema nanoemulsionado óleo em água (O/A), contendo extrato mole etanólico dos frutos de R. ferruginea, e avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo. Os frutos foram coletados em Blumenau (SC), secos e moídos para obtenção da droga vegetal, a qual foi caracterizada quanto a perda por dessecação (PPD), granulometria média (Gm), cinzas totais e insolúveis em ácido. A solução extrativa (SE), obtida por maceração dinâmica com etanol 95%, e o extrato mole (EM), por evaporação do solvente, foram caracterizados quanto ao resíduo seco (RS), pH e teor de AMA por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Para o desenvolvimento das formulações de nanoemulsão (NE), avaliou-se o óleo (triglicerídeo de ácido cáprico e caprílico a 5, 20 e 25%) e EM (0,5, 1 e 1,5%), o sistema tensoativo (monooleato de sorbitano e óleo de mamona etoxilado hidrogenado a 40 unidades de óxido de eteno - OE) (15 e 20%), por meio de estudo de estabilidade preliminar, com ciclos de 5 °C/ 40 °C, a cada 24 h. Na formulação escolhida, avaliou-se o sistema conservante (fenoxietanol com parabenos, a 1 e 2%), por meio do estudo de estabilidade acelerada a 40 ºC, 30 ºC e 5 ºC ± 2 ºC, durante 90 dias, após 0 (24 h), 30, 60 e 90 dias. As formulações foram caracterizadas quanto a separação de fases após centrifugação a 3500 rpm, pH, tamanho de gotícula, índice de polidispersividade (PDI), potencial zeta, viscosidade, teor de AMA por (CLAE), e pesquisa de contaminação microbiológica. A NE foi administrada por via oral em camundongos, para avaliação da atividade anti-inflamatória, pelo modelo in vivo de bolsa de ar, após 0 (24 h) e 90 dias, nas doses de 3, 30 e 100 mg/kg, tendo-se o EM a 3, 30 e 300 mg/kg, e as nanoemulsões sem o EM a 100 mg/kg como controles. A droga vegetal apresentou-se como pó grosso, com Gm de 675 µm, ppd de 8,7%, e cinzas totais e insolúveis de 2,73 e 0,14%, respectivamente. A SE e o EM apresentaram RS de 1,05 e 82,36%, pH de 5,34 e 5,42, teor de AMA de 79,15 e 113,09 mg/g, respectivamente. As NE apresentaram tamanho de gotícula de 100 a 200 nm, com PDI abaixo de 0,2. Os resultados sugerem que a presença do EM nos sistemas, aumenta o potencial zeta e reduzem o pH, enquanto o percentual de óleo aumenta o tamanho das gotículas. A contaminação microbiológica foi aceitável, com < 102UFC/g no tempo zero (24 h) e manteve-se estável apenas na presença do EM após 90 dias. A NE potencializou a atividade inibitória da migração de leucócitos para o EM em todas as doses testadas. Em conclusão, o presente estudo demonstra que o sistema contendo 25% de óleo, 15% de tensoativo, 1,5% de extrato mole dos frutos da R. ferruginea e 1% de conservante mostrou-se estável até o período avaliado de 90 dias, com tamanho de gotícula de 200 nm, com potencial anti-inflamatório. Palavras-chave:Nanoemulsões. Rapanea ferruginea. Atividade anti-inflamatória.

NANOEMULSIONS CONTAINING EXTRACT OF FRUITS OF Rapanea ferruginea: DEVELOPMENT AND ANTI-

INFLAMMATORY ACTIVITY IN VIVO

Mariana Cristina Cechetto September/2016

Supervisor: Prof. Dra. Angélica Garcia Couto Area of Concentration: Natural Products and Bioactive synthetic Substances Number of Pages: 130

Ethanol extract of Rapanea ferruginea fruits and nanoemulsions have both shown promising biological activities for the development of medicines, using myrsinoic acid A (MAA) as a marker. This work aimed to develop oil in water (O/W) nanoemulsions containing soft ethanol extract (SE) of the fruits of R. ferruginea, and to evaluate the anti-inflammatory activity in vivo. The fruits were collected in Blumenau (Santa Catarina, Brazil). they were dried and ground, to obtain the herb drug, which was characterized by loss on drying (LOD), average particle size (APS), and total and acid insoluble ash. The extraction solution (ES) obtained by dynamic maceration in 95% ethanol, and the SE by the solvent evaporation, were characterized as dry residue (DR), pH and MAA content by Liquid Chromatography High efficiency (HPLC). For the development of nanoemulsion formulations (NE), evaluation was carried out of the oil (triglyceride of capric acid and caprylic 5, 20 and 25%) and (0.5, 1 and 1.5%), and the surfactant system (sorbitan monooleate and ethoxylated hydrogenated castor oil 40 ethylene oxide units - OE) (15 and 20%), by means of preliminary stability study, with cycles of 5 °C/ 40 °C, for each 24h. In the chosen formulation, the preservative system was evaluated (phenoxyethanol with parabens, 1 and 2%) through the accelerated stability study at 40 °C, 30 °C and 5 °C ± 2 °C for 90 days, after 0 (24 h) 30, 60 and 90 days. The formulations were characterized by phase separation after centrifugation at 3500 rpm, pH, droplet size, polydispersity index (PDI), zeta potential, viscosity, content of MAA (HPLC) and microbiological control. The NE was orally administered in mice for anti-inflammatory evaluation, by the air bag model after 0 (24 h) and 90 days at doses of 3, 30 and 100 mg/kg, taking SE at 30 and 300 mg/kg and nanoemulsions without the SE at 100 mg/kg as controls. The herb was characterized as a coarse powder with APS of 675 µm, LOD of 8.7%, and total and insoluble ash of 2.73 and 0.14%, respectively. The ES and SE presented DR of 1.05 and 82.36%, pH of 5.34 and 5.42, MAA content of 79.15 and 113.09 mg/g, respectively. The NE showed droplet size of 100 to 200 nm with a PDI less than 0.2. The results suggest that the presence of the SE in the system increases the zeta potential and reduces the pH, while the percentage of oil increases the size of the droplets. Microbiological contamination was acceptable with <102UFC/g at zero time (24 h) and remained stable only in the presence of the MS after 90 days. NE potentiated the inhibitory activity of leukocyte migration for SE at all the doses tested. In conclusion, this study shows that the system containing 25% oil, 15% surfactant, 1.5% of soft extract of the fruits of R. ferruginea and 1% preservative was stable until the evaluation period of 90 days, with a droplet size of 200 nm, and with anti-inflammatory potential. Keywords: Nanoemulsion preparations. Rapanea ferruginea. Anti-inflammatory activity.

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação dos glóbulos de emulsão tipo A/O e O/A. .............. 30

Figura 2: Esquematização dos fenômenos físico-químicos que podem

afetar a estabilidade de nanoemulsões. ......................................... 32

Figura 3: Representação esquemática da técnica de inversão de fases. ...... 36

Figura 4: Imagem da Rapanea ferruginea e frutos. ....................................... 45

Figura 5: Estrutura química dos ácidos mirsinoicos A e B,

respectivamente. ....................................................................................... 46

Figura 6: Mecanismos de migração dos leucócitos para o sítio

inflamatório. (A) detalhe e (B) visão geral das etapas da

migração: 1. Rolamento, 2. Ativação das integrinas, 3. Adesão

estável e 4. Migração/diapedese.................................................... 53

Figura 7: Distribuição granulométrica dos frutos secos e moídos da R.

ferruginea. ...................................................................................... 76

Figura 8: Cromatografia em camada delgada da solução extrativa (SE) e

do extrato mole (EM), utilizando como padrões os ácidos

mirsinoicos A e B. .......................................................................... 79

Figura 9: Perfil cromatográfico das soluções extrativas e extratos mole

por CLAE, em comprimento de onda 260nm e 280nm. ................. 80

Figura 10: Nanoemusões contendo diferentes níveis de óleo e extrato,

após 24h de preparo. ..................................................................... 81

Figura 11: Tamanho de gotícula, PDI e potencial zeta nas nanoemulsões

contendo diferentes percentuais de óleo e extrato mole. ............... 83

Figura 12: Distribuição de tamanho das gotículas das nanoemulsões

contendo os diferentes percentuais de óleo e extrato mole. .......... 85

Figura 13: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo

diferentes percentuais de óleo e extrato mole no tempo zero

(24h) e após 30 dias. ..................................................................... 86

Figura 14: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo

extrato mole a 1,5%, com diferentes percentuais de óleo,

quando submetidas às alterações de temperatura a cada 24h

durante 28 dias (estabilidade preliminar). ...................................... 88

Figura 15: Perfil cromatográfico por CLAE, representativo das

nanoemulsões, sem e com extrato mole da R. ferruginea, em

comprimento de onda 280 nm e 260 nm. ..................................... 90

Figura 17: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo

extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, com diferentes percentuais

de tensoativo, quando submetidas às alterações de

temperatura a cada 24 h durante 14 dias (estabilidade

preliminar). ................................................................................... 92

Figura 18: Aspecto visual das nanoemulsões contendo extrato mole a

1,5%, óleo a 25%, com diferentes percentuais de tensoativo

no tempo zero (24 h). ................................................................... 93

Figura 19: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo

extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, tensoativo a 15%, contendo

diferentes percentuais de conservante, quando submetidas ao

estudo de estabilidade acelerada por 90 dias. ............................. 96

Figura 20: Perfil de viscosidade da nanoemulsão com e sem extrato mole

da R. ferruginea. .......................................................................... 98

Figura 21: Efeito do extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea, de

nanoemulsões com incorporação deste extrato no tempo 0 e

em 90 dias após o preparo e do ácido mirsinóico A na

migração de leucócitos induzida por carragenina 1% no

modelo de bolsa de ar. ............................................................... 102

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Exemplos de estudos de desenvolvimento de nanoemulsões

contento extratos vegetais de 2011 a 2016. ............................ 38

Quadro 3: Relação entre os compostos isolados e atividade farmacológica

da R. ferruginea. ...................................................................... 47

Quadro 4: Gradiente empregado para análise das soluções extrativas de

R. ferruginea. ........................................................................... 62

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Resultados da caracterização físico-química da solução

extrativa e extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea. ............... 78

Tabela 2: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de

estabilidade preliminar (ciclo 28 dias). ............................................... 90

Tabela 3: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de

estabilidade preliminar (ciclo 14 dias). ............................................... 94

Tabela 4: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de

estabilidade acelerada (90 dias). ....................................................... 97

Tabela 5: Análise da viscosidade média, índice de comportamento de

fluxo e tixotropia para as nanoemulsões com e sem extrato

mole de R. ferruginea durante o estudo de estabilidade

acelerada. .......................................................................................... 99

Tabela 6: Análise da pesquisa de contaminação microbiológica para as

nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea

durante o estudo de estabilidade acelerada. ................................... 100

LISTA DE ABREVIATURAS

AMA - Ácido mirsinoico A

AMB - Ácido mirsinoico B

CCD - Cromatografia em camada delgada

CLAE - Cromatografia de Alta Eficiência

DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO - Dimetilsufóxido

DPR - Desvio padrão relativo

EDTA - Ethylenedismine tetraacetic acid/ (ácido etilnodiamino tetra-

acético).

EPM - Erro padrão da média

EM - Extrato mole

EP – Estudo de estabilidade preliminar

Gm – granulometria média

HPLC – High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia líquida

de alta eficiência).

NE – Nanoemulsão

NIQFAR - Núcleo de Investigações Químico – Farmacêuticas.

PBS -Phosphate Base Saline (Tampão salina fosfato).

PDA – Potato Dextrose Agar (Ágar dextrose batata).

PDI – Polispersibility index (Índice de polidispersão).

Ppd – perda por dessecação

RS – Resíduo seco

SE - Solução extrativa

SNE - Sistema nanoemulsionado

S - Desvio padrão

SS - Ágar Salmonela Shigella

TF - Tampão fosfato

TGL - Triglicerídeo

TSA – Soybean Casein Agar (Ágar caseína de soja).

VRBD - Violet Red Bile Dextrose Agar

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 27

2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 29

2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 29

2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 29

3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 30

3.1 Emulsões, microemulsões e nanoemulsões .................................................. 30

3.2 Métodos de caracterização de nanoemulsões ............................................... 36

3.3 Desenvolvimento de nanoemulsões contendo derivados vegetais ............. 37

3.4 Estudo de estabilidade ..................................................................................... 42

3.5 Rapanea ferruginea .......................................................................................... 44

3.6 Inflamação e resposta inflamatória ................................................................. 51

4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 55

4.1 Material .............................................................................................................. 55

4.1.1 Droga vegetal ................................................................................................. 55

4.1.2 Reagentes e materiais ................................................................................... 55

4.1.3 Equipamentos ................................................................................................ 56

4.2 Métodos ............................................................................................................. 58

4.2.1 Tratamento da droga vegetal ........................................................................ 58

4.2.2 Caracterização da droga vegetal .................................................................. 58

4.2.2.1 Análise granulométrica .............................................................................. 58

4.2.2.2 Perda por dessecação ................................................................................ 59

4.2.2.3 Determinação de cinzas totais ................................................................... 59

4.2.2.4 Determinação de cinzas insolúveis em ácido .......................................... 60

4.2.3 Obtenção da solução extrativa e extrato mole ............................................ 60

4.2.4 Caracterização dos derivados vegetais (solução extrativa e

extrato mole) ........................................................................................................... 60

4.2.4.1 Determinação do pH ................................................................................... 60

4.2.4.2 Determinação do resíduo seco .................................................................. 61

4.2.4.3 Análise do perfil cromatográfico dos derivados vegetais por

CCD .......................................................................................................................... 61

4.2.4.4 Quantificação dos marcadores por CLAE ................................................ 61

4.2.5 Desenvolvimento dos sistemas nanoemulsionados .................................. 63

4.2.5.1 Influência da concentração de óleo e extrato........................................... 64

4.2.5.2 Influência da concentração do tensoativo ................................................ 66

4.2.5.2 Influência da concentração do conservante............................................. 66

4.2.6 Caracterização dos sistemas nanoemulsionados desenvolvidos ............. 67

4.2.6.1 Características organolépticas (aspectos físicos) ................................... 68

4.2.6.2 Determinação do pH ................................................................................... 68

4.2.6.3 Análise de tamanho médio de partícula e PDI .......................................... 68

4.2.6.4 Perfil cromatográfico e teor de AMA em CLAE ........................................ 68

4.2.6.4 Análise de viscosidade aparente da nanoemulsão ................................. 69

4.2.6.5 Pesquisa de contaminação microbiológica das nanoemulsões ............. 69

4.2.7 Ensaio da atividade anti-inflamatória in vivo .............................................. 71

4.2.7.1 Animais ........................................................................................................ 71

4.2.7.2 Droga e tratamento ..................................................................................... 72

4.2.7.3 Inflamação no tecido subcutâneo dorsal - bolsa de ar ........................... 72

4.2.7.4 Análise estatística ...................................................................................... 73

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 75

5.1 Obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal ............................. 75

5.2 Caracterização da solução extrativa e extrato mole ...................................... 78

5.3 Otimização dos sistemas nanoemulsionados ................................................ 80

5.3.1 Influência do percentual de óleo e extrato nas nanoemulsões ................. 80

5.3.2 Influência do tensoativo nas nanoemulsões contendo óleo a

25% e extrato a 1,5% ............................................................................................... 91

5.3.3 Influência do conservante na nanoemulsão selecionada .......................... 94

5.3.3.1 Estudo reológico dos sistemas nanoemulsionados com e sem

extrato de R. ferruginea .......................................................................................... 98

5.3.3.2 Pesquisa de contaminação microbiológica das nanoemulsões ........... 100

5.4 Atividade anti-inflamatória in vivo dos sistemas

nanoemulsionados ............................................................................................... 101

6 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 105

REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 107

APÊNDICES ........................................................................................................... 123

ANEXOS ................................................................................................................. 129

27

1 INTRODUÇÃO

A biodiversidade brasileira representa uma ampla fonte de insumos ativos

vegetais farmacêuticos, que podem ser incorporados em diferentes formulações

fitoterápicas para o desenvolvimento tecnológico de produtos (SARAF, 2010). Na

área de pesquisa e inovação no setor industrial farmacêutico no Brasil, destaca-se a

nanotecnologia (FRONZA et al., 2007; LEE, 2004; McCLEMENTS, 2012; RSRAE,

2004), cujas pesquisas tem apresentado crescimento expressivo (ABDI, 2010).

Dentre os tipos de sistemas nanométricos, as nanoemulsões são constituídas

por fases oleosa, aquosa e tensoativos, organizadas em gotículas, cujo tamanho

nanométrico, as tornam cineticamente estáveis frente à sedimentação ou

cremeação, além de prevenir a floculação e a coalescência (ANTON; VANDAMME,

2011; SOLANS; SOLÉ, 2012).

Assim sendo, o emprego da nanotecnologia representa uma estratégia para

aumentar a estabilidade física e química dos ativos e da formulação, bem como

potencializar a ação biológica, permitindo veicular e proteger as substâncias

internalizadas no sistema. Os estudos de desenvolvimento e otimização de sistemas

nanoemulsionados têm sido direcionados para as diferentes vias de administração e

aplicações terapêuticas, com ênfase para o controle do tamanho de fase interna da

emulsão, priorizando a menor concentração de tensoativos e a maior capacidade de

dispersão dos ativos (ALAM et al., 2013; ALI et al., 2012; BERNARDI, 2011;

BIDONE et al., 2014, CHAIITTIANAN; SRIPANIDKULCHAI, 2014; LIANG et al.,

2012; WANG et al., 2008).

Neste contexto, várias espécies vegetais têm sido estudadas como fonte de

novos produtos, como a Rapanea ferruginea, conhecida popularmente como

azeitona-do-mato, entre outros, estudada pelos pesquisadores do Núcleo de

Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí

há mais de 10 anos. O isolamento do ácidos mirsinoico A (AMA), abundante no

extrato dos frutos (COSTA, 2011; GAZONI, 2009), acompanhado da comprovação

de atividades do tipo anticolinesterásica (GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010), citotóxica

e antitumoral (TOMIO, 2011), cognitiva (COSTA, 2011) e antioxidante (BARRETA,

2011) dos extratos e ação anti-inflamatória oral (SOUSA, 2016) do composto AMA,

28

motivaram o desenvolvimento de sistemas nanoemulsionados para veicular e

potencializar o efeito terapêutico do extrato etanólico dos frutos (XAVIER, 2014;

XAVIER et al., 2015; CAZARIN; BRANDALISE, 2016).

O AMA apresenta característica lipofílica, muito pouco solúvel em metanol e

em acetonitrila, susceptível a degradação oxidativa, tanto na forma isolada quanto

no extrato, e fortemente suscetível a degradação quando exposto a radiação visível

(ZERMIANI, 2014). Dentre as principais vantagens das nanoemulsões, destaca-se a

sua função como veículos para a administração fármacos insolúveis, e a de ofercer

proteção contra a instabilidade (BHOSALE et al., 2014). Entretanto, o sistema

nanoemulsionado desenvolvido por Xavier (2014) na ordem de 10 nm de fase

interna, de consistência fluida, contendo 1% do extrato dos frutos de R. ferruginea,

não foi suficiente para proteger o AMA da oxidação e radiação visível. A formulação

apresentou potencial de irritação moderada, atribuído ao percentual de tensoativos

(MISHRA; MISHRA 2012) e ao tamanho manométrico (BRUXEL et al., 2012).

A nanoemulsão desenvolvida por Xavier (2014) apresentou tendência ao

aumento da fase interna ao final do estudo de estabilidade acelerada (90 dias), bem

como a influência do extrato na estabilidade física do sistema, mediante os valores

de potencial zeta.

Os estudos supracitados, referente às características e problemas da

formulação (XAVIER, 2014), e de estabilidade (ZERMIANI, 2014), e ao potencial

farmacológico do extrato por via oral, quanto a atividade antinociceptiva (XAVIER et

al., 2015), aliado aos estudos já reportados na literatura referente a atividade anti-

ínflamatória tópica do extrato (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002), motivaram o

seguimento das pesquisas com estes derivados vegetais.

Assim, este estudo representa a continuidade do desenvolvimento iniciado

por Xavier (2014), e tem por objetivos elevar o tamanho de gotículas da

nanoemulsão anterior, propondo variáveis quantitativas de formulação,

acompanhadas pela avaliação da estabilidade física, química e microbiológica, e

ainda avaliar a atividade anti-inflamatória via oral deste sistema, buscando ampliar o

potencial terapêutico antinociceptivo, pelo estudo da atividade anti-inflamatória das

nanoemulsões contendo extrato dos frutos da R. ferruginea.

29

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Desenvolver sistemas nanoemulsionados contendo extrato mole dos frutos da

Rapanea ferruginea, avaliar a estabilidade e a atividade anti-inflamatória in vivo.

2.2 Objetivos Específicos

Obter e caracterizar a droga vegetal, as soluções extrativas e o extrato mole

dos frutos da Rapanea ferruginea;

Desenvolver sistemas nanoemulsionados (SNE) com variáveis de formulação

(concentrações de óleo, extrato, tensoativo e conservante), monitorando as

modificações na formulação por meio de estudos de estabilidade preliminar e

acelerado;

Caracterizar as formulações quanto ao parâmetros físicos (aspecto visual,

separação de fases após a centrifugação, tamanho médio e índice de

polidispersão da fase interna, potencial zeta e reologia), físico-químicos (pH e

viscosidade) e microbiológicos;

Avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo por via oral, em camundongos, do

sistema nanoemulsionado desenvolvido, extrato dos frutos e composto

isolado (AMA).

