M t di l l i ilMetodi molecolari per il riconoscimento dei cianobatteririconoscimento dei cianobatteri

e dei genotipi tossicig p

Susanna VichiSusanna Vichi

Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione PrimariaIstituto Superiore di Sanità, Roma

Workshop “Sorveglianza delle fioriture di cianobatteri nelle acque di balneazione: approccio per l’applicazione del DL 30 maggio 2008 N.112 in recepimento della direttiva 2006/7EC” - ISS, 19 maggio 2009

Identificazione di cianobatteri nella metodica tradizionale : li i f l i i l i ianalisi morfologica osservazione al microscopio

Limiti: • soggettività dell’operatore nell’interpretazione dellaLimiti: • soggettività dell operatore nell interpretazione dellamorfologia delle cellule

• impossibilità di discriminare tra specie tossiche e nonp p

Necessita la combinazione con saggi chimici, biochimici o enzimatici sulle tossine

L’APPROCCIO GENETICO nel monitoraggio ambientalett di i il f d ll fi it i d ll f ipermette di seguire il fenomeno delle fioriture sin dalle fasi

più precoci attraverso identificazione tassonomica edeventuale rilevazione di ceppi potenzialmente tossicieventuale rilevazione di ceppi potenzialmente tossici.

APPROCCI MOLECOLARI COMUNI NELLA DETERMINAZIONEDI CIANOBATTERI.

Campione ambientale

E t iEstrazione DNA/RNA

Analisi quantitativa

PCR

DGGE

Real-timePCR

BioinformaticaRFLP

DGGE

(Sequenziamento, Allineamento)RFLP

Analisi qualitativa

CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI CIANOBATTERI:

1. Definizione TASSONOMICA degli individui (genere specie ceppo)(genere, specie, ceppo)

2. Definizione di specifiche SONDE MOLECOLARI per l’identificazione di specie tossiche

1. Definizione TASSONOMICA e analisi filogenetica di campioni ambientali (a livello di genere, specie, ceppo):ambientali (a livello di genere, specie, ceppo):

Geni housekeeping come marker filogenetici:

- Amplificazione dell’INTERGENIC SPACER nell’operone FICOCIANINA(regione potenzialmente ad alta variabilità)

p g g

(regione potenzialmente ad alta variabilità)

PC-IGS

BcpcB cpcA cpcC cpcD cpcE

2 biline α e β 3 peptidi linker

cautela nella scelta del marcatore!!Il locus può accumulare mutazioni nel periodo di colturaIl locus può accumulare mutazioni nel periodo di colturaPuò essere inaffidabile

- Amplificazione all’interno del gene per l’rRNA 16S:- Amplificazione all interno del gene per l rRNA 16S:Ottima stabilità, affidabilità

disegnati in regioniPrimers universali PCR Analisi RFLP

ben conservate

Rischio: L’analisi della sequenza 16S rRNA può essere non sufficientemente sensibile nella

discriminazione di specie strettamente correlate

- Amplificazione di altri marcatori (geni nif, rpoC1, gyrB)

Es: Ricerca di Planktothrix mediante amplificazione del marker rDNA 16S

Campioni ambientali eterogenei

DNA

amplificazione della regione rDNA 16S come marcatoregenere-specfico di Planktothrix

1 2 3 4 5 6L 1 di Pl kt th i

ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO

Lane 1 = assenza di Planktothrix Lane 2,3,4 = Planktothrix Lane 5 = biancoLane 6 = ladder

2. Definizione di specifiche SONDE MOLECOLARI per la ricerca dispecie tossiche all’interno di un campione ambientalespecie tossiche all interno di un campione ambientale

L’identificazione di eventuali specie tossiche si realizza mediante laricerca di specifici geni marker (mcy) raggruppati in cluster chericerca di specifici geni marker (mcy), raggruppati in cluster, checodificano per grandi complessi multienzimatici (NRPS o PeptideSintetasi Non Ribosomali) coinvolti nella biosintesi delle Microcistine.

Cluster mcy per la biosintesi delle microcistine (Planktothrix genera).Raggruppa 9 geni che codificano per diversi domini del complesso

C OC S S S

10 20 30 40 50 kb

multienzimatico della MICROCISTINA SINTETASI.

mcyT mcyH mcyA mcyB mcyC mcyJmcyE mcyGmcyD

= Peptide Sintetasi = Polichetide Sintasi = Trasporto= Modifica

Ortologhi dei geni mcy sono stati trovati in altre specie di Cianobatteritossici inclusi Microcystis, Nostoc, Anabaena, Nodularia.

