MICROBIOLOGIA: studio dei microrganismi che possono esistere come singola cellula o come raggruppamenti di cellule, ma anche dei virus che sono microscopici ma non cellulariI microrganismi sono in grado di effettuare tutti i processi legati alle funzioni vitali di crescita, di generazione dell’energia e di riproduzione indipendentemente dalle altre cellule, sia uguali che diverse.Microrganismi → specialmente i BATTERI

POPOLAZIONE: composta da gruppi di cellule correlate, generalmente derivate da una singola cellula per successive divisioni cellulari.HABITAT: luogo dove la popolazione microbica abita.COMUNITA’ MICROBICHE: diverse popolazioni che convivono ed interagiscono tra di loro.ECOSISTEMA: organismi viventi e caratteristiche chimico-fisiche del loro ambiente. I maggiori ecosistemi microbici sono quelli acquatici (oceani, laghi, fiumi e sorgenti), terrestri (suolo e rocce) e quelli degli organismi superiori.

ESPERIMENTO DI PASTEUR con la fiasca a collo di cignoNella fiasca viene versato un liquido non sterile. Il collo della fiasca viene stirato alla fiamma e poi il liquido viene sterilizzato per riscaldamento. L’aria viene espulsa dall’estremità aperta e la polvere ed i microrganismi restano intrappolati nel tratto curvo.

1. Se la fiasca rimane eretta non si osserva crescita microbica.2. Se i microrganismi trattenuti nel collo raggiungono il liquido sterile crescono rapidamente.

Dopo il raffreddamento del liquido, l’aria poteva rientrare, ma la curva del collo avrebbe impedito l’entrata dell’articolato organico contenente i microrganismi.Ciò significa che non esiste GENERAZIONE SPONTANEA, ma sono presenti nell’aria i microrganismi che causano la putrefazione.

L’eliminazione dei batteri o di altri microrganismi presenti in o su un oggetto è un processo chiamato sterilizzazione.

Bacillus anthracis → bacillo sporigeno che causa il Carbonchio o AntraceKoch dimostrò che questo bacillo era sempre presente nel sangue degli animali infetti e che causava la malattia. Se il sangue infetto veniva inoculato in un animale sano questo si ammalava e moriva. Dimostrò in seguito che i microrganismi potevano essere coltivati in brodi nutrienti al di fuori dell’ospite ed anche dopo molti trasferimenti in coltura i batteri potevano causare la malattia originaria se reinoculati in un animale. In base ciò, Koch formulò dei POSTULATI, necessari per provare che un microrganismo è responsabile di una specifica malattia:

1. Il microrganismo deve essere costantemente presente negli animali che soffrono della malattia e non deve essere presente negli organismi sani.

2. I microrganismi devono essere coltivati in una coltura pura al di fuori dell’organismo ospite.3. Questa coltura batterica, se inoculata in un animale, deve dare i sintomi caratteristici della

malattia.4. I microrganismi devono venire re-isolati da un animale da esperimento infettato e coltivati

di nuovo in laboratorio, dimostrando di essere identici all’organismo originale.Per poter associare un particolare tipo di microrganismo a una determinata infezione è necessario che esso venga in primo luogo isolato in coltura, ed è altrettanto necessario che questa sia PURA, cioè contenente un singolo microrganismo.Koch ideò anche delle soluzioni di solidificazione e riproducibili dove far crescere le colture come la gelatina e l’agar, migliorato da Hesse. L’AGAR è un polisaccaride derivante dalle alghe rosse.

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Mycobacterium tuberculosis → agente eziologico della tubercolosi a forma bastoncellare. È un parassita intracellulare molto difficile da colorare a causa della grande quantità di lipidi cerosi presenti sulla sua membrana esterna (→ si usa blu di metilene come soluzione alcalina + Bismarck brown che colora i tessuti, che è un precursore della colorazione di Ziehl-Neelsen).

COLTURA DI ARRICCHIMENTO O SELETTIVA:metodo di isolamento microbico che prevede l’uso di specifici terreni di coltura e di altrettanto specifiche condizioni colturali.