30

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Emulsões, microemulsões e nanoemulsões

As emulsões são definidas como sistemas dispersos de fases imiscíveis, onde

uma fase está dispersa na forma de glóbulos (fase interna, descontínua ou dispersa)

é dispersa em outra (fase externa, contínua ou dispersante). Existem duas formas de

emulsões simples, a do tipo óleo em água (O/A), na qual as gotículas de óleo estão

dispersas na água, e a do tipo água em óleo (A/O), na qual gotículas de água estão

dispersas no óleo conforme apresentado na figura 1 (BECHER, 2001; CHEN; TAO,

2005).

As emulsões são sistemas heterogêneos e termodinamicamente instáveis,

estabilizados cineticamente pela adição de emulsionantes, também denominados

agentes tensoativos (FERNANDEZ et al., 2004; MORRISON, 2002). Normalmente,

não se formam espontaneamente, necessitam da energia mecânica do movimento

de agitação e suas propriedades dependem não apenas de condições

termodinâmicas, como também do método de preparação, das características físico-

quimicas da formulação e da ordem de adição de cada componente (LIN;

KURIHARA; OTHA, 1975).

Figura 1: Representação dos glóbulos de emulsão tipo A/O e O/A.

Fonte: McCLEMENTS, 2012.

31

Em geral, uma emulsão é considerada fisicamente instável se a fase interna

ou dispersa tender a formar agregados de gotículas, os quais podem vir a formar

uma camada concentrada de fase interna, ou ainda quando todo ou parte do líquido

da fase interna se separa e forma uma camada distinta na superfície ou no fundo do

recipiente (ALLEN Jr; POPOVICH; ANSEL, 2013).

As alterações como inversão de fases, cremagem, floculação, coalescência e

sedimentação, as quais estão representadas na figura 2, podem estar relacionadas

a fatores externos, aos quais o produto está exposto (temperatura, luz e oxigênio,

umidade, material de acondicionamento e micro-organismos) e a fatores intrínsecos,

os quais estão relacionados à natureza das formulações, tais como,

incompatibilidade física e a incompatibilidade química (dependente do pH e reações

de óxido-redução) e interação entre compostos da formulação e o material de

acondicionamento (ISAAC et al., 2008).

A inversão de fases é uma incompatibilidade física que envolve a mudança do

tipo da emulsão de O/A para A/O ou vice-versa (SINKO, 2008). A figura 2 ilustra os

fenômenos que afetam a estabilidade das emulsões. A floculação é a agregação das

gotículas dispersas em aglomerados frouxos, os quais podem ser redispersos

através da agitação (AULTON, 2005). Outro fator é a cremagem (creaming) a qual é

a separação da emulsão em duas fases, ou seja, pode ocorrer a formação da ―nata

da emulsão‖ ou a migração das gotículas da fase interna para a fase inferior da

emulsão. Isso, por sua vez é causado pela diferença de densidade entre as duas

fases, sendo que a direção no movimento depende da fase interna ser mais ou

menos densa do que a fase externa contínua, sendo esse processo reversível, no

qual a uniformidade da dispersão pode ser restabelecido mediante agitação da

emulsão (SINKO, 2008; ALLEN Jr; POPOVICH; ANSEL, 2013).

32

Figura 2: Esquematização dos fenômenos físico-químicos que podem afetar a estabilidade de nanoemulsões.

Fonte: McCLEMENTS et al. (2005).

A emulsão é um sistema dinâmico, contudo a floculação e a cremagem

representam importantes passos em direção a coalescência, a qual constitui a fusão

das gotículas em gotas maiores até a separação total e definitiva das fases. A

coalescência é um processo irreversível, uma vez que o filme formado ao redor das

gotículas é rompido (THOMSON, 2006; SINKO, 2008).

A presença de luz, a temperatura, o pH, determinados micro-organismos,

assim como a presença de outros fármacos ou excipientes podem vir a causar a

oxidação de um ou mais componentes numa preparação. A oxidação é

frequentemente acompanhada por alterações nas características organolépticas,

sobretudo na cor e odor, e físico-químicas, detectadas pelo pH e condutividade

elétrica (THOMSON, 2006; BOOK, 2007). Assim, justifica-se a necessidade da

adição de antioxidantes em emulsões susceptíveis à degradação devido ao oxigênio

e conservantes antimicrobianos, aqueles susceptíveis à oxidação de origem

microbiológica (AULTON, 2005).

Dependendo do tamanho dos glóbulos, as emulsões podem ser classificadas

em microemulsões, nanoemulsões e macroemulsões (McCLEMENTS, 2012). As

microemulsões, ao contrário das emulsões, são sistemas termodinamicamente

estáveis, opticamente transparentes, isotrópicos e de baixa viscosidade, constituídos

por gotículas de tamanho nanométrico, dispersas em uma fase contínua de um

33

solvente imiscível com a fase dispersa (ANTON; VANDAMME, 2011). De forma

geral, as microemulsões, são estabilizadas por um filme de compostos tensoativos,

geralmente em elevada concentração, localizados na interface de óleo e água

(OLIVEIRA et al., 2004; TADROS et al., 2004).

As nanoemulsões diferenciam-se das microemulsões basicamente em termos

de estabilidade termodinâmica. Apesar de ambas apresentarem componentes e

estruturas semelhantes, as microemulsões apresentam maior estabilidade

termodinâmica. As nanoemulsões são instáveis termodinamicamente, porém

estáveis cineticamente, pois sua cinética de desestabilização é lenta, em torno de

meses. A proporção de emulsionante nas microemulsões é maior, e podem ou não

apresentar a fase dispersa em formato esférico (ANTON; VANDAMME, 2011).

As macroemulsões ou emulsões tradicionais, são sistemas dispersos que

apresentam tamanho de partícula maior do que 1 μm (THAKUR et al., 2012).

Diferem das nanoemulsões por essas possuírem um diâmetro da fase interna ou

glóbulos na faixa de 100 a 500 nm (TEO et al., 2010). Estas apresentam aparência

translúcida quando o tamanho for inferior a 200 nm e leitosa quando se encontra

entre 200 e 500 nm, geralmente são obtidas com concentrações de tensoativos

entre 5 e 10%, menores que as microemulsões (GUGLIELMINI, 2008; TADROS et

al., 2004).

Um dos fatores de extrema importância no desenvolvimento de emulsões é a

seleção do sistema tensoativo para a fase dispersa (MCCLEMENTS, 2012). Os

tensoativos, por sua vez reduzem a tensão interfacial entre as gotículas imiscíveis,

formando um filme ao redor da fase dispersa, com propriedades estéricas ou

eletrostáticas (FERNANDEZ et al., 2004).

Uma das principais propriedades das moléculas tensoativas é a capacidade

de emulsionar dois líquidos imiscíveis. Os tensoativos que apresentam estas

características são chamados particularmente de agentes emulsificantes e atuam

facilitando a emulsificação, bem como estabilizando a emulsão resultante (DALTIN.

2011)

Em 1948, Griffin, estabelceu a relação de Equilíbrio Hidrófilo Lipófilo (EHL)

pela primeira vez, classificando o tensoativo numericamente numa escala de 1 a 20,

segundo as suas características de hidrofilia e lipofilia. Quanto maior o valor de EHL,

maior a hidroficilicidade do tensoativo, que predispõe a formação de emulsões O/A.

No EHL requerido para a fase dispersa, o tamanho do glóbulo é mínimo,

34

proporcionando maior estabilidade do sistema (FLORENCE; ATWOOD, 2003;

LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001).

Considerando a carga da superfície ativa, os tensoativos podem ser

classificados em tensoativos iônicos (aniônicos, catiônicos e anfóteros) e não

iônicos. Os tensoativos iônicos abrangem os tensoativos aniônicos, que possuem

um ou vários grupos ionizáveis em fase aquosa e uma vez dissociados em água

formam íons na superfície ativa carregados negativamente. Os catiônicos possuem

um ou vários grupamentos ionizáveis em fase aquosa, fornecendo íons com cargas

positivas, e os anfóteros: possuem caráter iônico duplo, possuindo propriedades dos

tensoativos aniônicos a altos valores de pH e dos tensoativos catiônicos a baixo

valores de pH (DALTIN, 2011).

Já os tensoativos não iônicos não fornecem íons em solução aquosa e sua

hidrofilia se deve à presença de grupamentos funcionais em suas moléculas, que

possuam forte afinidade pela água (DALTIN, 2011). Estes tensoativos são

amplamente usados devido à baixa toxicidade e estabilidade frente aos aditivos

(FLORENCE; ATWOOD, 2003). Tensoativos não iônicos do grupo dos poloxâmeros

e polioxietileno-sorbitanos (Tweens®) têm se mostrado promissores em combinação

com os fosfolipídeos, pois levam à formação de filmes mistos compactos, conferindo

maior estabilidade à formulação (KUMAR; RAJESHWARRAO, 2011).

Os tensoativos não-iônicos comercialmente conhecidos por Ultramona®

RH400, Alkest® entre outros, são resultantes da reação do óleo de mamona com

óxido de eteno (OE). Estes tensoativos diferenciam-se conforme o grau de

etoxilação, que se dá em função do número de unidades de OE, o que lhe

proporciona diferentes valores de equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL). Aumentando-

se o grau de etoxilação, aumenta-se o caráter hidrofílico da molécula (maior EHL), o

que altera a sua solubilidade em água, permitindo que sejam utilizados como

emulsionantes (ALKEST CSO, 2016).

Emulsões com tamanho de gota em escala nanométrica são frequentemente

referidas na literatura como miniemulsões, nanoemulsões e emulsões ultrafinas (EL-

AASSER; SUDOL, 2004). Nanoemulsões são consideradas verdadeiras emulsões,

com uma fase dispersa e outra dispersante, estabilizados por um sistema tensoativo

adequado (FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA, 2004; GUTIÉRREZZ et al., 2008).

Em função do tamanho de gotícula, as nanoemulsões, apresentam-se com

aparência translúcida quando o tamanho é inferior a 200 nm e leitosa, entre 200 e

35

500 nm (FERNANDEZ et al., 2004; TADROS et al., 2004). Outros trabalhos

delimitam a faixa entre 10 a 100 nm para as nanoemulsões líquidas transparentes

ou translúcidas de baixa viscosidade. A estabilidade se deve principalmente ao

tamanho característico das gotículas, evitando a sedimentação (ASSIS et al., 2012;

FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA, 2004; KOURNIATIS et al., 2010; SONNEVILLE-

AUBRUN et al., 2004).

A preparação das nanoemulsões depende do fornecimento de energia ao

sistema a partir de dispositivos mecânicos, já que são um sistema de não-equilíbrio,

termodinamicamente instável (KENTISH et al., 2008). Os métodos de emulsificação

para se obter nanoemulsões são classificados de alta e baixa energia.

Os métodos que utilizam alta energia de emulsificação são baseados na

geração de energia mecânica, por meio de alta tensão de cisalhamento,

empregando a utilização de homogeneizadores de alta pressão, microfluidizadores

ou ultrassom (KENTISH et al., 2008; KOURNIATIS et al., 2010; NUCHUCHUA et al.,

2009; PUGLIA et al., 2010; SAKULKU et al., 2009). A homogeneização sob alta

pressão, em suas modalidades ―a frio‖ ou ―a quente‖, é um dos processos mais

importantes para obtenção da nanopartículas. Esta é empregada há algum tempo na

indústria para o preparo de emulsões (ASSIS, 2012).

A ultrasonificação é um método de alta energia, rápido e eficiente para gerar

nanoemulsões com baixa polidispersão. O método utiliza um sonotrodo para causar

vibrações mecânicas, com uma frequência superior a 20 kHz, seguido pela formação

acústica de cavitação (BEHREND, 2008; LIN, 2008; NAKABAYASHI et al., 2011).

A emulsificação com baixa energia emprega equipamentos convencionais, e

dependerá das propriedades físico-químicas do sistema e da inversão espontânea

na curvatura do tensoativo para a obtenção de glóbulos de tamanho reduzido

(IZQUIERDO, 2005; SAJJADI; ZERFA; BROOKS, 2006). A inversão de fase da

emulsão (Figura 3) pode se dar pelo aumento da temperatura ou pela alteração da

fração volumétrica (McCLEMENTS; RAO, 2011; SANTANA; PERRECHIL; CUNHA,

2013).

A técnica da temperatura de inversão de fases (Phase Inversion Temperature

– PIT) baseia-se no conceito de inversão transicional da curvatura, particularmente

de tensoativos não iônicos de acordo com a variação da temperatura. Na técnica de

inversão de fases pela alteração da fração volumétrica, a transição do sistema A/O

para O/A ocorre quando a afinidade do tensoativo pela fase aquosa e oleosa

36

alcança o equilíbrio (JAFARI et al., 2004). Além da alteração da fração volumétrica

(Emulsion Phase Inversion – EPI), a mudança de curvatura do tensoativo pode

ocorrer devido a alterações no valor de pH e da concentração de eletrólitos

(MAESTRO et al., 2008; SOLE et al., 2006).

Figura 3: Representação esquemática da técnica de inversão de fases.

Fonte: McCLEMENTS; RAO (2011).

3.2 Métodos de caracterização de nanoemulsões

A avaliação do tamanho médio de fase interna, a microscopia eletrônica de

transmissão, assim como a magnitude do potencial zeta são características

utilizadas para avaliar a estabilidade de uma emulsão (MORAIS et al., 2006).

O tamanho médio de gotícula está sob influência de fatores, como a técnica

de preparação, as propriedades físico-químicas entre os compostos utilizados na

composição, a viscosidade e a tensão interfacial (FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA,

2004).

Geralmente, quanto menor o tamanho dos glóbulos dispersos, maior a

estabilidade do sistema, de modo que o tamanho dos glóbulos dispersos de uma

emulsão determina fenômenos de instabilidade, como floculação e coalescência

37

(JEONG; OH; KIM, 2001).

A determinação do tamanho das gotículas é realizada para monitorar o

desenvolvimento e a otimização dos parâmetros da-e formulação e o processo

emulsificação (BEHREND, 2008; LIN, 2008; NAKABAYASHI et al., 2011). A aferição

do tamanho dos glóbulos após o preparo e durante o período de armazenamento

indica características sobre a estabilidade do sistema, sendo que quanto mais rápido

os glóbulos aumentam de tamanho, menor a estabilidade (ROLAND et al., 2003).

O índice de polidispersão está relacionado com a distribuição do tamanho de

partículas dentro do sistema disperso, assim esse valor indica se formulação tem

distribuição estreita ou polidispersa. Quanto mais polidisperso o sistema, mais

pronunciado será esse mecanismo de instabilidade, pois maior será a diferença de

solubilidade dos glóbulos em dispersão. Nos sistemas dispersos nanoemulsionados

esse parâmetro influencia diretamente na estabilidade da formulação, através do

fenômeno de ―Ostwald ripening‖, que ocorre devido a diferença de solubilidade entre

as partículas (CAPEK, 2004).

O potencial zeta está diretamente relacionado à repulsão eletrostática entre

glóbulos dispersos próximos, sendo um parâmetro que reflete a composição da

interface das nanoemulsões, seja em relação aos tensoativos formadores de filme

interfacial ou em relação a presença de fármacos ou outras moléculas associadas à

interface (MORAIS et al., 2006; SCHAFFAZICK, 2003). Um elevado valor de

potencial zeta em módulo (˃30 mV) é importante para estabilidade físico-química

das emulsões uma vez que forças repulsivas tendem a evitar possíveis agregações

da fase interna (FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA, 2004).

3.3 Desenvolvimento de nanoemulsões contendo derivados vegetais

Nos últimos anos, o avanço no desenvolvimento de novos sistemas de

liberação de ativos, como nanopartículas, nanocápsulas, lipossomas, nanoemulsões,

microesferas, a partir de insumos farmacêuticos ativos vegetais, vem sendo

expandido, com base nas vantagens que os sistemas apresentam sobre as

formulações convencionais, entre elas, o aumento da solubilidade,

biodisponibilidade, proteção contra a toxicidade, potencialização da atividade

farmacológica, aumento da estabilidade e proteção contra degradação física e

38

química (SARAF, 2010).

Vários extratos de plantas e até compostos isolados de extratos, apesar de

terem excelente atividade in vitro demonstram pouca ou nenhuma ação in vivo

devido à sua má solubilidade e/ou tamanho molecular inadequado, resultando em

má absorção e fraca biodisponibilidade. Quando administrados através de novo

sistema de liberação, mostram melhor perfil de absorção que permite atravessar a

membrana biológica, resultando em melhor biodisponibilidade (SARAF, 2010).

Estudos atuais de desenvolvimento de novas formulações contendo insumos

farmacêuticos ativos de origem vegetal, exploram como variáveis, a formulação, o

método de preparação, e os compostos ativos, buscando otimizar o tamanho de

gotícula, a atividade biológica, a estabilidade, bem como adequar ou ampliar as

aplicações para diferentes vias de administração.

Quadro 1: Exemplos de estudos de desenvolvimento de nanoemulsões contento extratos vegetais de 2011 a 2016.

Extrato vegetal

Formulação Tecnologia de obtenção Referência

Óleo de farelo de arroz

Polissorbitato 80 Oleato de sorbitano Polissorbato 60 PEG - 15 Óleo de rícino PEG - 30 PEG – 40

Inversão de fases: Agitação a 600 rpm / 75 ° C

BERNARDI et al. (2011)

Extrato de flores da Allamanda cathartica L.

Triglicerídeos de ácido cáprico e caprílico Óleo de mamona etoxilado hidrogenado a 40 unidades de óxido de eteno – O monooleato de sorbitano Phenonip® (fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno , propilparabeno, butilparabeno, isobutilparabeno)

Inversão de fases: Agitaçao a 600rpm/ 85° C

MULLER (2013)

39

Extrato seco de Calendula officinalis

Polissorbato 85 Água Nanopartículas de ouro revestidas com ácido lipóico Óleo de Nigella sativa Lecitina

1.Ultrassonificação/ 5 min/ 60% de amplitude em banho de gelo

GULER et al. (2014)

Extrato de tomate rico em licopeno

Acetato de etila Tween 20 Água BHT

Emulsificação-evaporação: 1.Agitação a 500 rpm durante 3 h (F.O.) 2.Homogeinização a 5000 rpm/5 min 3.Homogeneização com alta pressão 4.Evaporação do solvente

HA et al. (2015)

Extrato de Achyrocline satureioides

Solução etanólica Lecitina de ovo Octildodecanol

Emulsificação-evaporação: 1.Agitação magnética por 10 min 2. Evaporação do solvente

ZORZI et al. (2015)

Extrato hidroglicólico de Opuntia ficus-indica (L.)

Polissorbato 80 Oleato de sorbitano Triglicerídeos cáprico / caprílico Palmitato de etilhexila Benzoato de alquila Vaselina líquida Fenoxietanol Caprililglicol EDTA dissódico Goma xantana Água destilada

1.Adição da fase oleosa à fase aquosa a 11.000 rpm/ 5 min/ 75 °C 2.Agitação mecânica a 500 rpm durante 2 min em banho de gelo. 3.Adição do extrato e agitação por 2 min

RIBEIRO et al. (2015)

Extrato dos frutos de R. ferruginea

Gérmen de trigo, Vaselina líquida, Triglicerídeos do ácido cáprico e caprílico, Oleato de isodecila, Óleo de silicone. Polissorbato 80, Monoestearato de sorbitano, Monoestearato de sorbitano, Polissorbato, Óleo de mamona etoxilado 15 OE, Óleo de mamona etoxilado 54 OE, Óleo de mamona hidrogenado etoxilado 40 OE

Inversão de fases: Agitação mecânica de 600 rpm / 75 °C

XAVIER (2014);

DUTRA; SANTOS (2016)

40

Extrato das cascas de R. ferruginea

Miristato de isopropila Óleo de mamona hidrogenado 40 EO Monooleato de sorbitano

Inversão de fases: Agitação agitação magnética a 25 ± 2° C por 24 h

DAL MAS (2014)

Óleo de Salvia hispanica L.

Óleo de mamona 15 EO Polissorbato 80 Sepigel® (Poliacrilamida, isoparafina C13-14 e éter láurico-7)

Inversão de fases Agitação a 1000 rpm

WENG (2015)

Bernardi et al. (2011) (Quadro 1) desenvolveram nanoemulsões contendo

óleo de farelo de arroz, como protótipo de tratamento de doenças de pele como

dermatite atópica e psoríase. Foi possível obter nanoemulsões estáveis pelo método

de emulsificação de baixa energia, e formulações com baixo potencial de

irritabilidade in vitro, e melhora da hidratação cutânea in vivo.

Guler et al. (2014) (Quadro 1) desenvolveram nanoemulsões do tipo

óleo/água e água /óleo a base de óleo de Nigella sativa enriquecido com extrato de

Calendula officinalis e nanopartículas de ouro revestidas com ácido lipóico (NP-Au),

respectivamente, evidenciando o efeito superior do nas nanoemulsões contendo

óleo enriquecido com extrato ou nanopartículas, superior às nanoemulsões sem o

extrato ou NP-Au.