Nel cluster mcy possono essere presenti delezioni anche estese in grado di alterare la funzionalità del prodotto proteico

Es: Ricerca di microcistine in relazione alla presenza di marcatori mcyin colture di P. agardhii e P. rubescens (modified from S. Mbedi et al., 2005).

Ceppo microcistina mcyT mcyTD mcyA mcyB mcyE

P. agardhii HUB076/A1 + + + + + +

g

P. agardhii HUB076/A1 + + + + + +P. agardhii LAN2 - - - - - -P. agardhii Max01 - + + - - -P. agardhii Max02 - + - - - -P. agardhii Max08 - + + - - -P. rubescens BL1 + + + - + +P. rubescens BL11 + + + + + +P rubescens HUB148 + + + + +P. rubescens HUB148 + + + - + +

+ = falsi positivi - = falsi negativi

Es.: Ricerca e quantificazione di genotipi tossici di Planktothrix nelle acque del lago di Vico mediante Real time PCR (qPCR).

Campione ambientale

Cellule su filtro 0,2 µm; Conservazione a -20°C

Estrazione DNA (kit commerciali)

Taq Nuclease Assay (o saggio Taqman):

Amplifica ione all’interno dei loci rDNA 16SAmplificazione all’interno dei loci rDNA 16S(per la definizione tassonomica) e mcyB (come marcatore di tossicità).Coppia di primers specifici + sonda fluorescente

Emissione di fluorescenza (Ct) durante lareazione di PCR strettamente correlata numeroreazione di PCR strettamente correlata numerodi copie target presenti inizialmente.

Es. MONITORAGGIO LAGO DI GEROSA (1 anno di rilevamenti - ottobre 2006-ottobre 2007):( )

novembre 2006: picco conc. cell. bassa conc. microcistinedicembre 2006: bassa conc. cell. picco conc. microcistine

November(surface)

December(surface)(surface) (surface)

Microcystins(µg/l)

ELISA 1,28 2,04LC/MS 0 046 0 4(µg/l) LC/MS 0,046 0,4

Cells n.(106)

44 3,7(10 )

31% 63,7%mcyB vs Pc

(%)qPCR

Lo sfasamento tra il numero degli individui e la produzione della microcistina può essere parzialmente spiegato con una variazione della percentuale degli

qPCR

può essere parzialmente spiegato con una variazione della percentuale degli individui ‘tossici’ rispetto a quelli ‘non tossici’.

La bioinformatica come potente strumento nella identificazionedi popolazioni in campioni ambientalip p p

PCR

SequenziamentoSequenziamento

Programmi di allineamento di sequenze (BLAST, CLUSTALW)

Confronto con banche dati;Ricerca del “best match”Ricerca del best match

Si risale all’organismo; Si ipotizzano relazioni filogenetiche

B i L l Ali t S h T lBasic Local Alignment Search Tool

BLAST è l it tti i t iBLAST è un algoritmo ottimizzato per ricercare regioni di locale omologia tra sequenze presenti nel

d t bdatabase.

1 Id tifi i di i b tt i tt1. Identificazione di cianobatteri attraversoil confronto con banche dati

Ri d l b t t hRicerca del best-match

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(BLAST)

2 Valutazione della capacità discriminante di2. Valutazione della capacità discriminante di primers per l’identificazione di specie di

cianobattericianobatteri

ClustalW

Allineamento multiplo di sequenze

Disegno di primers per la discriminazioneDisegno di primers per la discriminazione molecolare di specie di cianobatteri

