Microscopi e tecniche

Microscopiche

2 parte

•TaglioTaglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10mm.

•MontaggioMontaggio delle sezioni su vetrini per microscopia.

Sezione non colorata

Tagliare fettine così sottili di campioni biologici di diversa consistenza può essere problematico

-Ecco perché occorre INCLUDERE

-Esistono diversi mezzi di inclusione che conferiscono diversa consistenza ai campioni.

PARAFFINA

RESINA

MIX DI PARAFFINA E RESINE

•ColorazioneColorazione delle sezioni con il metodo più appropriato.– I coloranti sono a base acquosa, per cui si

elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo.

Colorazione automatizzata

ColorazioniColorazioni•ColorazioneColorazione con un

colore brillante di certe componenti del tessuto

•Contro Contro colorazionecolorazione del resto del tessuto con un colore contrastante

Ematossilina/EosinaEmatossilina/Eosina

• EmatossilinaEmatossilina ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine).

• EosinaEosina ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol).

Perchè questa "slide" Perchè questa "slide" è blu …è blu …

• Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porporablu/porpora, viene detta basofilabasofila

• È colorata dall'ematossilinaematossilina

• NucleiNuclei e ribosomiribosomi generalmente sono basofili

… … e questa rossa ?e questa rossa ?

• Se una porzione si colora in rosso rosso /arancio /rosa/arancio /rosa, viene detta acidofilaacidofila o o eosinofilaeosinofila

• È colorata dall'eosinaeosina • Sono proteine del

citosol

Altre colorazioniAltre colorazioni• PASPAS

– Per sostanze ricche in zuccheri (muco)

• Tricromica Tricromica (Azan Mallory) *(Azan Mallory) *

– Per i tessuti connettivi

– Le fibre si colorano in blu•Con E&E sono rosa. Le aree bianche sono lipidiLe aree bianche sono lipidi

Adiposo Bianco

• Osmio o Sudan blackOsmio o Sudan black– Per grasso

/lipidi/mielina– I lipidi non incorporano

coloranti acquosi

• Argento ed oroArgento ed oro– Per fibre delicate e

processi cellulari

• GiemsaGiemsa– Per le cellule del

sangue– Simile ad E&E

Mielina

Cellule nervose

Cellule del sangue

Come si osserva il Come si osserva il campione?campione?

• Attraverso un buon microscopio ottico

• Fotografandolo• Misurandolo

Per avere un'idea Per avere un'idea delle dimensioni delle dimensioni delle strutture delle strutture osservate si può osservate si può usare come usare come riferimento un riferimento un eritrocita (eritrocita (˜̃ 8 8 micron)micron)

Interpretate il Interpretate il campione!!!campione!!!

• Dovete pensare in 3 3 dimensionidimensioni

• Sezioni seriali Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

Ricostruzione per mezzo Ricostruzione per mezzo di sezioni serialidi sezioni seriali

Microscopia Elettronica Microscopia Elettronica a Trasmissione a Trasmissione

• Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta– Alta risoluzione

• Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi

• Gli elettroni passano attraverso il campione

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm

Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene proiettato su uno schermo che trasforma in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene colpito.

Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni verso l'asse.

La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico

Risoluzione dell'occhioRisoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µmRisoluzione del MORisoluzione del MO: 2,000 Angstroms = 200nmRisoluzione del TEMRisoluzione del TEM: 2 Angstroms

1 mm = 1000 µm1 µm = 1000 nm1 nm = 10 Angstroms

PinocitosiPinocitosi

-I campioni devono essere molto più sottili di

quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa

-Non vengono usati coloranti ma sostanze dense

agli elettroni semplicemente per dare contrasto o

anche per marcare anticorpi

Microscopia elettronica

Preparationedel campione

•Fissazione•glutaraldeide•Tetrossido osmio

•Deidratazione•etanolo

(passaggi)• Inclusione•Resine plastiche

•Taglio•ultramicrotomo

(spessore 50-100 nm)

•Colorazione•Metalli pesanti

Cellula eucariotica

Nucleo interfasico

Preparazione di Campioni Preparazione di Campioni Biologici per TEMBiologici per TEM

•1 Acquisizione1 Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3)

•2 FissaggioFissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio– L’osmio è un metallo pesante che si

lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)

– Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari.

DisidratazioneDisidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo.

InclusioneInclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina.

TaglioTaglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomoultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro). – La superfice da analizzare

deve essere di circa 0.2 mm. – Lo spessore della sezione

varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm).

Montaggio delle Montaggio delle sezionisezioni su di una griglia.

Colorazione Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo.

Visualizzazione al TEM

Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

Vari tipi di Vari tipi di MicroscopiaMicroscopiaElettronicaElettronica

•Transmissione (TEM)Transmissione (TEM)•Scansione (SEM)Scansione (SEM)•Shadow-castingShadow-casting•Freeze-fractureFreeze-fracture•Freeze-etchingFreeze-etching•CryoEMCryoEM•Negative StainingNegative Staining

Microscopia Elettronica a Microscopia Elettronica a ScansioneScansione

• SEM fa una SEM fa una scansione scansione della della superfice del superfice del campionecampione

• Produce Produce immagini 3-immagini 3-DD

IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A

SCANSIONE (SEM)

Nel SEM (ed in genere nella microscopia

elettronica) viene sfruttata l’interazione di un

fascio di e- con il campione per ricavare

informazioni sul campione stesso come nel

microscopio luce a riflessione viene utilizzato un

fascio di fotoni

Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell’urto del fascio di elettroni contro di esso

Tridimensionalità

La caratteristica preminente delle immagini ottenute con il SEM è l’eccezionale tridimensionalità

- Ciglia e microvilli

Glomerulo renale

Preparazione dei Preparazione dei campioni per SEMcampioni per SEM

•AcquisizioneAcquisizione del del campionecampione– Trattandolo con cura in Trattandolo con cura in

modo da non danneggiare modo da non danneggiare la superficiela superficie

• FissazioneFissazione ee disidratazionedisidratazione

• Non si includeNon si include

• Poggiato su di un Poggiato su di un supporto e supporto e ricoperto con um ricoperto con um metallometallo– Oro, cromo, Oro, cromo,

palladio, carbonepalladio, carbone– Deve essere Deve essere

elettron-conducente elettron-conducente (non elettrondenso)(non elettrondenso)

• Visualizzato al Visualizzato al microscopiomicroscopio

• FotografatoFotografato• Si possono Si possono

analizzare le analizzare le componenti componenti chimiche tramite chimiche tramite raggi Xraggi X