Ha et al. (2015) (Quadro 1) desenvolveram nanoemulsões contento extrato de

tomate rico em licopeno, visando preservar a atividade antioxidante e melhorar a

biodisponibilidade do ativo. Os autores avaliaram o efeito da condição de

homogeneização e técnica de emulsificação-evaporação do solvente, sobre as

características físico-químicas do sistema. A maior eficiência quanto a atividade

antioxidante foi proveniente das formulações com tamanho de gotícula entre 100 e

200 nm.

Zorzi et al. (2015) (Quadro1) avaliaram o efeito antioxidante de nanoemulsões

à base de extrato de Achyrocline satureioides (Lam) DC-Asteraceae, como uma

alternativa para formulação tópica contento o extrato etanólico, uma vez que a

aplicação direta do extrato não seria possível. Este estudo desenvolveu

nanoemusões com tamanho médio de gotícula entre 200-300 nm, PDI < 0,2 e

potencial zeta de -43,6 MV, as quais apresentaram-se eficientes para aplicação

41

tópica desejada.

Ribeiro et al. (2015) (Quadro 1) realizaram estudo de estabilidade preliminar e

acelerado aplicado ao desenvolvimento de sistemas nanoemulsionados contendo

extrato hidroglicólico de Opuntia ficus-indica (L.), avaliando a sua eficácia quanto a

hidratação cutânea. As formulações foram estáveis durante os testes preliminares e

acelerados, com pH 4,5-6,0, compatível com o pH da pele, tamanho de gotícula

entre 92,2-233,6 nm, PDI próximo a 0,2 e potencial zeta de -26,71 a -47,01 mV. As

nanoemulsões O/A contendo 1% de extrato de Opuntia ficus-indica (L.)

apresentaram estabilidade adequada durante 60 dias e promoveram aumento da

hidratação da pele por 5 h.

Muller (2013) (Quadro 1) desenvolveu e caracterizou sistemas

nanoemulsionados contento extrato de flores de A. cathartica a fim de avaliar o

potencial antioxidante das formulações. As formulações apresentaram-se como

nanoemulsões, microemulsões e cristais líquidos, sendo as nanoemulsões

caracterizadas com tamanho de gotícula menor que 500 nm, as quais apresentram

atividade antioxidante, porem com influência dos excipientes.

Dal Mas (2015) (Quadro 1) desenvolveu sistemas nanoemusionados contento

extrato mole das cascas de R. ferruginea e avaliou atividade anti-inflamatória tópica.

As formação de nanoemulsões foi confirmada pela análise do tamanho de gotícula a

qual foi de 47 nm, com PDI de 0,228, potencial zeta de -34,7 mV. Em relação a

atividade anti-inflamatória tópica, a formulação desenvolvida apresentou atividade

superior quando compara com creme convencional incorporado o extrato mole das

cascas de R. ferruginea.

Weng (2015) (Quadro 1) realizou estudo de desenvolvimento e estudo de

estabilidade de nanoemulsão contento ativo de origem natural (óleo de chia), a qual

apresentou-se com tamanho de partícula de 81,2 nm e potencial zeta de -18,1 mV.

Foi identificado o aumento do tamanho de gotícula, permanecendo porém, no limite

permitido (150,36 nm) no estudo de estabilidade, sem separação de fases e com os

aspectos organolépticos similares ao do início do estudo.

A aplicação de novas tecnologias ao desenvolvimento de produtos à base de

espécies vegetais, resulta num vasto potencial terapêutico a ser explorado. Contudo,

é notável que a investigação nesta área encontra muitos desafios, sobretudo para

elucidar a caracterização destes sistemas (SARAF, 2010).

42

3.4 Estudo de estabilidade

A estabilidade é definida como o tempo no qual um produto mantém, dentro

dos limites especificados e em todo seu período de utilização, as mesmas

propriedades e características que possuía no momento em que foi obtido. A

estabilidade depende de fatores relacionados ao próprio produto, fatores intrínsecos,

como a composição da forma farmacêutica, as propriedades físico-químicas dos

princípios ativos e excipientes, pH, as impurezas presentes, o tipo e as propriedades

dos materiais de embalagem e do processo empregado na sua obtenção. A

estabilidade também é influenciada por fatores relacionados ao ambiente, os fatores

extrínsecos, como temperatura, umidade, gases (oxigênio, dióxido de carbono) e luz.

O impacto dos fatores extrínsecos na estabilidade pode ser minimizado com o uso

de excipientes específicos, embalagens apropriadas e condições adequadas de

armazenamento (BRASIL, 2004).

O estudo de estabilidade, seja medicamento ou cosmético, deve expor o

produto a condições que acelerem mudanças passíveis de ocorrer durante o prazo

de validade, fornecendo informações sobre a estabilidade do produto no menor

tempo possível (BONTORIM, 2009; BRASIL, 2004; ISAAC et al., 2008).

Os parâmetros a serem avaliados durante o estudo de estabilidade devem ser

capazes de garantir a qualidade do produto e são divididos em parâmetros

organolépticos (aspecto, cor e odor) e de componentes da formulação. A sequência

sugerida de estudos (preliminares, acelerados e de prateleira) tem por objetivo

avaliar a formulação em etapas, buscando indícios que levem a conclusão sobre a

estabilidade. Por fim, a aprovação é dada, após um período determinado, quando

não se verificar nenhuma alteração nas propriedades já mencionadas (BRASIL,

2004).

No guia de estabilidade para cosméticos, recomenda-se submeter o produto

ao teste de centrifugação a 3.000 rpm, durante 30 min, antes de iniciar os estudos

de estabilidade. Considerado pela ANVISA, como teste de triagem, é eficiente para

pré-selecionar as emulsões que devem ser submetidas aos testes de estabilidade

acelerada e de prateleira (BRASIL, 2004). A centrifugação produz estresse na

amostra, simulando um aumento na força da gravidade, e mobilidade das partículas,

as quais poderão ser observadas na forma de precipitação, separação de fases,

coalescência entre outras (BONTORIM, 2009).

43

O estudo de estabilidade preliminar ou teste de curto prazo, segundo o guia

de estabilidade para cosméticos, é realizado através da utilização de condições

extremas de temperatura a fim de acelerar possíveis reações entre seus

componentes, os quais podem resultar em alterações nas características

organolépticas e/ou físico-química. A duração deste estudo é de aproximadamente

quinze dias e a periodicidade de avaliação das amostras pode variar, porém o usual

é que sejam avaliadas inicialmente, no tempo zero e durante todos os dias em que

estiverem submetidas às condições do estudo. Geralmente as amostras são

submetidas a ciclos alternados de resfriamento (refrigeradores) e aquecimento

(estufa) (BRASIL, 2004). É um estudo preditivo que pode ser empregado para

estimar o prazo de validade do produto. As formulações são submetidas a condições

menos extremas, como aquecimento, resfriamento, exposição a radiação luminosa e

a temperatura ambiente (SINKO, 2008).

O teste de estabilidade acelerada, segundo o guia de estabilidade de produtos

cosméticos, tem duração de noventa dias, porém pode ser estendido para seis

meses ou um ano, em função das características do produto a ser analisado. A

periodicidade da avaliação das amostras pode variar, porém o mais usual é que

sejam avaliadas inicialmente no tempo zero (24 h) e aos 7, 15, 30, 60 e 90 dias.

Caso o estudo se prolongue por mais tempo, recomendam-se avaliações mensais

até seu término (BRASIL, 2004).

Neste mesmo guia, os valores de temperatura, geralmente adotados, para

realizar esses testes são 37 °C, 40 °C, 45 °C ou 50 ± 2 °C, para temperaturas

elevadas. Para baixas temperaturas, emprega-se geladeira 5 ° ± 2 °C ou freezer –5

± 2 °C ou –10 ± 2 °C. Para os ciclos de 24 h, usa-se alternar as temperaturas de 40

± 2 °C e 4 ± 2° C a cada 24 h (BRASIL, 2004).

O protocolo para o estudo de estabilidade para medicamentos é guiado pela

Resolução - RE nº 1, de 29 de julho de 2005, que indica as condições de

temperatura e umidade, nas quais a amostra deve ser mantida para avaliar a

estabilidade. Estas condições variam conforme a forma farmacêutica, tipo de

embalagem, e condições normais de armazenamento, com a duração de doze

meses nas condições de longa duração e seis meses para estabilidade acelerada.

Para as formas farmacêuticas líquidas, quando armazenadas em embalagem

impermeável, entre 15 a 30 °C, são preconizadas as condições para o estudo de

estabilidade a temperatura de 40 °C ± 2 °C, no estudo de acelerado e a 30 °C ± 2 °C

44

no estudo de longa duração. Se as condições de armazenamento forem de 2 a 8 °C,

então o estudo deve ser conduzido a 25 °C no estudo acelerado e a 5 °C no de

longa duração (BRASIL, 2005).

3.5 Rapanea ferruginea

A espécie Rapanea ferruginea apresenta sinônimias como Myrsine floculosa,

Myrsine coreacea e Gaballeria ferruginea (LORENZI, 1992; LORENZI, 2000).

Recentemente, características botânicas reclassificaram esta espécie, que passou

da família Myrsinaceae para a Primulaceae (FREITAS; KINOSHITA, 2015).

O gênero denominado Rapanea é representado morfologicamente por

árvores de pequeno a médio porte, folhas simples alternadas no caule, encontrado

perto de áreas litorâneas (LORENZI, 2000). A R. ferruginea é uma espécie

pantropical e possui ampla distribuição pelo território brasileiro, nos estados da

Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa

Catarina e Rio Grande do Sul, bem como em outros países da América do Sul como

a Bolívia, México, Argentina, Paraguai e Uruguai (SPATHELF et al., 2001).

A R. ferruginea, representada na Figura 4, é popularmente conhecida como

canela-azeitona, azeitona-do-mato, camará, capororocaçu, capororoca-vermelha,

pororoca, capororoca, capororoca-mirim. É uma árvore de pequeno a médio porte

(Figura 4), floresce duas vezes ao ano e ocorre em quase todas as formações

vegetais, preferencialmente nas encostas e beiras de córregos. Os frutos são

pequenos (Figura 4), geralmente com 3-5 mm diâmetro, globulosos e de coloração

negro-arroxeada quando maduros, apresentando uma única semente e um

pericarpo delgado (PASCOTTO, 2007). Os frutos maduros são produzidos

anualmente em grande quantidade, possuem alto poder de germinação e servem de

alimento para diversas aves (SPATHELF et al., 2001).

45

Figura 4: Imagem da Rapanea ferruginea e frutos.

Fonte; ZERMIANI, 2015 Fonte: KUHLMANN, 2012

Plantas da família Myrsinaceae são conhecidas por apresentar inúmeras

propriedades farmacológicas interessantes, como atividades anti-inflamatória,

antiviral, antitumoral, citotóxica e leishmanicida (AL-MEKHLAFI et al., 2012).

Com relação aos aspectos farmacológicos do gênero Rapanea, os extratos e

seus compostos isolados possuem comprovada ação anti-inflamatória (MANGURO

et al., 2003; MIZUSHINA et al., 2000), citotóxica (CORDERO et al., 2004),

antinociceptiva (MOMTAZ; LALL; BASSON, 2008), antioxidante (MAKABE et al.,

2003), anti-tuberculose (LALL; MEYER, 1999), entre outras.

Pesquisas com a Rapanea ferruginea, conduzidas no Núcleo de

Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) – UNIVALI, tem mostrado

resultados promissores com extratos ou compostos isolados das partes aéreas, nos

últimos dez anos.

A espécie R. ferruginea apresenta uma concentração significativa de ácidos

benzoicos prenilados, conforme evidenciado nos primeiros trabalhos do grupo, a

partir de 2006 (HESS, 2006), com o isolamento ácido mirsinoico B (AMB) das cascas

do caule, e posteriormente, do ácido mirsinoico A (AMA) dos frutos (GAZONI, 2009).

Estes ácidos apresentam-se como os principais componentes do metabolismo

secundário desta espécie (Figura 5). O AMA é um composto fenólico encontrado

principalmente nos frutos, enquanto o AMB está em maior concentração em outras

partes da R. ferruginea, como nas cascas (Figura 5) (COSTA, 2011).

46

Figura 5: Estrutura química dos ácidos mirsinoicos A e B, respectivamente.

Fonte: XAVIER, 2014

Por meio de procedimentos cromatográficos com o extrato etanólico das

folhas e cascas dos caules da R. ferruginea, Gazoni (2009) isolou além do AMB, o

espinasterol, um ácido graxo de cadeia longa e um álcool de cadeia longa, e do

extrato etanólico dos frutos, isolou-se o AMA. Ambos os ácidos mirsonoicos e

espinasterol mostraram atividade anticolinesterásica (GAZONI, 2009).

Adicionalmente, estudos in vitro, utilizando tecidos cerebrais de ratos, demonstraram

que o AMA apresentou atividade superior ao AMB em todos os tecidos cerebrais,

revelando-se um composto promissor para melhora da transmissão colinérgica,

obtido de fontes naturais (FILLIPIN, 2010).

A atividade antitumoral e a citotoxicidade dos extratos etanólicos das cascas,

galhos, folhas e frutos bem como os compostos isolados da R. ferruginea (AMA,

AMB, AMC e derivados de AMB) foram investigadas por meio de ensaios in vitro e in

vivo de crescimento tumoral. Todos os compostos apresentaram níveis significativos

de citotoxicidade em concentração de 100 μg/mL para algumas das linhagens

celulares testadas, indicando a espécie como fonte promissora para o

desenvolvimento de moléculas bioativas frente às células tumorais (TOMIO, 2011).

Em estudos realizados com extrato diclorometano dos frutos da R. ferruginea

e com seus compostos isolados (AMA e AMB) sobre a memória de animais normais

e animais com doença de Alzheimer induzida, foi possível constatar melhora da

cognição nos animais tratados com o extrato de R. ferruginea, podendo estar

relacionada com a atividade farmacológica dos compostos isolados AMA e um

triglicerídeo não-identificado (TGL) (COSTA, 2011).

A avaliação da atividade antioxidante dos extratos etanólicos das cascas e

47

frutos e dos compostos isolados (AMA, AMB e AMC) da R. ferruginea foi realizada,

empregando os métodos radicalares indiretos: ORAC (capacidade de absorção do

radical oxigênio); DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina); ABTS+.(2,2‘-azino-bis-(3-

etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico); quantificação de fenólicos totais e teste de

quelação de metais. Os resultados demonstraram que tanto os extratos como os

compostos isolados apresentam potencial antioxidante significativo na concentração

de 10 μg/mL (BARRETTA, 2011).

Quadro 2: Relação entre os compostos isolados e atividade farmacológica da R. ferruginea.

Parte da Planta

Composto / Tipo de extrato

Atividade Modelo Referência

Cascas dos caules

AMB composto isolado

Antinociceptiva in vivo HESS (2006)

Frutos, folhas e

cascas dos caules

AMA, AMB, espinasterol/extrato

etanólico Anticolinesterásica

Bioautográfico e in vitro

GAZONI (2009)

Frutos, folhas e

cascas dos caules

AMA e AMB/extrato

etanólico Anticolinesterásica In vitro FILLIPIN (2010)

cascas dos caules, folhas e frutos

AMA, AMB, AMC, derivados/extrato

etanólico

Citotóxica e antitumoral

In vivo e in vitro

TOMIO (2011)

Frutos

AMA e triglicerídeo (TGL) não

identificado/extrato diclorometano

Cognitiva In vivo e in

vitro COSTA (2011)

cascas dos caules e frutos

AMA, AMB, AMC/extrato

etanólico Antioxidante In vitro

BARRETTA (2011)

Frutos AMA /extrato

etanólico Anti-inflamatória In vivo SOUSA (2016)

Zermiani (2015) realizou estudo de caracterização física, química e físico-

química (solubilidade, ponto de fusão, pKa, log P, espectroscopia por infra-vermelho-

48

IV, no ultra-violeta-UV, RMN de 1H e 13C, pureza, umidade e testes de degradação

forçada) dos marcadores AMA e AMB, presentes nos frutos e cascas dos caules,

respectivamente, da R. ferruginea. Além disso, desenvolveu e validou metodologias

por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação dos

marcadores em extratos e nanoemulsões. A caracterização dos marcadores mostrou

que o AMA é muito pouco solúvel e o AMB pouco solúvel em metanol e acetonitrila.

Ambos foram praticamente insolúveis em água. O AMA apresenta-se como um óleo

e o AMB apresentou-se sólido, com uma estrutura semi-cristalina com estruturas

ortorrômbicas e amorfas por MEV. Os resultados obtidos nesse estudo em relação

ao conhecimento das propriedades físico-químicas, bem como os métodos validados

para determinação do teor de AMA e AMB nos extratos e em nanoemulsões,

contribuiu para o desenvolvimento, controle de qualidade e padronização de novos

fitofármacos e fitoterápicos.

A padronização dos extratos obtidos dos frutos teve início com o trabalho de

Krachinski et al. (2014), resultando no desenvolvimento e otimização de soluções

extrativas hidroalcoólicas e extratos moles, a partir de diferentes graus alcoólicos,

tempo de extração e relação droga:solvente. O teor de marcadores (ácido mirsinoico

A - AMA) foi proporcional ao grau alcoólico. A otimização da extração indicou o

álcool 90ºGL ou 95% P.A como melhor sistema solvente, sendo apenas dependente

da relação droga:solvente. Apenas os extratos obtidos com o álcool 95% P.A. (10h/

5% planta:solvente; 5h/ 10% planta solvente) não foram citotóxicos in vitro, segundo

a avaliação da viabilidade celular por MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazólio]). Os extratos corroboraram a atividade antioxidante pelo método

DPPH, já relatada por Barreta (2011) e Xavier (2014), sendo proporcional ao grau

alcoólico, e consequentemente ao teor de AMA.

O desenvolvimeto de nanoemulsões contendo extrato dos frutos da R.

ferruginea teve incío com o trabalho de Xavier (2014), Santos e Dutra (2016), que

realizaram as etapas de seleção do óleo para incorporação do extrato mole dos

frutos da R. ferruginea. Estes estudos prévios cuminaram na seleção do óleo

triglicerideo de ácidos cáprico e caprílico, no sistema tensoativo, e na melhor

condição de emulsificação para nanoemulsão contento extrato mole dos frutos de R.

ferruginea, descritos a seguir. A determinação da fase oleosa foi através da

avaliação da solubilidade do extrato mole da R. ferruginea em diferentes óleos,

sendo eles o gérmen de trigo, a vaselina líquida, os triglicerídeos do ácido cáprico e

49

caprílico, o oleato de isodecila e o óleo de silicone. O EHL requerido pela fase

oleosa foi estabelecido, testando-se um sistema binário de tensoativos hidrofílico

(polissorbato 80, com EHL 14,9) e lipofílico (monoestearato de sorbitano, com EHL

4,3), com valores de EHL entre 6 e 11, monoestearato de sorbitano, polissorbato,

óleo de mamona etoxilado 15 OE (óxido de eteno), óleo de mamona etoxilado 54 OE

e óleo de mamona hidrogenado etoxilado 40 OE. Quanto aos métodos de

emulsificação, as variáveis testadas incluíram as condições de agitação e

temperatura para a incorporação do extrato. O sistema tensoativo escolhido foi

composto por monoestearato de sorbitano e óleo de mamona hidrogenado etoxilado

40 OE, com EHL 11, usando o método de emulsificação de baixa energia, com

agitação mecânica a 600 rpm, temperatura de 75 °C, com a adição do extrato na

fase oleosa, sem o polímero espessante.

Xavier (2014) deu continuidade ao desenvolvimento, aplicando o diagrama

ternário para selecionar a proporção de óleo, tensoativo e água, que resultasse em

nanoemulsões estáveis. Nesse estudo, foram obtidos sistemas nanoemulsionados

(SNE), caracterizados por microscopia de transmissão eletrônica, tamanho médio de

gotículas e potencial zeta. Dentre eles, foi selecionado para o estudo de estabilidade

o SNE, contendo 1% de extrato mole dos frutos de Rapanea ferruginea, 10% de

tensoativos (Ultramona® e Span®), 5% de Polymol®, 0,5% de conservante com um

tamanho médio de gotícula de 10 nm. O estudo de estabilidade mostrou que ocorre

uma tendência ao aumento de tamanho de fase interna e indício de contaminação

microbiológica ao final de 90 dias. Quanto aos indicadores de atividade e segurança

biológica, a formulação foi avaliada quanto a atividade antinociceptiva via oral,

revelando-se mais potente que o extrato e AMA isolado, na dose de 100 mg/kg, em

camundongos. Porém, o SNE apresentou irritação moderada pelo teste de agarose

overlay, provavelmente atribuída à composição rica em tensoativos da formaulçao,

uma vez que o extrato mole não mostrou irritação no mesmo teste.

Custodio Junior (2016) avaliou a estabilidade física, química e microbiológioca

da nanoemulsão desenvolvida por Xavier (2014), contendo extrato dos frutos verdes

da R. ferrugínea. O estudo de estabilidade foi realizado em três temperaturas

diferentes 40 ºC, 30 ºC e 5 ºC ± 2ºC, durante 60 dias com amostragens em 0 (24 h),

45 e 60 dias. Os sistemas nanoemulsionados demonstraram valores de pH, tamanho

de gotícula , PDI e potencial zeta entre tempo zero (24h) e 90 dias com variações

entre 5% e 10%, mantendo-se relativamente estáveis neste período. O teor de AMA

50

mostrou-se estável nos diferentes ambientes com oscilações menores do que 10%

no período de 45 dias..