Planktothrix Rubescens (seq.1-15) vs Planktothrix Agardhii (seq.16-30)C-phycocyanin alpha subunit (cpcA) gene, partial cds CLUSTAL W (1.81) Multiple Sequence Alignmentsp q g Sequence type explicitly set to DNA Sequence format is Pearson Sequence 1: gi|166863955|gb|EU266300.1|_Pl Sequence 2: gi|166863953|gb|EU266299.1| Pl q g g _Sequence 3: gi|166863951|gb|EU266298.1|_Pl Sequence 4: gi|166863949|gb|EU266297.1|_Pl Sequence 5: gi|166863947|gb|EU266296.1|_Pl Sequence 6: gi|166863945|gb|EU266295.1|_Pl Sequence 7: gi|166863943|gb|EU266294.1| Pl q g g _Sequence 8: gi|166863941|gb|EU266293.1|_Pl Sequence 9: gi|166863939|gb|EU266292.1|_Pl Sequence 10: gi|166863937|gb|EU266291.1|_Pl Sequence 11: gi|166863935|gb|EU266290.1|_Pl Sequence 12: gi|166863929|gb|EU266287.1| Pl q g g _Sequence 13: gi|166863927|gb|EU266286.1|_Pl Sequence 14: gi|166863921|gb|EU266283.1|_Pl Sequence 15: gi|166863919|gb|EU266282.1|_Pl Sequence 16: gi|166863961|gb|EU266303.1|_Pl Sequence 17: gi|166863959|gb|EU266302.1| Pl q g g _Sequence 18: gi|166863957|gb|EU266301.1|_Pl Sequence 19: gi|166863933|gb|EU266289.1|_Pl Sequence 20: gi|166863931|gb|EU266288.1|_Pl Sequence 21: gi|166863925|gb|EU266285.1|_Pl Sequence 22: gi|166863923|gb|EU266284.1| Pl q g g _Sequence 23: gi|166863911|gb|EU266278.1|_Pl Sequence 24: gi|166863909|gb|EU266277.1|_Pl Sequence 25: gi|166863903|gb|EU266274.1|_Pl Sequence 26: gi|166863901|gb|EU266273.1|_Pl Sequence 27: gi|166863899|gb|EU266272.1| Pl q g g _Sequence 28: gi|166863897|gb|EU266271.1|_Pl Sequence 29: gi|166863891|gb|EU266268.1|_Pl Sequence 30: gi|166863887|gb|EU266266.1|_Pl Start of Pairwise alignments

clustalw.aln CLUSTAL W (1.81) multiple sequence alignment Sequences (1:2) Aligned. Score: 50.7109 Sequences (1:3) Aligned. Score: 50.7109Sequences (1:3) Aligned. Score: 50.7109Sequences (1:4) Aligned. Score: 50.7109 ……. Sequences (2:2) Aligned. Score: 50.7109 Sequences (2:3) Aligned. Score: 50.7109 Sequences (2:4) Aligned. Score: 50.7109 ……. Sequences (30:29) Aligned. Score: 49.763 Sequences (30:30) Aligned. Score: 49.763 CLUSTAL-Alignment file created [clustalw.aln]

clustalw.aln gi|166863949|gb|EU266297.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863947|gb|EU266296.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863945|gb|EU266295.1| Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT g g _gi|166863943|gb|EU266294.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863941|gb|EU266293.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863939|gb|EU266292.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863925|gb|EU266285.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863901|gb|EU266273.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT i|166863931| b|EU266288 1| Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGTgi|166863931|gb|EU266288.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863905|gb|EU266275.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863957|gb|EU266301.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863933|gb|EU266289.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863907|gb|EU266276.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863917|gb|EU266281.1| Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGTgi|166863917|gb|EU266281.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863913|gb|EU266279.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863935|gb|EU266290.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863921|gb|EU266283.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863919|gb|EU266282.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863915|gb|EU266280.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863937|gb|EU266291.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863927|gb|EU266286.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAAATCCAAGTGGCTTTTGGTCGT gi|166863899|gb|EU266272.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAACTGCAAGTGGCTTTCGGACGT gi|166863897|gb|EU266271.1|_Pl CTCAAGGCCGTTTCCTGAGCAGCACTGAACTGCAAGTGGCTTTCGGACGT ***************************** * *********** ** ***

USO DI METODOLOGIE MOLECOLARI NELLA CARATTERIZZAZIONEDI CIANOBATTERI: VANTAGGI

• Rapidi e relativamente economici

• Alta specificità e sensibilità

• Permettono di discriminare tra ceppi morfologicamente identici• Permettono di discriminare tra ceppi morfologicamente identici

• Consentono il diretto utilizzo del campione ambientale, senza dovernecessariamente allestire una coltura cellularenecessariamente allestire una coltura cellulare

• Saggi qualitativi / quantitativi / di espressione(PCR) (qPCR) (RT-PCR)

• Permettono di risalire all’organismo produttore della tossina

• Non richiedono processamento immediato del campione, che puòessere conservato nel tempo

Permettono di risalire all organismo produttore della tossina

p

USO DI METODOLOGIE MOLECOLARI NELLA CARATTERIZZAZIONEDI CIANOBATTERI: LIMITI

• Database di sequenza talvolta lacunosi per alcune specie:

DI CIANOBATTERI: LIMITI

difficoltà nel disegno di primers efficaci

• Variabilità di sequenza intra-specie rischio di sottostimare la popolazione se i primers scelti non sono disegnati entro regioni ben conservateconservate

• Possono dare falsi negativi o falsi positivi se i geni marker non sonoPossono dare falsi negativi o falsi positivi se i geni marker non sonoopportunamente scelti

• Danno una stima del DNA totale, non permettono discriminare tra cellulevive e morte