Modelli per la regolazione della cromatina durante l’inizio della trascrizione

Acetilazione di H3 ed H4mostra dei picchi suipromotori attivi.

Le HAT Gcn5 ed Esa1 vengonorichiamate sui promotori attiviin tutto il genoma

Gli attivatori tendono a posizionarsi su regioniaccessibili.

Questi eventi avvengono primadella formazione del PIC nel gene GAL1, ma può esserediverso per altri geni.

Anche complessi ATP dipendentipossono essere richiamatiIl richiamo dei vari fattori è disolito coordinato

Molti promotori a livello genomicomostrano la presenza di PIC parziali.

PANORAMA DELLA CROMATINA DURANTE L’ALLUNGAMENTO TRASCRIZIONALE

Al 5’ dell’ORFPAF è caricato sulla forma Pser5del CTD di PolII•Recluta COMPASS (Set1) per lametilazione di H3K4•Mantiene il legame di Rad6/Bre1 per la ubiquitinazione di H2B•Recluta FACT per l’assemblaggio dei nucleosomi

Al 3’ dell’ORF•Set2 si lega alla forma Pser2del CTD di PolII per la trimetilazione di H3K36TFIIS e RSC contribuiscono a facilitare la trascrizione attraverso i nucleosomi.

Gradiente delle modificazioni istoniche su geni attivi: H3K4

*H3K4me2, H3K4me3, H2BUb1 sono ilsegnale critico per definire un dominio intrascrizione e la frequenza di passaggiodella Polimerasi.

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•Set1 produce H3K4me1 a un livello basaleindipendentemente da PAF•Set1 converte H3K4me1 in H3K4me2/me3in maniera dipendente da PAF H2BUb1 è necessaria per la di e trimetilazione.

La funzione del segnale H3K4me3 èdi reclutare fattori di rimodellamento:NuRDhTip60mSIN3/HDACyNuA3yChd1Tutti contengono un dominio PHD chelega la lisina trimetilata

Gradiente delle modificazioni istoniche su geni attivi: H3K36

Set2 produce H3K36me2/me3

Segnale riconosciuto da Eaf3,subunità del complesso istonedeacetilasi Rpd3SSi crea un ambiente ipoacetilatoal 3’ dell’ORF

REGOLAZIONE DELLA DINAMICA NUCLEOSOMALE NELL’ALLUNGAMENTO

•I nucleosomi contrastano la progressione della Polimerasi II in fase di allungamento.•PolII in trascrizione su nucleosomi si arresta su alcuni siti •L’arresto causa un arretramento (backtracking)

•TFIIS con il complesso CTEA (chromatin trx enabling activity) riattiva PolII arretrata.•PolII spiazza i dimeri H2A-H2B.•FACT, SPT6 o Asf1 ridepositano i dimeri o depositano le forme libere presenti in forma acetilata alle spalle di PolII.•Set2 metila in K4 e K36 i nucleosomi riassemblati.•Eaf3 riconosce H3K36me3 e recluta Rpd3S•Segue una generale deacetilazione istonica

•Durante la progressione dell’allungamento trascrizionalevengono depositate o rimosse le forme alternative degli istoni, ad es. H2A.Z e H3.3

LA RIDEPOSIZIONE E DEACETILAZIONE DEGLI ISTONI SONORICHIESTE PER MANTENERE UNA CONFORMAZIONE CROMATINICASTABILE ALL’INTERNO DELL’ORF CHE E’ REPRESSIVA PER LA FORMAZIONE DI PIC SU SITI NON CORRETTI

•In assenza di rideposizione dei nucleosomi si scoprono promotoricriptici che generano trascritti non corretti.•In mutanti Spt6, FACTe Asf1 vengono generati molti trascritticriptici.•Analogamente avviene per mutanti di Set2-Rpd3S

Altri enzimi che partecipano nella fase dell’allungamento sono:

Elp3 = associata con PolII nel complesso elongator, acetila H3 ed H4;non è stata ancora localizzata in vivo sulle regioni codificanti, ma i mutantielp3 mostrano difetti di allungamento e nella crescita.

Hos2 = deacetilasi di H3 ed H4; associata con le regioni codificanti;se mutata causa rallentamento delle cinetiche di attivazione genica;l’effetto contrasta con la sua attività deacetilasica; potrebbe essere importante per ristabilire un certo profilo di acetilazionepermissivo per un ciclo successivo della trascrizione (forse in analogia con lafunzione di Rpd3S)

ANALISI GENOMICA DELLE MODIFICAZIONI ISTONICHE

ChIP-on-Chip: Isolamento di piccoli segmenti di DNA associati a una qualche forma modificata degli istoni, in combinazione con la tecnica dei micro-arrays.

Lo studio più estensivo di questo tipo sulle modificazioni istonicheè stato fatto in Saccharomyces cerevisiae per quanto riguarda acetilazione, deacetilazione e metilazione delle lisine.

Si può condurre l’analisi su ceppi che manchino selettivamente di uno degli enzimi modificanti preposti.

Sono stati fatti esperimenti di mappatura della distribuzione di almeno 20 delle modificazioni conosciute di H3, H4, H2A, H2B eH2A.Z

Alcuni dati si sono ottenuti anche con microarrays sul genoma di S. pombe e, parzialmente su D. melanogaster e uomo.