Sousa (2016) avaliou as propriedades anti-inflamatórias da Rapanea

ferruginea in vivo, utilizando o modelo de bolsa de ar, tratados com extrato mole dos

frutos da R. ferruginea, via oral,nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg e nanoemulsões

contendo este extrato nas doses de 3, 30 e 100 mg/kg. A formulação de NE avaliada

por Sousa (2016) foi desenvolvida por Xavier (2014), contendo 1% de extrato mole

dos frutos de Rapanea ferruginea, 10% de surfactante (Ultramona® e Span®), 5% de

Polymol®, 0,5% de conservante com um tamanho médio de gotícula de 10 nm. O

extrato e a nanoemulsão inibiram a migração de leucócitos e neutrófilos para a

cavidade formada. No entanto, a nanoemulsão nas doses de 30 e 100 mg/kg

apresentou maior atividade anti-inflamatória que o extrato. Os resultados sugerem

que o extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea possui atividade anti-

inflamatória e que a formulação de nanoemulsão potencializou a atividade anti-

inflamatória.

O mesmo sistema nanoemulsionado desenvolvido por Xavier (2014) contendo

extrato etanólico dos frutos de R. ferruginea, foi avaliado quanto ao efeito sobre a

memória de animais normais e com Doença de Alzheimer (DA) induzida por

peptídeo amiloide Aβ1-42. Este estudo foi realizado por Cazarin e Brandalise (2016),

que avaliaram a nanoemulsão como veículo para o extrato, levando em conta o

efeito anteriormente comprovado sobre a atividade cognitiva para o extrato e

compostos isolados (COSTA, 2011). A avaliação do desempenho motor foi feita

utilizando o modelo de Open Field. Os animais com DA induzida foram tratados por

sete dias com NE de R. ferruginea nas doses 0,1, 0,5 e 1,0 mg/Kg e veículo (salina)

e submetidos a diferentes modelos de memória. Resultados obtidos mostraram que

o tratamento com a NE produziu efeito nootrópico em animais normais e com DA,

sem afetar o sistema motor, apontando a R. ferruginea como potencial insumo

farmacêutico ativo vegetal para a DA (CAZARIN; BRANDALISE, 2016).

Todos estes estudos relacionados às promissoras propriedades

farmacológicas do extrato dos frutos e compostos isolados, bem como os problemas

relacionados a estabilidade dos mesmos, tem motivado o seguimento das

pesquisas, empregando a nanotecnologia como plataforma tecnológica no

aprimoramento da performance dos produtos obtidos.

51

3.6 Inflamação e resposta inflamatória

A inflamação é um processo patofisiológico que ocorre em resposta a um

agente lesivo por meio da ativação de resposta imune humoral e celular. A

exposição a um patógeno induz a migração de células circulantes, que são

direcionadas pela produção de substâncias quimiotáticas no sítio de lesão

(CRUVINEL et al., 2010; HEADLAND; NORLING, 2015; NOURSCHARGH; ALON,

2014). O processo inflamatório tem como principal objetivo a resolução da infecção

ou reparação ao dano tecidual, com estabelecimento do estado de homeostasia

(BARTON, 2008; JONES et al., 2016; SOSA et al., 2002; SUGIMOTO et al., 2016).

Em decorrência da instalação do processo inflamatório, a área inflamada que

apresenta sinais clínicos como rubor, calor, edema, dor e prejuízo funcional

(CRUVINEL et al., 2010).

As células do sistema imune em conjunto com mediadores químicos

secretados desenvolvem a resposta de defesa contra micro-organismos infecciosos

ou substâncias estranhas. A capacidade migratória das células do sistema imune,

permite a interação entre o sangue periférico, a circulação linfática e os tecidos, o

que é de fundamental importância para formação de resposta imune inata e

adaptativa, bem como a inflamação (ABBAS et al., 2011).

A inflamação pode ser classificada como aguda e crônica, sendo a inflamação

aguda relativamente de curta duração, caracterizada por vasodilatação, exsudação

plasmática e migração de células. Dentre estas, o neutrófilo é a primeira célula em

alcançar o foco inflamatório, desta forma, desempenha um papel crítico no processo

inflamatório. Os neutrófilos estão em maior número no sangue periférico de

humanos, o que permite que sua locomoção em maior número e velocidade para o

foco de lesão, sendo esta fase parte da resposta imune inata (KIM; LUSTER, 2015).

A inflamação crônica, por sua vez, é caracterizada por um tempo de resolução

prolongado e até mesmo sem resolução, onde a inflamação está ativa e a destruição

e a reparação tecidual ocorrem simultaneamente, apresentando histologicamente

infiltração de células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos) e fibrose

tecidual (JONES et al., 2016; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; SUGIMOTO

et al., 2016 ).

A inflamação pode induzir, manter ou agravar muitas doenças devido a sua

complexidade e o envolvimento de mediadores inflamatórios (SOSA et al., 2002).

52

Além disso, a inflamação é o processo de base de diferentes doenças, como

doenças cardiovasculares, neurológicas, câncer, diabetes, entre outras (MÓCSAI;

WALZOG; LOWELL, 2015), o que evidencia a importância do conhecimento

molecular e celular do processo inflamatório nas diferentes patologias, bem como a

busca por fármacos com propriedade anti-inflamatória.

A resposta inflamatória gerada pelo sistema imunológico tem a finalidade de

remover o estímulo indutor da resposta e iniciar a recuperação tecidual do local

agredido (CRUVINEL et al., 2010; JONES et al., 2016; ORTEGA-GÓMEZ;

PERRETTI; SOEHNLEIN, 2013; SUGIMOTO et al., 2016). A resposta inflamatória

tem início imediatamente após o dano, quando as células residentes do tecido

lesado são estimuladas e a fase vascular é iniciada, havendo a vasodilatação local e

aumento da permeabilidade capilar, mediados por aminas vasoativas, como a

histamina e serotonina, liberadas por mastócitos e monócitos. Estes eventos

permitem que um exsudato rico em proteínas e água extravase para o espaço

extravascular. Além disto, o endotélio ativado passa a expressar moléculas de

adesão de superfície que favorecem a aderência e migração de leucócitos para o

tecido lesado. Também são ativados componentes do sistema complemento, de

cininas e de coagulação. Adicionalmente, os macrófagos residentes no tecido lesado

liberam citocinas inflamatórias, como IL-1β, TNF-α e quimiocinas, que facilitará de

maneira coordenada a migração de leucócitos para o foco inflamatório (CRUVINEL

et al., 2010; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013).

A mobilização leucocitária entre os diferentes compartimentos, medula óssea,

sangue periférico e tecido, é um evento fundamental para uma resposta imune

adequada. Durante o processo inflamatório, o tráfego de leucócitos é modificado e,

na maioria das vezes, o que se observa é a exacerbação do processo fisiológico,

para que os leucócitos se locomovam em maior número e com maior velocidade

entre os diferentes compartimentos para alcançarem o sítio de agressão. Neste

contexto, na reação inflamatória ocorre mobilização celular dos compartimentos de

reserva e recrutamento sequencial destas células no curso do processo – neutrófilos

seguidos pelas células mononucleares e eosinófilos (KOLACZKOWSKA; KUBES,

2013).

A migração leucocitária (Figura 6) acontece com a ativação do endotélio. As

selectinas permitem a adesão fraca dos neutrófilos, as integrinas promovem a

adesão forte e as quimiocinas ativam e estimulam a migração dos neutrófilos para o

53

foco inflamatório. Estas interações fazem com que os neutrófilos rolem pela parede

do vaso e sejam expostos aos fatores quimiotáticos. O gradiente quimiotático

crescente direciona a migração dos neutrófilos ao sítio inflamatório.

Simultaneamente a este processo, os mediadores lipídicos, derivados do ácido

araquidônico, também são produzidos em consequência da ativação de fosfolipases,

que clivam fosfolipídios constituintes da membrana celular, gerando prostaglandinas,

leucotrienos e PAF (fator de ativação plaquetária). Este processo se inicia com um

dano à membrana celular, que é constituída fundamentalmente por fosfolipídios.

Quando uma lesão afeta esta membrana, a enzima fosfolipase A2, presente nos

leucócitos e plaquetas, é ativada por citocinas pró-inflamatórias como a interleucina

IL-1. Esta enzima leva à degradação dos fosfolipídios, resultando na produção de

ácido araquidônico. Este, ao ser metabolizado, forma os leucotrienos, pela ação da

enzima lipooxigenase, e também forma prostaglandinas, prostaciclinas e

tromboxanos, pela ação da enzima ciclooxigenase (HILÁRIO; TERRERI; LEN, 2006;

MESQUITA Jr et al., 2008).

Figura 6: Mecanismos de migração dos leucócitos para o sítio inflamatório. (A) detalhe e (B) visão geral das etapas da migração: 1. Rolamento, 2. Ativação das integrinas, 3. Adesão estável e 4. Migração/diapedese.

Fonte: MESQUITA Jr et al. (2008).

54

Os neutrófilos são indispensáveis para a resposta do hospedeiro e

desempenham papel chave no sistema imune inato, já que respondem prontamente

a estímulos inflamatórios, com rápida mobilização da medula para o sangue, o que

permite rápida migração para a área lesada (DUCHENE et al., 2007; HAYHOE et al.,

2006; NATHAN, 2002).

Por muito tempo, os neutrófilos assumiram o papel de células efetoras da fase

aguda da resposta inflamatória, no entanto, o papel importante destas células na

fase de resolução do processo inflamatório e restabelecimento da homeostasia tem

sido demonstrado (JAILLON et al., 2013). A resolução do processo inflamatório é

importante para o retorno da homeostasia, pois limita a injúria excessiva do tecido e

previne o desenvolvimento de inflamações crônicas. Este processo ocorre

primeiramente com a supressão na liberação de mediadores pro-inflamatórios,

indução da secreção de mediadores anti-inflamatórios, incluindo IL-10 e TGF-1β,

liberação de enzimas proteolíticas e mediadores lipídicos. A mudança para um

ambiente anti-inflamatório facilita a apoptose dos neutrófilos, os quais são

fagocitados (eferocitose) por macrófagos residentes. Após a fagocitose, os

macrófagos são estimulados para a secreção de altos níveis de mediadores, como

as resolvinas, lipoxinas e sirtuinas (LEE; SURH, 2012; ORTEGA-GÓMEZ et al.,

2013).

55

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1 Droga vegetal

Frutos da R. ferruginea foram coletados, gentilmente pela profª Drª Angela

Malheiros, no município de Blumenau, Rua Belo Horizonte, Santa Catarina, Brasil

(Latitude: 26°97‘69,66‖ S, longitude: 49/06‘24,31‖ O e altitude: 200 m), em 18 de

agosto e 02 de outubro de 2014. Uma exsicata desta espécie está depositada no

Herbário Barbosa Rodrigues em Itajaí sob o código HBR 52715.

4.1.2 Reagentes e materiais

Acetato de etila P.A. ACS, Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;

Acetonitrila grau HPLC, J.T. Baker;

Ácido acético Glacial P.A., Biotec;

Ácido clorídrico P.A., Vetec Química Fina;

Ácido fosfórico, Merck® lote: K36616573641;

Ácido mirsinoico A (AMA), obtido por isolamento a partir dos frutos de R.

ferruginea no laboratório de Fitoquímica da Univali;

Ácido mirsinoico B (AMB), obtido por isolamento no laboratório de Fitoquímica

da Univali;

Ágar Salmonela Shigella (Ágar SS);

Ágar dextrose batata (PDA);

Ágar caseína de soja (TSA);

Ágar Violet Red Bile Dextrose (VRBD);

Ágar McConkey;

Água purificada obtida por sistema de purificação de osmose reversa,

Gehaka;

56

Água ultrapurificada, Barnstead – Easy pure LF;

Álcool etílico absoluto P.A. ACS, Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;

Alkest® CSO 400, Oxiten®;

Anisaldeído sulfúrico;

Caldo lactosado;

Cloridrato de Ketamina;

Cloridrato de Xilazina;

Cromatoplacas de sílica gel 60 GF 254, 20 μm de espessura, Merck®;

DMSO (dimetilsulfóxido) P.A., Dinamica;

EDTA dissódico, Merck;

Filtros de membrana de celulose (0,45 μm), Millex®;

Filtros de membrana de celulose (47 mm x 0,45 μm), Sartorius Stedim®;

Hexano (mistura de isômero) P.A., Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;

Indometacina, Fagron;

Liquido de Turk;

Meio DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium), Cultilab;

Metanol grau HPLC, J.T. Baker;

Phenonip® (Phenoxietanol parabenos), Pharma Special;

Polymol® (Triglicerídeos do ácido cáprico e caprílico), Mapric Produtos

Farmacosméticos;

Salina 0,9%;

Span 80® (monooleato de sorbitano), Sigma-Aldrich;

Tampão fosfato;

Tampão salina fosfato;

Ultramona RH400® (óleo de mamona etoxilado hidrogenado a 40 mols de

óxido de eteno OE), Oxiteno.

4.1.3 Equipamentos

Agitador magnético (Constant Temperature Magnetic Stirrier) – 78HW-1

(Vertex);

Agitador mecânico – 713D (Fisatom);

Agitador de tubos Vortex – QL-901 (Biomixer);

57

Autoclave vertical (Phoenix);

Balança analítica – AY220 (Shimadzu);

Balança analítica– AG204 (Mettler Toledo);

Balança analítica (Denver Intrument);

Balança analítica (Ohaus – Precision Plus);

Balança analítica – 250A (UMark);

Balança digital – AS2000 (Marte)

Bomba de vácuo;

Banho de ultrassom- USC 5000 (Unique);

Banho de aquecimento com circulação – MA159 (Marconi);

Cabine de Fluxo Laminar (Veco);

Câmara de Neubauer;

Centrífuga – Z300 (Hermle);

Centrífuga excelsa baby II – 206-R (Fanem);

Chapa de aquecimento (Fisatom);

Chapa de aquecimento (Ética);

Coluna Kinetex C18(150 X 4,6 mm X 2,6m);

Compressor aspirador FANEM – 089-CAL;

Conjunto de tamises (Bertel);

Cromatógrafo (CLAE) com bomba (LC-20AT) (Shimadzu);

Cromatoplacas de sílica gel 60 F254 (Merck);

Destilador de água – MA-255 (Marconi);

Espectrofotômetro UV - Vis UV-1601PC (Shimadzu);

Estufa – 316B25 (Quimis);

Estufa CO2 (Ultra-Safe);

Estufa de cultura/controlador microprocessado – 502C (Fanem);

Geladeira – 280 L (Consul);

Incubadora de Bancada – 400 (Gefran);

pHmetro – DM 20 (Digimed) ;

Moinho – MA085 (Marconi);

Mufla – 318D24 (Quimis);

Rota-evaporador - E5CSZ (Omron – Fisatom)

Rota-evaporador – TE-211 (Tecnal);

Sensor SV-DIN;

58

Sonicador ultra Cleaner – 800 A (Unique);

Tecidos Sontara® (Dupont);

Termocontrolador Haake® DC30;

Viscosimetro rotacional UT 550 Haake®;

Zetasizer Nano ZS – Zen3600 (Malvern Instruments).

4.2 Métodos

4.2.1 Tratamento da droga vegetal

Após recebimento, os frutos foram separados dos caules, pesados, e

mantidos em bandejas na sala de secagem, para secagem no período de uma

semana. Após as etapas de triagem e secagem, os frutos foram moídos em moinho

de martelos com abertura de malha de 1 mm.

4.2.2 Caracterização da droga vegetal

4.2.2.1 Análise granulométrica

Cerca de 25,0 g da droga vegetal triturada foram submetidos à passagem por

tamises, com aberturas de malhas de diferentes tamanhos (0,150; 0,250; 0,500;

0,850; 1,40; 2 mm). A tamisação foi realizada a 50 vibrações por segundo, durante

15 min. Em seguida, as frações retidas nos tamises e no coletor foram pesadas.

(BRASIL, 2010). Esta análise foi realizada em duplicata. Os resultados foram

representados pela porcentagem retida em cada tamis e tamanho médio de

partículas, segundo as equações 1 e 2.

59

(1) (2)

Onde: P1= peso da amostra retida em cada tamis (g); P2= soma dos pesos retidos

em cada tamis e no coletor (g); 100 = fator de porcentagem.

Onde dmédio = diâmetro médio aritmético (mm); AM = abertura média de malha (mm)

e a Fr% = fração retida percentual em cada tamis.

4.2.2.2 Perda por dessecação

Cerca de exatamente 1,0 g da droga vegetal foi transferida e distribuída

uniformemente em cadinho, previamente dessecado em estufa a 105 °C por 2 h. Em

seguida, o cadinho contendo a amostra foi colocado em estufa a 105 °C por 2 h.

Após este tempo, o cadinho foi resfriado à temperatura ambiente em dessecador e

pesado. O procedimento foi repetido por períodos de 30 min de secagem até peso

constante, para cálculo da porcentagem de perda por dessecação da amostra em

relação à droga inicialmente pesada. Os resultados representam a média de três

determinações (BRASIL, 2010)

4.2.2.3 Determinação de cinzas totais

Cerca de exatamente 3,0 g da droga vegetal foram transferidos e distribuídos

uniformemente em cadinho, previamente dessecado em estufa a 105 °C por 2 h. As

amostras foram incineradas aumentando gradativamente a temperatura, até que

todo o carvão fosse eliminado. O gradiente de temperatura usado foi 30 min a 200

°C, 60 min a 400 °C e 90 minutos a 600 °C. Após este tempo, o cadinho foi resfriado

à temperatura ambiente em dessecador, e pesado para cálculo da sua porcentagem

em relação à droga seca ao ar (BRASIL, 2010).

60

4.2.2.4 Determinação de cinzas insolúveis em ácido

Após a determinação das cinzas totais, o resíduo obtido foi fervido durante 5

minutos com 25 mL de solução de ácido clorídrico a 7% em cadinho coberto com

vidro de relógio. Após, o vidro de relógio foi lavado com 5 mL de água quente,

juntando esta água ao cadinho com resíduo. O resíduo insolúvel em ácido foi retido

sobre papel de filtro isento de cinzas, lavando-o com água quente até que o filtrado

se tornasse neutro. O papel de filtro contendo o resíduo foi transferido para o

cadinho original, seco sobre chapa quente e incinerado em mufla, a cerca de 500 ºC

por 2 horas, até peso constante. A porcentagem de cinzas insolúveis em ácido foi

calculada em relação à droga seca ao ar (BRASIL, 2010).

4.2.3 Obtenção da solução extrativa e extrato mole

A solução extrativa foi preparada na proporção planta/solvente 5% (m/V),

empregando como solvente etanol 95% P.A, pelo método de maceração dinâmica,

em agitador mecânico na velocidade de 300 rpm, à temperatura ambiente, durante 5

h, conforme estabelecido em estudos anteriores (KRACHINSKI, 2014; XAVIER,

2014) A solução extrativa foi filtrada em papel filtro qualitativo, em filtro de Büchner

acoplado à bomba a vácuo, acondicionada em frasco de vidro âmbar e armazenada

à temperatura ambiente. Para obtenção do extrato mole, a solução extrativa foi

submetida ao aquecimento em banho de água a 50 °C em rotaevaporador, com

auxílio de vácuo, até evaporação máxima do solvente em sistema à vácuo,

permanecendo em aquecimento em banho de água a 45 ºC até alcançar o mínimo

de 70% de sólidos.

4.2.4 Caracterização dos derivados vegetais (solução extrativa e extrato mole)

4.2.4.1 Determinação do Ph

Para determinação do pH, as amostras foram medidas a 25 ºC em

potenciômetro previamente calibrado com soluções tampão fosfato pH 7,0 e acetato

61

pH 4,0. A leitura do pH das soluções extrativas foi realizada de forma direta, sem

previa diluição. Para a leitura do pH do extrato mole foi realizada diluição do extrato

em etanol 95% P.A, na concentração de 1% (m/V), com agitaçãoo em banho de

ultrassom por 15 min.

4.2.4.2 Determinação do resíduo seco

Cerca de exatamente 2,0 g da amostra de solução extrativa ou 0,2 g de

extrato mole foram pesados em cadinho de porcelana previamente dessecado a 105

ºC por 2 h. As amostras foram levadas a secura sobre chapa de aquecimento. Após

evaporação do solvente, as amostras foram dessecadas em estufa a 105 °C, por 4

h, resfriadas em dessecador e pesadas. O resíduo seco foi calculado e expresso em

% (m/m) (BRASIL, 2010).

4.2.4.3 Análise do perfil cromatográfico dos derivados vegetais por CCD

Na análise química qualitativa por CCD, foram utilizadas como fase

estacionária, cromatoplacas de sílica gel Merck® e uma mistura de hexano e acetato

de etila (6:4) como sistema eluente. Após eluição da amostra pela fase móvel, e

secagem da placa, a temperatura ambiente, a cromatoplaca foi visualizada com

câmara de UV em 254 nm, e revelada com anisaldeído sulfúrico, seguido de

aquecimento (COSTA, 2011). Foram aplicados com tubos capilares cerca de 20 µL

de cada amostra: solução extrativa, sem prévia diluição, extrato mole a 1%, em

etanol 95%; padrões de AMA e AMB (isolados), dissolvidos em acetona. Os

cromatogramas foram desenvolvidos de forma ascendente, em cubas saturadas com

o sistema eluente até a altura de aproximadamente 10 cm (XAVIER, 2014).

4.2.4.4 Quantificação dos marcadores por CLAE

As amostras de solução extrativa e extrato mole foram analisadas conforme

metodologia analítica desenvolvida e validada por Zermiani et al. (2016). A solução

62

extrativa foi diluída na proporção de 1:5 com metanol, e o extrato mole foi dissolvido

em etanol 95%, a 1 µg/mL, em triplicata. As soluções amostra foram filtradas em

membrana de 0,45 µm e injetadas no cromatógrafo. Para expressar o teor de AMA,

o valor lido no software em função da curva de calibração do AMA em g/mL foi

multiplicado pelo fator de correção (5) para as amostras de SE. O valor lido para a

análise do EM foi diretamente expresso sem fator de correção, pois a amostra foi

injetada a 1 mg/mL de EM. Para expressar o teor de AMA por grama de resíduo

seco, a concentração foi dividida pelo resíduo seco (g/mL), obtendo-se o valor em

mg de AMA por g de resíduo seco da solução extrativa ou extrato mole.

O software LC Solution® foi utilizado para registrar os cromatogramas e medir

as áreas dos picos. A detecção por varredura de espectro foi realizada na faixa de

comprimentos de onda entre 190 nm até 400 nm, sendo registrado o cromatograma

em 260 e 280 nm. A fase estacionária empregada foi uma coluna de fase reversa

Kinetex® C18 150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com tamanho de 2,6 μm. A

fase móvel utilizada foi composta por acetonitrila (grau HPLC), metanol (grau HPLC)

e água acidificada com ácido fosfórico a pH 2,5. Os solventes solventes da fase

móvel foram filtrados a vácuo com membrana de celulose regenerada 47 mm de

diâmetro e 0,45 μm de porosidade e degaseificados em ultrassom. O método

gradiente está apresentado no Quadro 3.

Quadro 3: Gradiente empregado para análise das soluções extrativas de R. ferruginea.

Tempo (min) Acetonitrila (%) *H20 (%) Metanol (%)

0 5 70 25

2 5 70 25

5 30 45 25

10 60 15 25

12 70 5 15

15 84 1 15

25 84 1 15

30 5 70 25

35 5 70 25

*H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5

Fonte: (ZERMIANI et al., 2016).

63

4.2.5 Desenvolvimento dos sistemas nanoemulsionados

Xavier (2014) realizou estudo de pré-formulação e determinou a composição

de nanoemulsões, contendo como fase oleosa o Polymol® (triglicerídeos de ácido

cáprico e caprílico) (p/p%) e os tensoativos Span® 80 (monooleato de sorbitano) e

Ultramona® RH400 (óleo de mamona etoxilado hidrogenado a 40 unidades de óxido

de eteno - OE) (p/p%), e Phenonip® (fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno ,

propilparabeno, butilparabeno , isobutilparabeno) a 0,5% (p/p%) como conservante.

A partir das formulações descritas no quadro 2, desenvolvidas por Xavier

(2014), foram introduzidas variáveis para otimização do sistema, iniciando-se pelo

percentual de óleo e extrato mole, conforme descrito nos itens a seguir.

Quadro 4: Formulações desenvolvidas por Xavier (2014) e utilizadas como como referência no presente estudo.

Formulação

Óleo (% p/p)

Tensoativos (% p/p) Conservante (% p/p)

Extrato mole

(%p/p) Total Span Rh400

NE 1.1 15 10 3,16 6,84 0,5 BRANCO NE 1.2 15 10 3,16 6,84 0,5 1

NE 2.1

20 10 3,16 6,84 0,5 BRANCO

NE 2.2 20 10 3,16 6,84 0,5 1

*Os primeiros algarismos 1 e 2 correspondem a 15 e 20 % de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, e ―.2‖ correspondem a 0,5% de extrato mole.

O método selecionado para a preparação das nanoemulsões foi o de inversão

de fases por baixa energia (DUTRA et al., 2014). As amostras foram preparadas em

um total de 20 mL, por aquecimento em banho-maria a 75 ± 5 ºC das fases aquosa e

oleosa, separadamente. A fase aquosa foi gotejada sobre a oleosa contendo os

tensoativos e o extrato mole dos frutos de R. ferruginea, sob aquecimento e agitação

mecânica a 600 rpm. Após completa adição de água, o sistema permaneceu sob

agitação e aquecimento por mais 5 min. Decorrido este tempo, as emulsões foram

retiradas do banho-maria, mantendo-se a agitação com agitador mecânico por mais

5 min.

64

4.2.5.1 Influência da concentração de óleo e extrato

A partir do sistema nanoemulsionado desenvolvido por Xavier (2014), foram

propostas algumas variáveis de formulação. Inicialmente, foi avaliada a influência da

proporção óleo/tensoativo (p/p%), perfazendo três grupos de formulação (15/10%,

20/10% e 25/10%), frente ao percentual do extrato, em três níveis (0,5, 1 e 1,5%),

totalizando 09 formulações. Cada formulação foi produzida em duplicata, com e sem

o extrato mole. A composição das formulações, variando as proporções de óleo e

extrato mole dos frutos da R. ferruginea está descrita no quadro 5.

Quadro 5: Nanoemulsões (NE) contendo diferentes proporções de óleo e extrato mole dos frutos da R. ferruginea.

Formulação

Óleo (% p/p)

Tensoativos (% p/p) Conservante

(% p/p)

Extrato mole

(%p/p) Total Span Rh400

Gru

po

1

NE 1.1 15 10 3,16 6,84 0,5 Branco

NE 1.2 15 10 3,16 6,84 0,5 0,5

NE 1.3 15 10 3,16 6,84 0,5 1

NE 1.4 15 10 3,16 6,84 0,5 1,5

Gru

po

2

NE 2.1 20 10 3,16 6,84 0,5 Branco

NE 2.2 20 10 3,16 6,84 0,5 0,5

NE 2.3 20 10 3,16 6,84 0,5 1

NE 2.4 20 10 3,16 6,84 0,5 1,5

Gru

po

3

NE 3.1 25 10 3,16 6,84 0,5 Branco

NE 3.2 25 10 3,16 6,84 0,5 0,5

NE 3.3 25 10 3,16 6,84 0,5 1

NE 3.4 25 10 3,16 6,84 0,5 1,5

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente

65

No tempo zero (24 h), as formulações desenvolvidas foram avaliadas a partir

da visualização macroscópica e do teste de centrifugação a 3000 rpm por 30 min,

assim como o tamanho médio da fase interna, índice de polidispersão (PDI) e

potencial zeta. As formulações do quadro 5 foram mantidas em temperatura

ambiente e ao abrigo da luz, e novamente caracterizadas após 30 dias.

As formulações contendo o maior percentual de extrato (1,5%) foram

novamente produzidas, em duplicata, com e sem extrato mole (quadro 6)

acondicionadas em tubos de ensaio com tampa e submetida ao teste de estabilidade

preliminar (ciclo de 28 dias), como parâmetro de avaliação de comportamento das

formulações quando submetidas a diferentes temperaturas. As formulações foram

avaliadas no tempo zero (24 h) 14 e 28 dias por meio dos testes descritos no item

4.2.6, exeto análise da viscosidade e pequisa de contaminação microbiológica. As

NE foram ainda avaliadas no tempo zero(24 h) e 28 dias quando ao teor de AMA por

CLAE (item 4.2.6.4).

As condições do teste de estabilidade preliminar foram: 14 ciclos gelo-degelo

(40 ± 2 ºC – estufa / 5 ± 2 ºC – geladeira) a cada 24 h. Uma amostra de cada lote foi

mantida a 25 ± 2 ºC (temperatura ambiente) e outra a 5 ± 2 ºC (geladeira), sendo

estas amostras controle (BRASIL, 2004).

Quadro 6: Nanoemulsões (NE) contendo 1,5% de extrato, selecionadas para o estudo de estabilidade preliminar de 28 dias, variando o percentual de óleo.

Formulação

Óleo (% P/P)

Tensoativos (% p/p) Conservante

(% p/p)

Extrato mole

(%p/p) Total Span Rh400

Grupo 1

NE 1.1 15 10 3,16 6,84 0,5 Branco

NE 1.4 15 10 3,16 6,84 0,5 1,5

Grupo 2

NE 2.1 20 10 3,16 6,84 0,5 Branco

NE 2.4 20 10 3,16 6,84 0,5 1,5

Grupo 3

NE 3.1 25 10 3,16 6,84 0,5 Branco

NE 3.4 25 10 3,16 6,84 0,5 1,5

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole.

66

4.2.5.2 Influência da concentração do tensoativo

A formulação selecionada a partir do item 4.2.5.1, foi modificada elevando a

percentual de tensoativo para 15 e 20% (quadro 7). Todas as formulações foram

obtidas em duplicata, acondicionadas em tubos de ensaio com tampa e submetidas

ao novo teste de estabilidade preliminar, este por sua vez, um ciclo de 14 dias, como

parâmetro de avaliação do comportamento das formulações. As formulações foram

caracterizadas no tempo zero (24 h) 7 e 14 dias por meio dos testes descritos no

item 4.2.6 eceto análise da viscosidade e pequisa de contaminação microbiológica.

As NE foram ainda avaliadas no tempo zero (24 h) e 14 dias quanto ao teor de AMA

por CLAE (item 4.2.6.4 ).

As condições de análise para a estabilidade preliminar foi: 7 ciclos gelo-

degelo (40 ± 2 ºC – estufa / 5 ± 2 ºC – geladeira) a cada 24 h. Uma amostra de cada

lote foi mantida a 25 ± 2 ºC (temperatura ambiente) e outra a 5 ± 2 ºC (geladeira),

sendo estas amostras controle (BRASIL, 2004).

Quadro 7: Nanoemulsões (NE) selecionadas para o estudo de estabilidade preliminar de 14 dias, variando o percentual de tensoativos.

Formulação

Óleo (% P/P)

Tensoativos (% p/p) Conservante

(% p/p)

Extrato mole

(%p/p) Total Span Rh400

Gru

po

3

NE 3.1 – T 15 25 15 4,74 10,26 0,5 Branco

NE 3.4 – T 15 25 15 4,74 10,26 0,5 1,5

NE 3.1 – T 20 25 20 6,32 13,68 0,5 Branco

NE 3.4 – T 20 25 20 6,32 13,68 0,5 1,5

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.

4.2.5.2 Influência da concentração do conservante

A formulação selecionada a partir do item 4.2.5.1 foi modificada elevando o

percentual do conservante para 1 e 2% (quadro 8), a qual foi submetida ao estudo

67

de estabilidade acelerado. As formulações foram obtidas em duplicata e

acondicionadas em frascos de vidro âmbar. As condições de temperatura estudadas

foram 40 ± 2 °C (estufa), 5 ± 2 °C (geladeira) e 25 ± 2 °C (temperatura ambiente). As

avaliações foram realizadas no tempo zero (24 h), 30, 60 e 90 dias (BRASIL, 2004),

por meio dos testes descritos no item 4.2.6.

Nessa etapa do desenvolvimento as formulações foram ainda avaliadas

quanto a viscosidade no tempo zero (24 h), 30, 60 e 90 dias nas condições de

temperatura ambiente (estufa a 25 °C), estufa a 40 °C e geladeira a 5 °C.

Como análise complementar, a pesquisa de contaminação microbiológica foi

realizada no tempo zero (24 h) e após 9 meses com as formulações mantidas em

estufa a 40 °C. Os testes foram realizados conforme a Farmacopeia Brasileira

(BRASIL, 2010), tendo-se escolhido a condição mais crítica de armazenamento,

para testar o efeito do sistema conservante.

Quadro 8: Nanoemulsões (NE) contendo diferentes proporções de conservante.

Formulação

Óleo (% P/P)

Tensoativos (% p/p) Conservante

(% p/p)

Extrato mole

(%p/p) Total Span Rh400

NE 3.1 – T 15 (C1) 25 15 4,74 10,26 1,0 Branco

NE 3.4 – T 15 (C1) 25 15 4,74 10,26 1,0 1,5

NE 3.1 – T 15 (C2) 25 15 4,74 10,26 2,0 Branco

NE 3.4 – T 15 (C2) 25 15 4,74 10,26 2,0 1,5

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.

4.2.6 Caracterização dos sistemas nanoemulsionados desenvolvidos

Todas as amostras das formulações desenvolvidas foram caracterizadas,

sempre 24 h após o preparo, considerado tempo zero, e após os tempos

estabelecidos para os estudos de estabilidade preliminar e acelerado, em cada

condição de temperatura .Os testes descritos a seguir, foram aplicaos a todas as

amostras, exceto quando diferentemente especificado.

68

4.2.6.1 Características organolépticas (aspectos físicos)

As formulações foram analisadas quanto à cor, transparência, separação de

fases e cremeação. A separação de fases foi verificada por percepção direta, após

centrifugação a 3000 rpm por 30 min, conforme descrito no guia de estudo de

estabilidade de produtos cosméticos da ANVISA, para análise de sistemas

emulsionados (BRASIL, 2004).

4.2.6.2 Determinação do pH

A determinação do pH foi realizada com potenciômetro calibrado com

soluções de fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0, respectivamente. As amostras foram

diluídas 1:10 (g/mL) com água purificada.

4.2.6.3 Análise de tamanho médio de gotícula e PDI

O tamanho médio de fase interna, o índice de polidispersividade (PDI) e o

potencial zeta das formulações foram determinados pelo método de espalhamento

de luz dinâmico usando equipamento Zetasizer Nano ZS. As análises foram

realizadas em um ângulo de 90° e a temperatura constante (25 °C). As amostras

foram diluídas em água ultrapura na proporção de 1:100. Para o processamento de

dados das análises foi utilizado o software Dynamic Light Scattering versão 5.43.

4.2.6.4 Perfil cromatográfico e teor de AMA em CLAE

As amostras foram analisadas conforme metodologia analítica desenvolvida

por Zermiani et al. (2015), descrita no item 4.2.4.4.

Para as nanoemulsões submetidas à estabilidade preliminar e acelerada,

pesou-se exatamente cerca de 0,5 g das formulações em balão volumétrico de 5 mL,

no qual foi adicionado cerca de 2,5 mL de acetonitrila e colocado em ultrassom por

20 min. Foi completado o volume do balão, e a amostra foi centrifugada a 3000 rpm

69

por 10 min. O sobrenadante foi filtrado em membrana de celulose regenerada de

0,45 µm de porosidade e analisado em triplicata. Para análise do extrato mole, foi

preparada uma solução a 1 mg/mL de EM em metanol grau HPLC, a solução foi

filtrada nas mesmas condições citadas, e analisada em triplicata.

Esta etapa foi realizada com a colaboração da aluna de graduação Ana

Cristina Gon no laboratório de técnicas analíticas do Curso de Farmácia (UNIVALI).

4.2.6.4 Análise de viscosidade aparente da nanoemulsão

A análise de viscosidade foi realizada com 15 g de amostra, na temperatura

de 25 °C no viscosímetro rotacional VT 550 Haake® acoplado ao termocontrolador

Haake® DC30, utilizando o sensor SV-DIN e software Rheowin® 4 Data Manager

430.0013 e Rheowin® 4 Job Manager, avaliando-se os parâmetros de viscosidade e

o índice de fluxo, através do modelo da Lei da Potência. A analise foi realizada

variando-se a taxa de cisalhamento entre 6,5 a 100 s-1 (curva ascendente), seguido

de uma etapa intermediária, fixada em 100 s-1. A curva descendente variou de 100 a

6,5 s-1. Em cada uma das etapas foram coletados 100 pontos, perfazendo o total de

6 minutos. O modelo empregado para a determinação do fluxo foi o da Lei da

Potencia.

4.2.6.5 Pesquisa de contaminação microbiológica das nanoemulsões

Uma alíquota de 1,0 mL da NE foi transferida em cabine de segurança

biológica, com auxílio de espátula estéril, em frasco contendo 99 mL de tampão

fosfato (T.F) pH 7,2. O frasco foi homogeneizado e deixado em contato por no

mínimo 10 minutos. O mesmo procedimento foi realizado em frasco contento caldo

lactosado. Para as análises do estudo de estabilidade acelerado, cada NE foi

armazenada diretamente em frasco estéril, e colocada no ambiente estufa (foi

selecionado o pior caso sujeito a contaminação). As análises de contagem de

fungos, leveduras, bactérias foram realizadas pelo método em semeadura em

profundidade, com análise em duplicata.

70

A contagem de bactérias aeróbias foi realizada transferindo-se 1 mL das

diluições em tampão fosfato para as placas de Petri estéreis, nas quais foi

adicionado de maneira asséptica de 15 a 20 mL de ágar caseína de soja (TSA), a

45-50 °C, em cada uma das placas. As placas foram homogeneizadas com

movimentos leves e giratórios (sentido horário e anti-horário), e mantidas levemente

abertas próximas à chama no bico de Bunsen, até solidificar. As placas foram

incubadas (invertidas) em estufa bacteriológica a 35 ± 2 °C por 48 h.

A contagem de fungos e leveduras foi realizada transferindo-se 1 mL das

diluições em tampão fosfato para as placas de Petri estéreis, nas quais foram

adicionados de maneira asséptica de 15 a 20 mL de ágar dextrose batata (PDA),

resfriado a 45-50 °C a cada uma das placas. O meio foi homogeneizado nas placas

com movimentos leves e giratórios (sentido horário e anti-horário), e mantido

próximo a chama do bico de Bunsen, com a placa levemente aberta, até a

solidificação do meio. Após, foram incubadas na posição invertida em estufa

bacteriológica a 25 ± 2 °C por 5 a 7 dias.

A contagem de bactérias Gram Negativas foi realizada, transferindo-se uma

alíquota de 1 mL das diluições em caldo lactosado para as placas, nas quais foram

adicionados 15 mL do meio de cultura ágar VRBD. O meio foi homogeneizado nas

placas com movimentos leves e giratórios (sentido horário e anti-horário), e mantido

próximo a chama do bico de Bunsen, com a placa levemente aberta, até a

solidificação do meio. Após, foram incubadas na posição invertida em estufa

bacteriológica a 35 ± 2 °C por 48 a 72 h.

Todas as colônias foram contadas (tanto as de superfície como as de

profundidade) nas placas contento entre 30 e 300 colônias por placa para as

bactérias e 15 a 150 colônias para fungos e leveduras, e o resultado foi expresso em

UFC/mL ou g, segundo a equação 3.

(3)

Resultado = média n° de colônias x diluição da amostra (caso necessário)

Para a pesquisa de patógenos foi realizada inicialmente a fase de

enriquecimento da amostra, com uma diluição inicial feita em caldo lactosado,

incubando-se a 35 ± 2° C por 24 a 48 h. Como resultado foi observado a turvação da

71

amostra. Em caso de turvação, procedeu-se a fase seletiva para cada micro-

organismo.

Para a pesquisa de Escherichia coli e Salmonella, a amostra foi estriada, com

alça de platina, no caldo lactosado em 4 quadrantes nos meios ágar MacConkey e

ágar SS, o qual foi incubado a 35 ± 2 °C por 24 a 48 h. Foi observada a presença de

crescimento de colônias com morfologias característica do meio, e o resultado foi

expresso em presença ou ausência dos patógenos.

Esta etapa foi realizada com a colaboração do aluno de graduação do Curso

de Engenharia química, Odair José Custódio Junior e supervisão da Profa. Dra.

Josiane de Carvalho Vitorino, no laboratório de Controle Microrbiológico 310

.

4.2.7 Ensaio da atividade anti-inflamatória in vivo

A formulação com percentual de conservante a 1% (item 4.2.5.2) foi avaliada

quanto a atividade anti-inflamatória no tempo de 24 h (tempo zero) e após 90 dias, a

fim de monitorar a estabilidade do sistema quanto a sua ação farmacológica como o

passar do tempo.

4.2.7.1 Animais

Foram utilizados camundongos machos Balb/C pesando entre 25-30 g

provenientes do Biotério da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais

foram mantidos em caixas de polipropileno com enriquecimento ambiental (canos e

papeis), em salas com controle de temperatura (22-25 °C), umidade constante (60%)

e ciclos controlados (claro/escuro 12 h cada), tendo ração e água ad libitum. Como

agente anestésico foi utilizado cloridrato de ketamina 77 mg/kg + cloridrato de

xilazina, 7 mg/kg.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos

de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de Controle de

Experimentação Animal (CONCEA), e após a aprovação do CEUA sob o parecer

número 044/15 (Anexo 1). Antes dos experimentos os animais foram mantidos

72

durante sete dias para ambientação no biotério do laboratório de farmacologia (209)

do bloco F6.

4.2.7.2 Droga e tratamento

Durante os experimentos, foram utilizadas as seguintes substâncias:

indometacina (controle positivo), extrato mole dos frutos da R. ferruginea, veículo do

extrato mole (salina 0,9% NaCl e DMSO – controle negativo EM), nanoemulsão com

extrato e sem extrato (controle negativo). As drogas foram dissolvidas em salina

0,9% NaCl e DMSO. As doses escolhidas tiveram por base os trabalhos anteriores

(HESS et al., 2010). A formulação selecionada para monitorar a atividade anti-

inflamatória, foi a mesma submetida ao estudo de estabilidade acelerada, apenas a

formulação com percentual de conservante a 1% (item 4.2.5.2). Os testes foram

realizados nos tempos de 24 h e 90 dias para as NE, com e sem extrato, em

temperatura ambiente (estufa a 25 °C).