La specificità di azione degli enzimi HAT e HDAC in lievitoè stata chiarita attraverso analisi genomica

Visione riassuntiva delle principali modificazioni istoniche associate con la trascrizione dei geni.

EUCROMATINA

Nucleosomiche contengonoHtz1

Esiste un certo grado di acetilazioneanche sui promotori non attivi

Sono stati identificati molti clusters di geni con un medesimo pattern diacetilazione nel promotoreSembra che questi abbiano in comune modalità di espressione simili quandoesposti a condizioni di crescita analoghe

ETEROCROMATINA

Nucleosomiche contengonoHtz1

Nucleosomi checontengono CenH3

STRUTTURA PRIMARIA DEL CENTROMERO

Lunghezza: 35-110Kb

Lunghezza: 125bp

Lunghezza: ~0.8-1Mb

Lunghezza: ~2-4Mb

Numero altamente variabiledi satelliti fiancheggiati da blocchi disatelliti e Dalla periferia al centro i blocchidi sequenze sono via via più omogenei.

CENP-A è una forma variante di H3 presente nel nucleosoma specializzatodei centromeri in mammiferocse4 in S. cerevisiaeCid3 in DrosophilaSwi6 in S. pombe

Centromero di S.cerevisiae

CBF1 e CBF3 contribuisconoa stabilire un dominio cromatinicoresistente alle nucleasi

Siti di sensibilità alle nucleasi

Si hanno due possibilità alternative per il legame del nucleosoma a seconda che sia CBF3 o CBF1 a legarsi sulla sua superficie.Il fatto che CBF1 pieghi il DNA agevolando la formazione del nucleosomasupporta il modello (b).D’altro canto, in lievito, doppie mutazioni in cse4 e CDEI o CDEII provocano perdita di cromosomi, indicando interazione tra questi elementie favorendo il modello (c).

HETEROCHROMATIN PROTEIN 1HETEROCHROMATIN PROTEIN 1

Drosophila: HP1S. pombe: Swi6Mammifero: HP1 – HP1 (MOD1 o M31) HP1 (MOD2 o M32)

*amminoacidi conservatiHP1 è tipica dell’eterocromatinaHP1 e HP1 si possono trovare localizzati anche su siti eucromatici

CROMODOMINIOCROMODOMINIO: riconosce selettivamente H3K9 metilataHINGEHINGE: è un dominio che lega DNA ed RNA senza un’evidente specificità di sequenzaCHROMOSHADOWCHROMOSHADOW: insieme con il cromodominio forma una tasca idrofobica che funziona come dominio di legame alle proteine. Inoltre media la dimerizzazione.

Domini funzionali di HP1Domini funzionali di HP1

HP1 ha forte affinità per me3H3K9

Contemporaneamente

è in grado di legare Suv39H1, la metilasi specifica per H3K9.

Si pensa che si formi un nucleo iniziale dal quale si propagalo stato eterocromatico con un meccanismo a “loop”:

Istone metilato lega HP1 che a sua volta recluta metilasi Suv39H1

HP1 è la principale proteina responsabile della formazionedell’eterocromatina pericentrica

HP1 interagisce anche con le DNA metiltrasferasiDnmt1Dnmt3ache metilano i gruppi CpGe conp150, contenuta in CAF1, chaperone per la deposizionedegli istoni

Ruolo dell’RNA nella cromatina pericentrica in topo e S.pombe

In topo ci sono trascritti di funzione ignota omologhi a entrambi i filamenti del satellite maggiore centromerico e trascritti “strutturali” che servono per il mantenimento della cromatina centromerica. Ruolo di RNAi ignoto.In S.pombe ci sono trascritti di orientamento inverso dalle ripetizioni esterne. I trascritti diretti sono molto poco rapppresentati. RNAi ha un ruolo chiarito: nei mutanti mancanti di Ago1 (Argonauta), Dcr1 (Dicer) o RNA-Dependent RNA Pol (RDP1)i trascritti si accumulano. Normalmente intermedi a doppio filamento vengono trasformatiin siRNAs che promuovono la metilazione in H3K9, promuovendo lo stato eterocromatico

CENP-A recluta CENP-C e CENP-H in maniera indipendenteCENP-B sembra essere in grado di reclutare HP1 con la conseguente formazione di eterocromatina. HP1 funzionareclutando a sua volta delle metilasi per H3K9 e K27CENP-A è depositato in maniera non continua limitatamentealla regione delle ripetizioni di DNA satellite.

Differenzeuomo-uccelli

Organizzazione 3D di un centromero umano

L’avvolgimento della fibrafa sì che CENP-A formiun dominio nella regionerivolta verso il polo. Nellaregione opposta è presenteil normale H3.

Le coesine vengono reclutatedall’eterocromatina. In questaregione più centrale non è chiaro quale sia la struttura.

In questa regione gliistoni sono fortementemetilati a carico dimetilasi specifiche.

Replicazione della cromatina pericentrica

•La forca replicativa spiazza i nucleosomi.•Questi vengono riformati alle sue spalle ad opera di CAF1.•PCNA interagisce con CAF1.•CAF1 recluta HP1.•HP1 recluta enzimi per la modificazione del DNAe degli ISTONI.•AcH4K5,12 viene incorporato e deacetilato subito dopo. •Non si sa se H3 viene incorporato con segnali preesistenti.