4.2.7.3 Inflamação no tecido subcutâneo dorsal - bolsa de ar

Um compartimento estéril, denominado bolsa de ar, foi desenvolvido pela

administração de 3 mL de ar estéril no tecido subcutâneo da região dorsal dos

animais, os quais foram anestesiados previamente a este procedimento. Cinco dias

após a primeira injeção de ar, um reforço foi realizado pela injeção de 3 mL de ar

estéril, segundo procedimento descrito por Sedgwick (1986) e por Jain e Parmar

(2011).

Dez dias após a primeira injeção, os animais foram tratados por via oral com

extrato mole dos frutos de R. ferruginea nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg,

indometacina (30 mg/kg), nanoemulsão do EM de R. ferruginea nas doses de 3, 30 e

100 mg/kg, nanoemulsão branca na dose de 100 mg/kg, ácido mirsinóico A (30

mg/kg) ou veículo. Adicionalmente, as nanoemulsões foram avaliadas ao final do

estudo de estabilidade, na dose que apresentou melhor atividade no tempo 0. Após

uma hora dos tratamentos, a carragenina 1% em volume final de 1 mL de solução

tamponada de fosfato (PBS), foi injetado diretamente na bolsa. Quatro horas mais

73

tarde, os animais foram anestesiados e uma pequena incisão foi realizada na bolsa

de ar para obtenção do lavado do infiltrado inflamatório, no qual foi determinado o

número de leucócitos. O número total de células no lavado da bolsa de ar foi

quantificado com auxílio da câmara de Neubauer, após diluição de 1:100 em Líquido

de Türk.

4.2.7.4 Análise estatística

Os resultados obtidos nos experimentos foram expressos em média ± erro

padrão da média (E.P.M.) e analisados estatisticamente por análise de variância

com comparações múltiplas (ANOVA) e, quando necessário, serão utilizados como

pós-teste o teste de Tukey-Kramer ou Dunett. Os dados foram analisados no

programa GraphPad Prism, admitindo como significativamente estatístico o p<0,05.

74

75

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal

Os frutos da Rapanea ferruginea podem ser coletados em diferentes estágios

de maturação. Neste trabalho a coleta ocorreu nos meses de agosto e outubro. Os

frutos foram coletados, em sua maioria ainda verdes, pela disponibilidade no

momento da coleta, uma vez que estes frutos são silvestres e consumidos pelos

pássaros quando maduros (SPATHELF et al., 2001). Cabe também salientar que

Xavier (2014) e Krackinski et al. (2014) verificaram que o grau de maturação não foi

determinante para os parâmetros avaliados como resíduo seco, pH e teor de AMA e

TGL nas soluções extrativas.

Nos trabalhos realizados com os frutos da espécie R. ferruginea, pelo grupo

de pesquisadores do NIQFAR, a coleta tem sido realizada sempre nestes mesmos

meses e local (COSTA, 2011; XAVIER, 2015).

Posteriormente os frutos foram submetidos ao processo de secagem. Este

consiste em retirar a maior parte de água existente nos órgãos vegetais (folhas,

flores, raízes, frutos), atuando na inativação enzimática que, por sua vez, paralisa o

metabolismo vegetal, que poderia degradar os metabólitos ativos da planta. A

quantidade elevada de água da planta recém-coletada pode propiciar o crescimento

de micro-organismos. Desta forma, a secagem tem por finalidade a manutenção da

integridade dos constituintes químicos e da qualidade microbiológica, por período de

tempo mais longo, e do seu potencial terapêutico. A planta medicinal fresca, após o

processo de seleção da parte usada e a secagem desta, dá origem ao que se

denomina droga vegetal (BRASIL, 2004; LEITE, 2009).

Nos compêndios oficiais e farmacopeias, não há monografias para a espécie

R. ferruginea. Desta forma os resultados obtidos nesse trabalho tornam-se

importantes para o conhecimento e caracterização da espécie, tendo-se como droga

vegetal os frutos da planta.

Os ensaios de controle de qualidade tem por objetivo avaliar as

características físicas, químicas e microbiológicas das matérias-primas, produtos em

processo e produto acabado. A verificação da conformidade das especificações

76

deve ser vista como um requisito necessário para a garantia da qualidade,

segurança e eficácia do produto, e não somente como uma exigência regulatória

(BRASIL, 2007).

Os ensaios de controle de qualidade realizados para amostras de origem

vegetal caracterizam-se principalmente em: determinação de água no material a ser

analisado (teor de umidade), e determinação de cinzas totais ou insolúveis (BRASIL,

2007). No presente estudo, os frutos foram mantidos em sala de secagem, com

controle de umidade, e armazenados em embalagens de papel pardo em estantes

de alumínios abertas, fora do contato com pisos e paredes, conforme recomendado

na literatura (LEITE, 2009). Os frutos estabilizaram após um período de uma

semana, tiveram perda por secagem de 73,88% (s = 0,45; DPR% = 0,60) em relação

ao peso inicial, calculada pela pesagem diária. Após a secagem, os frutos foram

moídos, os quais representam a droga vegetal.

A granulometria média foi 0,675 mm (s = 0,24, DPR% = 36,66) e a

distribuição granulométrica está apresentado na Figura 7. Mais de 60% da

granulometria da droga vegetal ficou compreendida entre os tamises com abertura

de malha de 0,85 e 1,4 mm. A classificação granulométrica deste pó aproxima-se de

um pó grosso, pois segundo a Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), as partículas

passam em sua totalidade pelo tamis com abertura nominal de malha 1,7 mm e, no

máximo, 40% pelo tamis com abertura nominal de malha de 355 µm. A

granulometria do material triturado é um parâmetro que influencia a eficiência e

reprodutibilidade do processo extrativo (MIGLIATO et al., 2007).

Figura 7: Distribuição granulométrica dos frutos secos e moídos da R. ferruginea.

77

A perda por dessecação das amostras foi 8,70% (s = 0,39, DPR% = 4,55),

dentro desses limites, demonstrando que a operação de secagem pós-colheita foi

efetiva.

A quantidade excessiva de água em drogas vegetais propicia o

desenvolvimento de micro-organismos, insetos, hidrólise e a consequente

deterioração dos constituintes da droga vegetal. Por isto, há necessidade de

estabelecimento de limites de umidade, cujo aceitável de umidade recomendado

pela Farmacopeia (BRASIL, 2010) para drogas vegetais varia de 6% a 16%,

determinado através de metodologias analíticas específicas e em drogas que

contém substancias voláteis como óleos essenciais, emprega-se o teste de perda

por dessecação (FISHER, 2007).

O teor de cinzas totais foi 2,73%(s = 0,06, DPR% = 2,37) e demonstram

valores relativamente baixos, indicando que há pouca presença de cinzas não

fisiológicas na droga vegetal.

A determinação de cinzas totais destina-se a estabelecer a quantidade de

substância residual não volátil no processo de incineração especificado. As cinzas

totais incluem as derivadas de tecido vegetal (cinzas fisiológicas) e de materiais

estranhos especialmente areia e terra aderente à superfície da droga (cinzas não

fisiológicas), que devem ser evitadas no tratamento do material (LEITE, 2009).

A porcentagem de cinzais insolúveis para as amostras teve uma média de

0,14% (s = 0,01, DPR% = 7,14) e indica o baixo índice de contaminação da droga

vegetal. A presença de altos teores de cinzas sulfatadas demonstra a presença de

cinzas não fisiológicas, proveniente de areia e terra, mostrando tratamento impróprio

durante colheita, secagem e armazenagem (LEITE, 2009).

As cinzas insolúveis compreende o resíduo não volátil à incineração na

presença de ácido sulfúrico. Esta análise visa determinar o teor de impurezas

inorgânicas contidas na droga vegetal (LEITE, 2009). Estas análises indicam baixo

índice de contaminação, resultado este já esperado, visto que os frutos ficam

suspensos nas árvores não estando em contato direto com terra ou areia.

Os resultados de obtenção, tratamento e caracterização da droga vegetal

assemelham-se ao estudo anterior de caracterização dos frutos da R. ferruginea

(XAVIER, 2014).

78

5.2 Caracterização da solução extrativa e extrato mole

Neste trabalho, foi preparado primeiramente a solução extrativa a qual deu

origem ao extrato mole, os quais foram avaliados quanto pH, resíduo seco e

quantificado o teor de AMA por CLAE (Tabela 1).

O pH obtido para solução extrativa e extrato mole foi levemente ácido, e

estão na faixa de 5,3 e 5,4 (Tabela 1). A análise do pH é um parâmetro auxiliar para

controle da estabilidade, fornecendo indicativos sobre a natureza química do

conjunto de compostos presentes em solução (ISAAC et al., 2008).

A média de resíduo seco obtido das amostras para extrato mole foi de 82% e

está dentro do mínimo de 70% (Tabela 1). Extratos moles dessecados a 105 °C, a

perda de água varia entre 15 a 20%, devendo então apresentar no mínimo 70% de

resíduo seco (BRASIL, 2010; LEITE, 2009).

A quantificação do marcador AMA para solução extrativa e extrato mole está

descrito do tabela 1. É possível observar que o teor de AMA é maior no extrato mole

os quais foram obtidos da soluçõe extrativa. Este aumento pode estar relacionado às

condições do processo de evaporação, no qual a solução extrativa é exposta ao

aquecimento por longo período de tempo. Ressalta-se que o valor o teor em ambos

os derivados vegetais está expresso em relação ao resíduo seco, o qual é bastante

variável (Tabela 1), no extrato mole especialmente, devido a sua composição oleosa.

Tabela 1: Resultados da caracterização físico-química da solução extrativa e extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea.

Parâmetros pH - média (s) Resíduo seco

(µg/g) - média (s)

Teor de ama

(µg/g) Média (s)

Solução extrativa 5,34 (0,19) 1,05 (0,21) 79,15 (4,70)

Extrato mole 5,42 (0,13) 82,36 (8,83) 113, 09 (0,08)

*s (desvio padrão),

79

A solução extrativa e extrato mole foram submetidos a análise por CCD,

juntamente com os padrões dos ácidos mirsinoicos AMA e AMB (Figura 8).

A qual permitiu evidenciar e comprovar a presença do ácido mirsinoico AMA

na solução extrativa a partir dos frutos da R. ferruginea, e no extratos moles

desenvolvidos a partir da solução extrativa respectivamente (Figura 8).

Figura 8 Cromatografia em camada delgada da solução extrativa (SE) e do extrato mole (EM), utilizando como padrões os ácidos mirsinoicos A e B.

*Como fase estácionaria utilizou-se sílica gel (gh254) e como fase móvel, hexano: acetato de etila (6:4), após revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento.

Nos perfis cromatográficos da solução extrativa e extrato mole em diferentes

comprimentos de onda por CLAE,foi quantificado ácido mirsinoico AMA o qual foi

detectado em comprimento de onda de 260 nm, comprovando sua presença tanto

na solução extrativa quanto no extrato mole, foi possível observar a presença de um

triglicerídeo ainda não totalmente elucidado o qual tem absorção em comprimento de

onda de 280 nm (Figura 9).

80

Figura 9: Perfil cromatográfico das soluções extrativas e extratos mole por CLAE, em comprimento de onda 260nm e 280nm.

*Fase estacionária: coluna de fase reversa Kinetex®C18150 x 4,6 mm,com partículas core-shellcom tamanho de 2,6 μm. Fases móveis: acetonitrila (ACN), metanol (MeOH) e água acidificada com ácido fosfórico a pH 2,5. Leitura em comprimento de onda = 260 nm

5.3 Otimização dos sistemas nanoemulsionados

5.3.1 Influência do percentual de óleo e extrato nas nanoemulsões

De acordo com o sugerido pelo guia de estudo de estabilidade da ANVISA

(BRASIL, 2004), recomenda-se submeter o produto em desenvolvimento ao teste de

centrifugação, antes de iniciar o estudo de estabilidade. O produto deve permanecer

estável e qualquer sinal de instabilidade indica a necessidade de reformulação. Se

aprovado nesse teste, o produto pode ser submetido aos testes de estabilidade

(BRASIL, 2004). Esta condição de estresse tem sido a mais usada para rapidamente

avaliar a estabilidade de uma emulsão (RIBEIRO et al., 2015).

Todas as formulações contendo diferentes níveis de óleo e extrato, conforme

descrito na metodologia (item 4.2.5.1) apresentaram-se com aparência leitosa e

consistência fluida, sem separação de fases, quando submetidas ao teste de

centrifugação no tempo zero (24 h) (Figura 10).

81

Figura 10: Nanoemusões contendo diferentes níveis de óleo e extrato, após 24h de preparo.

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente

A coloração das NE variou conforme a concentração do EM e de óleo, sendo

que na medida em que se aumentou o percentual de óleo a coloração foi menos

intensa (Figura 10). Este comportamento se deve ao efeito de diluição do extrato na

presença de maiores quantidades de óleo, assim como ao tamanho de gotícula.

Com o aumento da quantidade de óleo, também se observou o aumento no tamanho

de gotícula, configurando maior opacificação do sistema. No menor percentual de

óleo, a NE ficou mais transparente, sendo possível observar o efeito da coloração

inerente ao extrato. Portanto, a intensidade da coloração se deve ao reduzido

tamanho da gotícula , que permite um maior espalhamentoda luz, conferindo mais

transparência ao sistema (HA et al., 2015; McCLEMENTS, 2012).

O tamanho médio das gotículas das nanoemulsões (NE) está apresentado na

na Figura 11. A determinação de tamanho de gotícula é um dos métodos mais

comuns utilizados para avaliar a estabilidade de nanoemulsões, porque o tamanho

de gotícula interfere em fenômenos de floculação e coalescência, sendo este um um

82

parâmetro importante para definir aplicação e estabilidade de nanoemulsões

(GIANETI et al., 2011).

É conhecido que nanoemulsões com um elevado teor de óleo podem não ser

necessariamente estáveis e podem resultar no aumento do tamanho das gotículas

ou separação de fases (MOSTAFA; EL-ALIM; ASFOUR, 2015). Assim, o resultado

sobre a redução do tamanho é preferível para a estabilidade do sistema. Sabe-se

que quanto menor o tamanho de gotícula melhor é a estabilidade da emulsão,

devido ao movimento browniano que se torna mais importante que a força da

gravidade (CHIBOWSKI, 1999; KONG; PARK, 2011; WIACEK , 1999).

No presente trabalho, verificou-se também que percentual de óleo foi o fator

determinante para o tamanho de gotículas. De modo semelhante, o estudo de

otimização de sistema nanoemulsionado, utilizando ácido oleico, como fase oleosa,

mostrou que o tamanho de fase interna aumentou de 60 a 100 nm, com os

percentuais de 24 e 28% de óleo, respectivamente (ZHONGCHENG; XUEFENG;

XIAO-BIM, 2016).

Dentro de cada grupo, verificou-se também a influência do extrato mole em

relação às NE brancas. Nas formulações com óleo a 15 % (grupo 1), o EM

interferiu, levando a uma diminuição do tamanho de gotícula em relação a NE

branca. No grupo das formulações com óleo a 20% (grupo 2), o EM interferiu,

aumentando o tamanho de gotículas. Entretanto, nas formulações com óleo a 25%

(grupo 3), o percentual do EM não influenciou no tamanho de gotículas (Figura 11).

O efeito do extrato vegetal sobre o tamanho de gotícula pode ser muito

variável, dependente de cada formulação, composição do extrato e método.

Observando resultados de outros estudos que desenvolveram NE contendo extratos

vegetais, por exemplo, verificou-se tanto a redução de tamanho em NE contendo

extrato de tomate rico em licopeno (HA et al., 2015), como o seu aumento em NE

contendo extrato de Achyrocline satureioides (Lam) DC-Asteraceae (ZORZI et al.,

2015).

O tamanho de gotículas também foi analisado quanto ao índice de

polidispersão (PDI) , que se refere à distribuição das gotículas da fase interna. Uma

distribuição é homogênea quando PDI é inferior a 0,2 (CAPEK, 2004).

83

Figura 11: Tamanho de gotícula, PDI e potencial zeta nas nanoemulsões contendo diferentes percentuais de óleo e extrato mole.

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente.

Na Figura 11, quando analisado o índice de polidispersão (PDI) nas

formulações do grupo 1 e 2 (óleo 15 e 20%, respectivamente), observa-se um

aumento com a presença do EM, porém não linear. Já para o grupo 3 (óleo 25%) o

PDI tende a diminuir quando o EM está em 1 e 1,5%. Observa-se que nas

formulações com mais óleo e mais extrato, tem-se a menor polidispersão. Em geral

independente do percentual de óleo e extrato mole, todas as formulações

apresentaram PDI inferior a 0,2, indicando que a população de gotículas é

monodispersa (TANG et al., 2012).

Embora as formulações tenham PDI menor que 0,2, observa-se na Figura 12,

uma discreta tendência ao aumento de tamanho de gotículas, tendo em vista o

deslocamento da curva de distribuição para a direita.

84

O potencial zeta (Figura 11) indica o grau de repulsão entre as partículas

adjacentes e carregadas em uma dispersão. Assim, o potencial zeta demonstra a

tendência das gotículas se agregarem, preconiza-se que quanto maior o potencial

zeta menor a tendência de agregação de partículas (FRONZA; CAMPOS; TEIXEIRA,

2004). Quando o potencial zeta é baixo, a atração excede a repulsão e assim a

dispersão floculará. A linha que divide os sistemas em estáveis e instáveis é

marcada em +30 ou -30 mV, desta forma partículas com potencial zeta positivo

acima de +30 mV ou mais negativo que -30 mV, são considerados estáveis. No caso

de nanoemulsões que possuem partículas pequenas, um potencial zeta alto confere

estabilidade ao sistema (HE et al., 2011).

Observa-se que o potencial zeta (Figura 11) aumenta na presença do extrato

mole em relação a NE branca, independente dos percentuais de óleo e EM. Os

valores obtidos para as NE branca ficaram entre -15 mV e -17 mV, já na presença do

EM esses valores passam para -38 mV até -46 mV (Figura 11). Em geral, os

resultados demonstram que o EM melhora a estabilidade do sistema, sendo que um

valor de potencial zeta entre -25 mV e -30 mV já é suficiente para criar uma barreira

de energia entre as gotículas, assim evitando a coalescência (SHANMUGAM;

ASHOKKUMAR, 2014).

85

Figura 12: Distribuição de tamanho das gotículas das nanoemulsões contendo os diferentes percentuais de óleo e extrato mole.

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente.

86

Para subsidiar a escolha da formulação para a sequencia do estudo de

desenvolvimento, repetiram-se os mesmos testes após 30 dias do preparo das NE,

que foram mantidas nas condições de bancada, sem controle de temperatura.

Em todos os grupos de formulações, o tamanho de gotícula aumentou de 6,5

a 14%, após o período de 30 dias , motivando as demais etapas deste trabalho

(Figura 13).

O PDI sofreu variações, sempre abaixo do limite recomendado. Mudanças no

tamanho de partícula, mas não em PDI foram relatados em estudos realizados por

Saberi, Fang e McClements (2013) (Figura 13).

Em relação ao potencial zeta, todas as formulações mantiveram o mesmo

padrão de comportamento, sem alterações relevantes .

Figura 13: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo diferentes percentuais de óleo e extrato mole no tempo zero (24h) e após 30 dias.

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente.

87

A estabilidade da emulsão é intimamente relacionado com a distribuição do

tamanho das gotículas. Um maior tamanho de gotícula pode aumentar o fenômeno

de maturação de Ostwald, levando à cremeação e coalescência (PIORKOWSKI;

McCLEMENTS, 2013). Sabe-se que a estabilidade da emulsão é inversamente

proporcional à temperatura de armazenamento (RIBEIRO et al, 2015), o que pode

explicar em parte estes resultados.

Considerando então, o aumento do tamanho médio de gotículas, após 30

dias, decidiu-se prosseguir o estudo de desenvolvimento, submetendo a formulação

com o maior percentual de EM (1,5%), em três níveis de percentual de óleo (15, 20 e

25%), ao estresse térmico (estabilidade praliminar), para conhecer melhor o efeito da

temperatura, como um dos fatores que interferem na estabilidade.

Os resultados desta etapa estão representados na Figura 14. Em relação aos

aspectos físicos todas as formulações permaneceram de consistência fluida e

aspecto leitoso. O comportamento de estabilidade frente a oscilação forçada de

temperatura, mostrou que todas as formulações contendo EM, apresentaram um

leve sedimento, após centrifugação, inclusive as formulações dos grupos controles

(5 C e 25 C). Estes resultados sugerem que a presença do EM a 1,5%, associada

ao tensoativo a 10%, não mantém o sistema estável frente a estresse forçado de

temperatura.

A coloração das NE manteve-se marrom, porém, quando o EM e óleo estão

em maior percentual a tonalidade do sistema é mais clara, conforme já apresentado

anteriormente, comportamento relacionado ao percentual de óleo e tamanho de fase

interna.

Em relação ao tamanho de gotícula, houve um aumento de cerca de 2 a 5% ,

para todas as formulações ao final do ciclo (28 dias) em relação ao tempo zero (24

h). O mesmo foi observado para as amostras dos grupos controles (± 5 °C e ± 25

°C). Esse aumento foi identificado a partir de 14 dias, em relação ao tempo zero (24

h) (Figura 14). Quando comparado com os resultados obtidos anteriormente com a

formulação analisada após 30 dias , em condições normais de bancada, esse

aumento não foi relevante. Essas diferenças podem ser decorrentes das variações a

cada lote de preparação.

88

Figura 14: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo extrato mole a 1,5%, com diferentes percentuais de óleo, quando submetidas às alterações de temperatura a cada 24h durante 28 dias (estabilidade preliminar).

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole.

Todas as formulações, incluindo as NE brancas, também apresentaram valor

de PDI aceitável (menor que 0,2) no tempo zero (24 h), com leves variações ainda

dentro dos níveis desejados após 14 e 28 dias no ciclo gelo degelo (Figura 14).

Em relação ao potencial zeta, os valores para as NE branca encontraram-se

abaixo de -20 mV e para as NE com extrato mole acima de -40 mV. Como já

observado, a presença do EM aumenta o potencial zeta das NE. Observou-se que

esse aumento é mantido ao final de 28 dias e que a temperatura não interfere nesse

fenômeno, visto que as formulações quando submetidas ao ciclo gelo-degelo

apresentaram o potencial zeta na mesma faixa do tempo zero (24 h). O mesmo

comportamente foi observado para as NE dos grupos controle (± 5 °C e ± 25 °C) .

89

Para as formulações sem EM observou-se que o pH teve valor mínimo de

6,09 e máximo de 6,61, e nas formulações com EM, houve o decréscimo para 5,07

a 5,38, confirmando a presença do ácido mirsinoico no EM, característica

determinada por Zermiani et al (2016) e já relatado para o extrato mole no presente

estudo, com pH igual a 5,42 (tabela 1).

Estudo anterior com nanoemulsões contento extrato mole da R. ferruginea

submetido ao mesmo teste nas mesmas condições, apresentou resultados

semelhantes quanto a caracterização do sistema nanoemulsionado frente a

alterações de temperatura (XAVIER, 2014). O mesmo apresentou resultados

promissores quando na presença do extrato mole nas formulações, demonstrando a

influência do mesmo na estabilidade de sistemas nanoemulsionados, corroborando

que o extrato mole da R. ferruginea melhora a estabilidade de nanoemulsões.

O perfil cromatográfico das nanoemulsões, em 260 nm, é semelhante aos

perfis dos EM e SE (item 5.2 – Figura 9). A Figura 15 representa os cromatogramas

para todas as condições e tempos de análises, uma vez que os perfis foram

semelhantes. O cromatograma das nanoemulsões com extrato mole apresentam

outros picos, relacionados aos excipientes das formulações, conforme apresentado

no cromatograma das nanoemulsões sem o extrato. Porém, a presença de vários

picos presentes nas formulações demonstram a ausência de interferência dos

mesmos com o marcador AMA, indicando que o método empregado é específico

para a análise do marcador na formulação (ZERMIANI et al., 2015).

90

Figura 15: Perfil cromatográfico por CLAE, representativo das nanoemulsões, sem e com extrato mole da R. ferruginea, em comprimento de onda 280 nm e 260 nm.

A análise por CLAE foi realizada a fim de verificar se o teor de AMA

permanecia constante quando as nanoemulsões submetida a mudança de

temperatura. Observa-se que o teor de AMA permanece relativamente constante no

final do ciclo (28 dias) em relação ao tempo zero (24 h) para todas as formulações,

com e sem EM (Tabela 2).

Tabela 2: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de estabilidade preliminar (ciclo 28 dias).

Teor de AMA (µg/g)

Formulações Tempo zero

24 horas Tempo final

28 dias Controle

28 dias (±5°c) Controle

28 dias (±25°c)

NE 1.4 116,46 (6,12) 114,78 (0,49) 107,76 (1,01) 114,56 (8,80)

NE 2.4 116,52 (5,00) 113,90 (6,64) 111,91 (9,57) 113,16 (6,11)

NE 3.4 119,61 (0,80) 118,98 (5,97) 104,01 (10,97) 101,26 (7,90)

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole.

91

Ocorreu separação de fases, com uma leve sedimentação após o processo

de centrifugação nas NE contendo o EM, isto apontou a necessidade de aprimorar a

formulação. Dando continuidade ao desenvolvimento, optou-se por avaliar a

influência do tensoativo nos maiores percentuais de EM e óleo, conforme descrito a

seguir.

5.3.2 Influência do tensoativo nas nanoemulsões contendo óleo a 25% e

extrato a 1,5%

A seleção do melhor percentual de tensoativo é crucial para melhorar a

estabilidade da emulsão (KIM et al., 2014). Nesta etapa de desenvolvimento, o

tensoativo passou de 10% para 15 e 20% (conforme descrito na metodologia item

4.2.5.2).

Em resposta ao aumento do tensoativo, observou que o tamanho de gotícula

das formulações com EM, sofreu uma redução em relação à formulação branco em

todos os tempos e condições, porém menor para o tensoativo a 20% (Figura 16).

Quanto maior o percentual de tensoativo, menor o tamanho de gotícula , conforme

esperado e observado em estudos semelhantes (KIM et al., 2014).

Porém, todas as formulações apresentaram aumento no tamanho de gotícula

ao final do ciclo (14 dias) em relação ao tempo zero (24 h). O mesmo ocorreu para

as formulações controles (± 5 °C e ± 25 °C) (Figura 16).

De modo geral, as formulações apresentaram o valor de PDI menor que 0,2,

em todos os tempos e condições de análises. O índice de polidispersão (PDI)

apresentou-se maior para as formulações com tensoativo 20%, sendo que o

tamanho de gotícula é menor nessa condição (Figura 16).

Conforme já verificado anteriormente , a presença do EM aumentou o

potencial zeta em relação ao branco, os valores obtidos seguem os mesmo

comportamento que anteriormente, valores esses mantidos no decorrer do tempo,

mesmo sem a interferência da concentração do tensoativo nesta etapa.

À medida que a concentração de tensoativo aumenta, o tamanho da gotícula

tende a ser menor. Entretanto, nos métodos que induzem a uma maior redução no

tamanho de gotículas, como na emulsificação de alta energia, que empregam

homogeneizadores de alta pressão, requerem maior quantidade de tensoativo para

92

envolver e estabilizar as gotículas formadas (CHOI et al., 2009; KIM et al., 2014).

Porém, o PDI e o potencial zeta não se correlacionaram com a quantidade de

tensoativo.

Figura 16: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, com diferentes percentuais de tensoativo, quando submetidas às alterações de temperatura a cada 24 h durante 14 dias (estabilidade preliminar).

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.

Os valores de pH, também apresentaram-se como no ciclo anterior, na faixa

de 5,17 a 7,05, sendo que as formulações com EM apresentam pH menor que as NE

branco.

Visualmente, em resposta ao aumento do tensoativo, observou-se que todas

as formulações apresentaram-se de consistência viscosa e aspecto opalescente

(Figura 17), diferentemente das formulações com menor percetual de tensoativo

(Figura 10), as quais eram fluidas e leitosas.

Nesta etapa, todas as formulações permaneceram estáveis, sem separação

de fases, após o processo de centrifugação, em todos os tempos e condições de

análises, demonstrando que a maior concentração de tensoativo confere maior

estabilidade ao sistema, conforme esperado e demonstrado por estudos com

objetivo semelhante (KAH; HOFMANN, 2014), priorizando porém, a menor

quantidade possível de tensoativo, tendo em vista um menor potencial de toxicidade

ou efeito irritante dos tensoativos.

93

Figura 17: Aspecto visual das nanoemulsões contendo extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, com diferentes percentuais de tensoativo no tempo zero (24 h).

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.

Um estudo de estabilidade para o extrato mole dos frutos de R. ferruginea

(ZERMIANI et al., 2015) foi verificado que o teor de AMA é muito variável. No

presente estudo, quando o extrato foi incoproado nas NE, verificou-se o mesmo

comportamento. Os resultados apontam para uma suposta interferência do

percentual de tensoativo, na estabilidade do AMA ao longo do tempo, tanto nas

condições de estresse de temperatura, e nas condições usadas como controle

(Tabela 3), na mesma intensidade, e inversamente proporcional ao tensoativo.

94

Tabela 3: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de estabilidade preliminar (ciclo 14 dias).

Teor de AMA mµ/g – ciclo 14 dias

Formulações Tempo zero

24 horas Tempo final

14 dias Controle

14 dias (±5°c) Controle

14 dias (±25°c)

NE 3.4 – T15 111,64 (1,40) 129,64 (2,05) 123,41 (2,66) 122,60 (2,01)

NE 3.4 – T20 130,22 (8,98) 118,99 (0,22) 103,75 (1,09) 111,48 (5,03)

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.

Analisando o comportamento das formulações, o tamanho de gotícula, PDI e

potencial zeta, não foram discriminativos para os percentuais de tensotivos

empregados. Porém, considerando a maior estabilidade do teor de AMA e o aspecto

mais fluido da formulação, contendo tensoativo a 15%, decidiu-se avaliar o

percentual de conservante em 1 e 2%, a fim de assegurar a estabilidade física,

química e microbiolpógica da formulação desenvolvida.

5.3.3 Influência do conservante na nanoemulsão selecionada

A formulação NE 3.4 - T15 (a 25% de óleo, 1,5% de EM e 15% de tensoativo)

foi selecionada e submetida ao estudo de estabilidade acelerada, alterando o

conservante em 1 e 2% (conforme metodologia descrita item 4.2.5.2). Essa alteração

teve por objetivo verificar se o percentual de conservante interfere no tamanho

médio de gotícula, PDI e potencial zeta, e preserva a qualidade microbiológica das

NE. Esta escolha se justifica com base em estudo anterior de NE com a mesma

composição qualitativa (XAVIER et al., 2015), em termos de excipientes e extrato,

porém que empregava o conservante a 0,5%, e que apresentou indício de

contaminação após 90 dias, quando as formulações foram submetidas a

estabilidade acelerada nas mesmas condições.

Em relação aos aspectos físicos, todas as formulações apresentaram-se de

consistência viscosa e aspecto opalescente, independente da alteração no

95

percentual do conservante. Todas as formulações permaneceram estáveis, sem

separação de fases após o processo de centrifugação para todas as condições de

análises, nos tempos de 24 horas, 30 e 60 dias, apresentando uma leve separação

de fase após período de 90 dias.

A coloração das NE manteve-se marrom, com a tonalidade mais clara,

conforme já descrito, não havendo alterações devido a alteração do conservante.

Na análise de caracterização o tamanho de gotícula diminuiu em todas as

formulações com EM, comparadas com suas respectivas formulações sem o EM,

exceto para a formulação NE 3.4 –T15 (C2) apenas no tempo de 24 h.

Quando analisado o comportamento das nanoemulsões sem o EM observou-

se que as formulações nas condições de temperatura ambiente e estufa

apresentaram aumento do tamanho de gotícula em todos os tempos de análises

quando comparadas com a do tempo zero (24 h), mantendo-se estáveis na

condições de geladeira, esse comportamento ocorreu independente da

concentração do conservante (Figura18).

Para as formulações contendo EM, o comportamento das nanoemulsões se

invertem, em relação ao branco, observando-se a redução do tamanho de gotícula

quando submetidas a temperatura ambiente e estufa, mantendo-se estáveis também

quando submetida a geladeira, comparadas com o tempo zero (24h) em todos os

tempos, independente da concentração do conservante (Figura 18).

Provavelmente, em consequência destas alterações, sobretudo do

conservante, que passou de 0,5% , para 1 e 2% o tamanho de gotícula foi

modificado.A faixa de variação do PDI também foi ampliada, ultrapassando o limite

máximo recomendável (Figura 18). A influência do conservante sobre a estabilidade

dos sistemas nanoemulsionados é um fator importante a ser considerado no

desenvolvimento das formulações, como já apontado por Schmitt (2015) durante a

sua pesquisa sobre a eficácia do sistema conservante em nanoemulsões.

Entretanto, não foi encontrada nehuma publicação referindo a relação do

conservante com a estabilidade física do sistema, decorrente da interação entre os

componentes da formulação.

Sabe-se que a alteração física pode ser decorrente da alterção

microbiológica, ao longo do tempo. Porém, neste estudo, o aumento do tamanho de

gotícucla já foi observado no início do estudo (tempo de 24 horas).

96

Figura 18: Tamanho de gotícula e PDI das nanoemulsões contendo extrato mole a 1,5%, óleo a 25%, tensoativo a 15%, contendo diferentes percentuais de conservante, quando submetidas ao estudo de estabilidade acelerada por 90 dias.

* O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.

97

O potencial zeta, assim como na estabilidade preliminar, aumentou na

presença do EM, mantendo-se abaixo de -20 mV para as NE branca, e acima de -40

mV na presença do extrato mole, característica observada para todos os tempos e

temperatura, independente do percentual de conservante.

Em todos os sistemas nanoemulsionados analisados neste trabalho, desde o

item 5.3, foi possível observar que a presença do EM nas NE é determinante para a

estabilidade do sistema, em termos de potencial zeta.

Observou-se novamente que a presença do EM diminui o valor de pH,

característica essa observada após 90 dias para todas as condições de análises.

Em relação ao teor de AMA, não foi possível identificar um padrão de

comportamento devido a influência do percentual de conservante, uma vez que os

valores aumentaram ou diminuíram aleatoriamente (Tabela 4). Mais uma vez é

possível identificar essa variabilidade nos percentuais de AMA como já citado

anterioremte, conforme estudo realizado por Zermiani et al. (2015).

Tabela 4: Teor de AMA por CLAE das nanoemulsões em estudo de estabilidade acelerada (90 dias).

Condições Temperatura

Formulação

Tempo

24 Horas 30 Dias 60 Dias 90 Dias

Teor AMA (µg/g) – médias (s)

Ambiente (±25 °C)

NE 3.4 – T15 (C1)

109,67 (0,24)

126,67 (0,40)

145,35 (1,36)

102,59 (0,40)

NE 3.4 – T15 (C2)

118,00 (0,53)

140,70 (0,20)

145,24 (0,71)

130,89 (0,73)

Estufa (±40° C)

NE 3.4 – T15 (C1)

--------- 111,49 (0,18)

105,32 (0,39)

95,76 (0,20)

NE 3.4 – T15 (C2)

--------- 172,50 (0,50)

103,70 (0,45)

149,70 (0,20)

Geladeira (±5° C)

NE 3.4 – T15 (C1)

--------- 123,23 (0,26)

135,89 (0,98)

113,31 (0,06)

NE 3.4 – T15 (C2)

--------- 116,96 (0,08)

114,59 (0,30)

115,11 (1,25)

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E o ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.

98

5.3.3.1 Estudo reológico dos sistemas nanoemulsionados com e sem extrato

de R. ferruginea

A reologia estuda o modo como os materiais deformam ao longo do tempo

quando submetidos a tensões. Para determinação das propriedades reológicas de

um material, deve-se medir a deformação provocada por uma dada tensão ou medir

a tensão requerida com a finalidade de se produzir uma dada deformação num

tempo determinado (JOHNSON et al., 2000).

A viscosidade de sistema líquido ou fluido depende da temperatura e de

composição e da tensão de cisalhamento ou taxa de deformação, do tempo de

cisalhamento provocado sobre ele. A classificação mais geral dos fluidos, que leva

em consideração o comportamento da relação taxa de deformação/tensão de

cisalhamento, subdivide tais materiais em newtonianos e não-newtonianos (Figura

14) (JOHNSON et al., 2000).

O comportamento reológico dos sistemas nanoemulsionados com e sem EM,

apresentou um aumento não linear da tensão de cisalhamento frente a taxa de

deformação, ou seja, o comportamento foi não newtoniano com redução da

viscosidade com o aumento da taxa de deformação, sendo classificado como

pseudoplástico, com índice de comportamento de fluxo inferior a 1.

Figura 19: Perfil de viscosidade da nanoemulsão com e sem extrato mole da R. ferruginea.

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ refere-se ao tensoativo 15. E (C1) refere-se a 1% de conservante.

99

A Figura 19 é representativa quanto ao comportamento de viscosidade e de

perfil de escoamento das nanoemulsões, sendo possível observar o comportamento

tipo pseudoplástico, caracterizados pelo decréscimo na viscosidade, com o aumento

da taxa de deformação.

Em relação a viscosidade média, a presença do EM aumentou a viscosidade

da nanoemulsão em relação a NE sem o EM no tempo de 24 h. Quando analisado

nos tempos de 30, 60 e 90 dias, observou-se uma aumento da viscosidade, mais

discreto para as nanoemulsões com o extrato, se comparado com a NE branca,

sugerindo que a presença do EM confere estabilidade as formulações, como já visto

nas análises de potencial zeta, tamanho de gotícula anteriormente, e ainda mantém

a viscosidade do sistema (Tabela 5).

Tabela 5: Análise da viscosidade média, índice de comportamento de fluxo e tixotropia para as nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea durante o estudo de estabilidade acelerada.

Condições Temperatura

Formulação Tempo

24 Horas 30 Dias 60 Dias 90 Dias

VISCOSIDADE (mpa.s)

Ambiente (±25 °C)

NE 3.1 – T15 (C1) 29,52(0,90) 49,45(1,83) 52,49(2,83) 65,22(2,15)

NE 3.4 – T15 (C1) 46,49(2,75) 53,97(1,81) 56,83(2,18) 48,43(3,03)

Estufa (±40° C)

NE 3.1 – T15 (C1) --------- 46,54(2,31) 40,59 (0,00) 81,18(0,00)

NE 3.4 – T15 (C1) ---------- 45,94(1,86) 56,64(1,78) 71,42(1,81)

Geladeira (±5° C)

NE 3.1 – T15 (C1) --------- 45,85(1,85) 47,88(4,98) 38,75(1,87)

NE 3.4 – T15 (C1) ---------- 46,59(1,81) 46,03(2,04) 47,85(3,03)

Índice de fluxo

Ambiente (±25 °C)

NE 3.1 – T15 (C1) 0,7378 0,5237 0,7823 0,8239

NE 3.4 – T15 (C1) 0,6897 0,8756 0,7793 0,9078

Estufa (±40° C)

NE 3.1 – T15 (C1) ---------- 0,609 0,6429 0,6031

NE 3.4 – T15 (C1) --------- 0,8584 0,7793 0,861

Geladeira (±5° C)

NE 3.1 – T15 (C1) --------- 0,5296 0,7464 0,8285

NE 3.4 – T15 (C1) --------- 0,7194 0,7731 0,9078

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.

100

5.3.3.2 Pesquisa de contaminação microbiológica das nanoemulsões

A formulação selecionada para esse estudo foi desenvolvida com diferentes

percentuais de conservantes (1 e 2%). As análises microbiológicas ocorreram nos

tempo zero (24h) e 9 meses, conforme metodologia item 4.2.6.6.

A pesquisa de contaminação microbiológica nas nanoemsulsões foi realizada

com o objetivo de verificar se o percentual de conservante interferiria na

conservação do sistema nanoemulsionado ao longo do tempo de armazenamento,

na condição mais crítica (estufa a 40 C).

Conforme as análises realizadas no tempo inicial (24 h), nenhuma NE

apresentou crescimento de bactérias ou fungos, nos diferentes meios de culturas,

sendo aprovado conforme os limites estabelecidos pela Farmacopéia Brasileira

(2010) para ensaios microbiológicos para produtos não estéreis (Tabela 6).

Mesmo nos testes realizados nas diluições com concentrações de 10-3 e 10-4

g/L, não houve variações significativas na contagem do número de colônias, o que

significa que o conservante está inativado, assegurando a confiabilidade do

resultado.

Tabela 6: Análise da pesquisa de contaminação microbiológica para as nanoemulsões com e sem extrato mole de R. ferruginea durante o estudo de estabilidade acelerada.

Testes Critério (Farmacopeia

Brasileira, 2010)

Contagem total – 40 °C

24 Horas 9 meses

NE 3.1 –T15 (C1)

NE 3.4 – T15 (C1)

NE 3.1 – T15 (C2)

NE 3.4 – T15 (C2)

NE 3.1 –T15 (C1)

NE 3.4 – T15 (C1)

NE 3.1 – T15 (C2)

NE 3.4 – T15 (C2)

Fungos e Leveduras

≤104

UFC/g < 102 UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

1,7 x 105

UFC/g

< 104 UFC/g

2 x 104 UFC/g

< 102 UFC/g

Bactérias ≤102

UFC/g < 102 UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

7,1 x 105

UFC/g

< 102 UFC/g

102 UFC/g

102 UFC/g

Bactérias Gram

Negativas

<102 UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

4,2 x 103

UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

< 102 UFC/g

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ refere-se ao tensoativo 15%. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.

101

Ao final de 9 meses, o teste indicou a contaminação para a NE branca e com

EM, porém ainda dentro dos limites apenas para esta última, o que evidencia a

influência positiva do extrato sobre a conservação microbiana (Tabela 7). Este

resultado é coerente com a propriedade antimicrobiana já comprovada para o extrato

dos frutos da R. ferruginea, o qual demonstrou que os compostos identificados como

ácidos mirsinoicos A e B apresentaram atividade antibacteriana significativa contra

Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis (CRUZ et al., 2013).

5.4 Atividade anti-inflamatória in vivo dos sistemas nanoemulsionados

Este estudo investigou a atividade anti-inflamatória do extrato bruto dos frutos

da Rapanea ferruginea in vivo utilizando o modelo de bolsa de ar. Os resultados

mostram que nos camundongos tratados com o extrato dos frutos da R. ferruginea

houve redução do número total de leucócitos migrados para a cavidade formada no

modelo bolsa de ar nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg, assim como nas doses de 3, 30

e 100 mg/kg da nanoemulsão quando comparadas com o grupo veículo. No entanto,

pode-se observar que as preparações de nanoemulsões apresentaram maior

atividade inibitória da migração de leucócitos quando comparadas com o extrato em

todas as doses testadas. O tempo de preparo das nanoemulsões não induziu

diferença significativa na atividade testada. Ainda, quando comparadas com o grupo

tratado com indometacina, as doses de 30 e 100 mg/kg da nanoemulsão houve

diferença significativa. A nanoemulsão branca, ou seja sem a incorporação do

extrato, inibiu a migração de leucócitos para o foco inflamatório quando comparado

com o grupo que recebeu apenas veículo (Figura 20). O composto isolado, ácido

mirsinóico A, inibiu significativamente a migração de leucócitos para a cavidade

formada no modelo de bolsa de ar.

102

Figura 20: Efeito do extrato mole dos frutos da Rapanea ferruginea, de nanoemulsões com incorporação deste extrato no tempo 0 e em 90 dias após o preparo e do ácido mirsinóico A na migração de leucócitos induzida por carragenina 1% no modelo de bolsa de ar.

*Foram empregados camundongos Balb/C tratados com extrato bruto dos frutos de Rapanea ferruginea nas doses de 3, 30 e 300 mg/kg, indometacina (Indo, 30 mg/kg), nanoemulsão do extrato bruto de Rapanea ferruginea nas doses de 3, 30 e 100 mg/kg, nanoemulsão branca na dose de 100 mg/kg, ácido mirsinóico (30 mg/kg) ou veículo. Os resultados expressam a média ± e.p.m de células coletadas de 06 animais em cada grupo e foram analisados por ANOVA. *p<0,05 e ***p<0,001 vs veículo; #p<0,05 vs indometacina.

Em conjunto, os dados obtidos sugerem a atividade anti-inflamatória do

extrato da R. ferruginea, a nanoemulsão contendo o extrato e do ácido mirsinóico A,

pois inibiram a migração de leucócitos nas doses testadas. Da mesma forma, os

resultados obtidos no presente estudo também foram observados, em plantas da

mesma família, como a Ardisia tinctoria. De acordo com Kim e colaboradores (2014),

ainda, Ardisia tinctoria inibiu consideravelmente a espessura do edema na pata

induzida pela carragenina. A redução do edema é um importante marcador da

atividade anti-inflamatória.

Igualmente, trabalhos realizados com a Myrsine seguinii (Rapanea neriifolia),

planta da mesma família, espécie da qual foram isolados os ácidos mirsinoicos A, B,

C e F, os quais mostraram atividade anti-inflamatória tópica suprimindo edema de

orelha em ratos induzidos por TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato), sendo que

o AMB (ácido mirsinoico B) apresentou redução de 83% do edema gerado no grupo

controle (HIROTA et al., 2002; MAS, 2015). Estudo realizado com ratos, usando o

modelo de edema de orelha induzido por TPA, demonstrou que a atividade anti-

Veículo Indo 3 30 300 Branca Branca 3 30 100 100 AMA0

2

4

6

8

10

Nanoemulsões de

R. ferruginea (mg/kg)

T0 T0 T90

***

*

******

#

***

#

***

#

NS*

Extrato bruto dos frutos

R. ferruginea (mg/kg)

***

T90

**

NS

To

tal

de l

eu

có

cit

os

(x10

6 c

élu

las)

***

103

inflamatória do AMA inibe seletivamente a DNA polimerase em mamíferos,

diminuindo a proliferação celular. Segundo os autores, o efeito inibitório sobre as

polimerases tem relação com a supressão do processo inflamatório (MIZUSHINA et

al., 2000; MAS, 2015).

104

105

6 CONCLUSÃO

Em conjunto, a caracterização da droga vegetal, da solução extrativa e do

extrato mole contribuem para o conhecimento da espécie e para o controle do

processo de obtenção dos derivados vegetais em estudo.

O teor de AMA apresenta alta variabilidade nas suas diferentes formas de

apresentação (solução extrativa, extrato mole e nanoemulsões), provavelmente

associado a sua natureza fluida e oleosa, refletindo numa dificuldade analítica.

No estudo de desenvolvimento dos sistemas nanoemulsionados, o nível de

óleo mostrou ser um fator determinante para o aumento do tamanho de gotícula,

independente da concentração do extrato mole. O aumento do percentual de

tensoativo confere maior estabilidade as formulações frente ao estresse forçado pela

centrifugação.

No decorrer dos estudos de estabilidade preliminar e acelerado, evidenciou-

se a influência positiva do extrato mole nas características físicas dos sistemas

nanoemulsionados, sobre o potencial zeta e PDI.

No estudo de estabilidade acelerada, a viscosidade aumenta no decorrer do

tempo. A contaminação microbiológica foi aceitável até o período de análise de 9

meses manteve-se estável apenas na presença do extrato mole.

A alteração no percentual de conservante influencia não somente a

estabilidade microbiológica dos sistemas, visto que uma maior concetração de

conversante, manteve o índice de contaminação menor após 9 meses dos sistemas

nanoemulsionados, mas também o tamanho de gotícula e PDI, que mostraram

alterações relevantes.

A análise farmacológica sugere que o extrato mole dos frutos da R. ferruginea

exibe efeito anti-inflamatório em animais, via oral, com diminuição de edema, efeito

esse potencializado quando o extrato mole está nanoemulsionado.

Por fim, o presente estudo otimizou uma nanoemulsão com tamanho de

gotícula de 200 nm, a qual mostra-se um sistema estável e com potencial efeito anti-

inflamatório em estudo in vivo.

106

107

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APÊNDICES

Tabela 1: Características das formulações no tempo de 24 horas e após 30 dias de seu desenvolvimento.

CARACTERIZAÇÃO QUANTO A MORFOLOGIA DAS FORMULAÇÕES

FORMULAÇÕES

TAMANHO DE GOTÍCULA Médias (s)

(24 HORAS)

TAMANHO DE GOTÍCULA Médias (s) (30 DIAS)

PDI Média (s)

(24 HORAS)

PDI Média (s) (30 DIAS)

POTENCIAL ZETA

Médias (s) (24 HORAS)

POTENCIAL ZETA

Médias (s) (30 DIAS)

GR

UP

O 1

NE 1.1 130,15 (1,06) 141,40 (1,41) 0,118 (0,01) 0,111 (0,00) -16,15 (0,64) -17,70 (0,14)

NE 1.2 113,85 (0,21) 129,30 (3,11) 0,175 (0,02) 0,141 (0,02) -38,30 (5,09) -38,00 (4,10)

NE 1.3 124,35 (7,14) 132,10 (12,3) 0,200 (0,01) 0,165 (0,01) -40,95 (1,20) -48,35 (6,15)

NE 1.4 120,45 (2,05) 137,25 (21,4) 0,167 (0,14) 0,200 (0,10) -42,10 (0,42) -46,80 (7,92)

GR

UP

O 2

NE 2.1 148,10 (0,28) 161,40 (3,54) 0,128 (0,01) 0,122 (0,01) -17,20 (0,71) -15,85 (0,92)

NE 2.2 158,55 (6,43) 168,30 (7,92) 0,158 (0,02) 0,123 (0,01) -38,80 (2,83) -37,45 (1,63)

NE 2.3 167,40 (5,80) 182,4 (10,32) 0,149 (0,02) 0,128 (0,03) -42,05 (1,91) -44,95 (1,63)

NE 2.4 158,10 (6,51) 172,55 (7,99) 0,152 (0,02) 0,119 (0,02) -45,05 (2,05) -45,20 (0,85)

GR

UP

O 3

NE 3.1 191,25 (7,14) 207,00 (5,23) 0,144 (0,03) 0,129 (0,04) -15,05 (0,69) -13,15 (1,63)

NE 3.2 189,90 (7,64) 209,20 (7,78) 0,157 (0,03) 0,142 (0,01) -39,40 (0,42) -32,60 (1,56)

NE 3.3 191,40 (0,42) 209,15 (4,17) 0,123 (0,01) 0,145 (0,02) -42,25 (0,92) -40,50 (2,12)

NE 3.4 180,70 (4,10) 199,25 (0,78) 0,127 (0,03) 0,156 (0,02) -46,70 (4,24) -41,40 (6,36)

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco, ―.2‖, ―.3‖ e ―.4‖ correspondem a 0,5, 1 e 1,5% de extrato mole, respectivamente.

124

Tabela 2: Características das formulações durante o estudo de estabilidade preliminar (ciclo 28 dias).

Condições (tempo e

temperatura)

Tempo zero Ciclo gelo-degelo (5°C/40°C)

A cada 24 horas Controles

24 Horas 14 Dias 28 Dias 28 Dias (±5°C)

28 Dias (±25°C)

Tamanho médio de gotícula (nm) – médias (s)

NE 1.1 140,95 (4,45) 151,20 (2,12) 150,35 (1,48) 145,50 (3,82) 149,20 (3,82)

NE 1.4 139,80 (0,71) 146,10 (2,26) 145,45 (1,06) 145,10 (2,26) 147,20 (0,71)

NE 2.1 175,45 (9,12) 182,60 (14,14) 185,25 (5,30) 181,50 (7,35) 185,40 (5,23)

NE 2.4 176,20 (6,79) 181,30 (5,37) 179,30 (4,53) 178,25 (8,70) 178,50 (7,64)

NE 3.1 184,60 (8,63) 182,20 (3,39) 193,35 (1,48) 187,55 (5,06) 183,40 (5,09)

NE 3.4 192,60 (6,08) 197,60 (4,53) 195,55 (11,53) 197,90 (5,52) 197,45 (7,85)

Indice de polidispersão (PDI) – médias (s)

NE 1.1 0,131 (0,03) 0,104 (0,00) 0,129 (0,00) 0,149 (0,00) 0,125 (0,03)

NE 1.4 0,133 (0,00) 0,123 (0,01) 0,140 (0,00) 0,144 (0,01) 0,150 (0,01)

NE 2.1 0,181 (0,02) 0,142 (0,02) 0,163 (0,02) 0,161 (0,03) 0,170 (0,05)

NE 2.4 0,141 (0,01) 0,145 (0,01) 0,139 (0,01) 0,137 (0,01) 0,145 (0,00)

NE 3.1 0,194 (0,04) 0,169 (0,02) 0,171 (0,01) 0,189 (0,03) 0,169 (0,00)

NE 3.4 0,173 (0,01) 0,154 (0,00) 0,133 (0,00) 0,155 (0,00) 0,161 (0,00)

Potencial zeta – médias (s)

NE 1.1 -17,40 (0,14) -17,75 (0,21) -16,35 (0,21) -15,50 (0,85) -15,20 (1,98)

NE 1.4 -40,90 (0,85) -45,00 (9,62) -41,20 (5,09) -41,40 (2,12) -40,35 (0,92)

NE 2.1 -18,10 (2,55) -20,35 (2,90) -19,45 (2,05) -19,40 (1,70) -17,65 (3,32)

NE 2.4 -47,45 (1,91) -46,00 (0,85) -43,60 (3,25) -43,25 (0,49) -43,00 (1,70)

NE 3.1 -17,70 (0,28) -19,10 (0,99) -19,40 (0,14) -17,90 (1,41) -16,50 (0,85)

NE 3.4 -44,45 (0,78) -44,75 (3,32) -44,30 (4,38) -44,40 (0,14) -46,70 (1,13)

Valor de pH – medias (s)

NE 1.1 6,59 (0,04) 6,39 (0,02) 6,11 (0,04) 6,18 (0,07) 6,29 (0,11)

NE 1.4 5,27 (0,04) 5,24 (0,07) 5,08 (0,04) 5,22 (0,07) 5,15 (0,01)

NE 2.1 6,54 (0,09) 6,23 (0,06) 6,09 (0,01) 6,15 (0,04) 6,16 (0,10)

NE 2.4 5,38 (0,01) 5,24 (0,01) 5,13 (0,04) 5,22 (0,03) 5,18 (0,04)

NE 3.1 6,61 (0,05) 6,34 (0,04) 6,75 (0,16) 6,18 (0,05) 6,51 (0,54)

NE 3.4 5,35 (0,08) 5,22 (0,06) 5,07 (0,02) 5,25 (0,07) 5,16 (0,07)

*Os primeiros algarismos 1, 2 e 3 correspondem a 15, 20 e 25% de óleo, respectivamente. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole.

125

Tabela 3: Características das formulações durante o estudo de estabilidade preliminar (ciclo 14 dias).

Condições (tempo e

temperatura)

Tempo zero Ciclo gelo-degelo (5°C/40°C)

A cada 24 horas Controles

24 Horas 7 Dias 14 Dias 14 Dias (±5°C)

14 Dias (±25°C)

Tamanho médio de gotícula (nm) – médias (s)

NE 3.1 – T 15

164,05(10,96) 164,25(25,67) 186,05(20,29) 170,60 (9,62) 176,50 (5,23)

NE 3.4 – T 15

135,05 (0,21) 156,0(14,85) 145,15 (3,89) 137,00 (1,56) 140,55 (0,07)

NE 3.1 – T 20

105,00 (2,12) 119,30 (2,83) 130,00 (3,54) 107,95 (3,61) 123,00 (0,57)

N2 3.4 – T 20 98,26 (1,27) 108,50 (0,57) 114,05 (0,07) 102,50 (0,00) 110,70 (1,70)

Indice de polidispersão (PDI) – médias (s)

NE 3.1 – T 15

0,141 (0,04) 0,121 (0,04) 0,107 (0,03) 0,133 (0,06) 0,112 (0,02)

NE 3.4 – T 15

0,186 (0,01) 0,168 (0,02) 0,175 (0,01) 0,174 (0,02) 0,178 (0,02)

NE 3.1 – T 20

0,187 (0,02) 0,146 (0,03) 0,141 (0,01) 0,171 (0,00) 0,163 (0,01)

N2 3.4 – T 20 0,200 (0,01) 0,205 (0,00) 0,185 (0,01) 0,189 (0,01) 0,182 (0,01)

Potencial zeta – médias (s)

NE 3.1 – T 15

-14,95 (0,92) -17,95 (0,21) -16,40 (1,98) -18,10 (0,85) -16,25 (0,21)

NE 3.4 – T 15

-38,15 (4,03) -44,05 (1,77) -42,40 (1,70) -37,30 (1,27) -42,40 (2,83)

NE 3.1 – T 20

-11,85 (0,21) -17,70 (4,38) -17,15 (0,64) -14,65 (0,21) -17,00 (0,85)

N2 3.4 – T 20 -42,40 (2,26) -41,70 (6,08) -43,10 (1,41) -36,35 (0,35) -49,35 (0,49)

Valor de pH – medias (s)

NE 3.1 – T 15

6,94 (0,11) 6,65 (0,15) 6,56 (0,04) 6,90 (0,01) 6,98 (0,25)

NE 3.4 – T 15

5,58 (0,01) 5,61 (0,01) 5,46 (0,20) 5,35 (0,04) 5,17 (0,01)

NE 3.1 – T 20

7,05 (0,06) 6,79 (0,31) 6,39 (0,16) 6,85 (0,06) 6,41 (0,10)

N2 3.4 – T 20 5,68 (0,04) 5,33 (0,04) 5,27 (0,05) 5,47 (0,01) 5,54 (0,04)

*O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente.

126

Tabela 4: Características das formulações durante o estudo de estabilidade acelerada (90 dias).

Formulações

Tempos de análises

24 h 30 Dias 60 Dias 90 Dias 24 h 30 Dias 60 Dias 90 Dias 24 h 30 Dias 60 Dias 90 Dias

condiçoes Tamanho médio de gotículas (nm) –

médias (s) Índice de polidispersão – pdi

médias (s) Potencial zeta

médias (s)

Am

bie

nte

(±30 °

C) NE 3.1 – T15

(C1) 246,0 (34,3)

262,6 (3,00)

294,0 (5,55)

305,3 (7,11)

0,274 (0,04)

0,239 (0,00)

0,178 (0,01)

0,226 (0,01)

-17,8 (0,55)

-19,0 (0,41)

-16,8 (0,57)

-20,7 (0,36)

NE 3.4 – T15 (C1)

183,9 (2,05)

200,5 (176)

176,8 (0,95)

167,1 (1,30)

0,270 (0,01)

0,260 (0,02)

0,260 (0,01)

0,257 (0,01)

-38,6 (0,32)

-39,7 (0,56)

-42,5 (1,44)

-36,8 (0,64)

NE 3.1 – T15

(C2) 189,4 (0,82)

183,2 (1,35)

277,3 (3,95)

207,2 (1,96)

0,142 (0,02)

0,140 (0,02)

0,237 (0,01)

0,102 (0,02)

-17,1 (0,38)

-15,6 (0,26)

-21,1 (0,29)

-17,5 (0,40)

NE 3.4 – T15 (C2)

203,5 (1,57)

164,3 (1,27)

172,8 (1,18)

176,5 (0,95)

0,329 (0,04)

0,287 (0,00)

0,305 (0,01)

0,310 (0,01)

-40,4 (0,87)

-39,0 (0,75)

-40,7 (0,35)

-39,9 (0,36)

Estu

fa (

±40°

C)

NE 3.1 – T15 (C1)

--------- 285,1 (4,31)

309,3 (0,61)

304,3 (3,29)

---------- 0,235 (0,02)

0,204 (0,01)

0,194 (0,04)

--------- -19,3 (0,40)

-17,8 (0,20)

-14, 5 (0,61)

NE 3.4 – T15 (C1)

--------- 269,5 (2,27)

166,3 (1,25)

173,7 (0,32)

---------- 0,250 (0,01)

0,244 (0,02)

0,261 (0,01)

--------- -41,1 (0,20)

-39,7 (0,50)

-37,1 (0,68)

NE 3.1 – T15

(C2) ---------

222,1 (3,78)

263,2 (6,44)

225,0 (2,94)

---------- 0,069 (0,01)

0,171 (0,01)

0,023 (0,01)

--------- -18,1 (0,41)

-16,8 (0,95)

-18,1 (0,76)

NE 3.4 – T15 (C2)

--------- 176,4 (1,87)

164,0 (0,95)

152,1 (0,95)

---------- 0,302 (0,01)

0,289 (0,01)

0,244 (0,02)

--------- -38,0 (0,60)

-39,1 (0,52)

-37,0 (0,17)

Gela

deir

a (

±5°C

)

NE 3.1 – T15 (C1)

--------- 237,7 (5,29)

234,9 (5,60)

246,7 (1,80)

---------- 0,289 (0,01)

0,282 (0,04)

0,259 (0,01)

--------- -18,3 (0,23)

-19,6 (0,38)

-18,3 (0,15)

NE 3.4 – T15 (C1)

--------- 201,2 (0,51)

218,6 (1,22)

215,7 (1,55)

--------- 0,263 (0,01)

0,242 (0,01)

0,257 (0,01)

--------- -39,6 (0,76)

-40,6 (0,78)

-41,2 (0,26)

NE 3.1 – T15 (C2)

--------- 193,1 (1,23)

196,2 (3,40)

203,4 (1,55)

--------- 0,145 (0,01)

0,109 (0,01)

0,196 (0,03)

--------- -18,3 (0,55)

-19,2 (0,35)

-16,7 (0,70)

NE 3.4 – T15 (C2)

--------- 183,7 (1,36)

189,7 (4,40)

182,3 (0,90)

---------- 0,293 (0,02)

0,328 (0,04)

0,300 (0,01)

--------- -40,4 (0,46)

-43,8 (0,35)

-40,7 (0,10)

* O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante. *s (desvio padrão).

127

Tabela 5: Valores de pH das nanoemulsões durante o estudo de estabilidade acelerada (90

dias). *O primeiro algarismo 3 correspondem 25% de óleo. E os seguintes ―.1‖ refere-se ao branco e ―.4‖ correspondem a 1,5% de extrato mole. ―T 15‖ e ‖T 20‖ refere-se ao tensoativo 15 e 20%, respectivamente. E (C1) e (C2) refere-se a 1 e 2% de conservante.

Condições Temperatura

Formulações 24 Horas 90Dias

Ambiente (±25 °C)

NE 3.1 – T15 (C1) 6,12 (0,02) 5,06 (0,04)

NE 3.4 – T15 (C1) 4,96 (0,07) 4,81 (0,02)

NE 3.1 – T15 (C2) 6,15 (0,03) 6,08 (0,02)

NE 3.4 – T15 (C2) 5,16 (0,04) 5,06 (0,01)

Estufa

(±40° C)

NE 3.1 – T15 (C1) --------- 4,94 (0,01)

NE 3.4 – T15 (C1) --------- 4,93 (0,01)

NE 3.1 – T15 (C2) --------- 5,24 (0,06)

NE 3.4 – T15 (C2) --------- 5,73 (0,03)

Geladeira

(±5° C)

NE 3.1 – T15 (C1) --------- 6,93 (0,04)

NE 3.4 – T15 (C1) --------- 5,50 (0,04)

NE 3.1 – T15 (C2) -------- 6,33 (0,04)

NE 3.4 – T15 (C2) --------- 5,23 (0,04)

128

129

ANEXOS

Anexo A - Parecer Comissão de Ética no uso de animais – CEUA/UNIVALI.

130