BATTERITutti i microrganismi procariotici patologici conosciuti sono batteri, come migliaia di specie non patogene. I Proteobatteri rappresentano il phylum più grande dei batteri.Molti batteri possono essere distinti in base all’uso della colorazione di Gram: i batteri Gram+ contengono un numero di specie associate sulla base di una comune analisi filogenetica ed una comune struttura della parete cellulare. Troviamo le specie sporigene come Bacillus e Clostridium, ed ancora altre specie sporigene come i microrganismi produttori di antibiotici del genere Streptomyces. Tra i batteri Gram+ troviamo anche i produttori di acido lattico, abitanti comuni del materiale organico vegetale in decadimento o dei prodotti lattiero-caseari, cioè Streptococcus e Lactobacillus. Altri importanti batteri correlati ai Gram+ sono i micoplasmi, che mancano di una parete cellulare, hanno un piccolo genoma e comprendono specie patogene.

Bacillus → batterio bastoncellare che forma endospore (sporigeno), estremamente resistente al calore, agli agenti chimici e alle radiazioni.

Streptococcus → cellule di forma sferica che tendono ad aggregarsi per formare una catena.

I Cianobatteri sono filogeneticamente correlati ai batteri Gram+ e sono microrganismi fototrofi (= hanno pigmenti che gli consentono di usare la luce come fonte di energia e le loro cellule sono intensamente colorate) ossigenici (= nel loro metabolismo l’ossigeno molecolare, O2, si è evoluto come quello delle piante superiori).

Planctomyces: gruppo di batteri caratterizzati da cellule con un tipico stelo che consente l’attacco a substrati solidi.Spirochete: causano alcune malattie come la sifilide e la malattia di Lyme.Solfobatteri verdi e Batteri verdi non sulfurei: sono batteri fototrofi.Chlamydia: genere che comprende molte specie patogene che causano molte infezioni respiratorie e veneree nell’uomo. Si tratta di un parassita intracellulare obbligato, in quanto vive necessariamente all’interno delle cellule degli organismi superiori.

PARASSITI INTRACELLULARI: la localizzazione intracellulare consente ai microrganismi patogeni di evitare di essere distrutti da parte della risposta immunitaria dell’ospite.

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LA CELLULA

Eucarioti: alghe, funghi, piante e animaliProcarioti: batteri, archeaVirus: microrganismi non cellulari

Tutte le cellule richiedono energia. Questa può essere ottenuta per ossidazione dei composti e viene conservata all’interno della cellula sottoforma di molecole ad alta energia come l’ATP.Alcuni microrganismi possono ottenere energia solo in presenza di ossigeno e sono detti AEROBI; altri solo in assenza di ossigeno e sono detti ANAEROBI; altri ancora possono ottenere energia sia in presenza che in assenza di ossigeno (aerobi e anaerobi facoltativi).

La cellula procariotica è costituita da: Acqua come componente principale. Proteine, sono presenti ovunque nella cellula, sia come componenti strutturali che come

enzimi. RNA, dopo le proteine è la macromolecola più abbondante in una cellula procariotica in

attiva crescita. Si trova infatti nel citoplasma (mRNA, tRNA) e nei ribosoma (rRNA). Lipidi, rivestono un ruolo fondamentale sia nella struttura della membrana che come

deposito per l’accumulo di carbonio in eccesso. Sono localizzati nella membrana citoplasmatica, nella parete cellulare e nei granuli d’accumulo.

Polisaccaridi, sono polimeri costituiti da zuccheri semplici e sono presenti prevalentemente nella parete cellulare e, occasionalmente, nei granuli d’accumulo.

DNA, è essenziale per le funzioni cellulari in quanto deposito dell’informazione genetica necessaria per la produzione di nuove cellule. È localizzato nel nucleotide, mentre nelle cellule eucariotiche si trova nel nucleo.

Zuccheri Ioni organici Amminoacidi Nucleotidi

LE COLORAZIONII COLORANTI sono composti organici ed ogni classe di colorante ha affinità per specifici componenti cellulari. Molti coloranti in uso hanno carica positiva (cationi) e si combinano con elementi cellulari a carica negativa, come acidi nucleici, polisaccaridi acidi, come ad esempio il blu di metilene, il cristal-violetto e la safranina. Questi coloranti quindi reagiscono con le strutture superficiali della cellula e sono coloranti per uso generico.Preparazione del vetrino:

• Su un vetrino da microscopia viene strisciata la coltura formando uno strato sottile di microrganismi;

• Viene fatto asciugare all’aria;

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• Si passa il vetrino sulla fiamma per fissare il campione;• Si ricopre il vetrino con abbondante soluzione diluita di colorante per 1-2 minuti;• Si risciacqua varie volte in acqua e si asciuga;• Si osserva con obiettivo 100X da immersione ad olio.

I COLORANTI DIFFERENZIALI, invece, non colorano in modo uguale tutti i tipi di cellule, come ad esempio la COLORAZIONE DI GRAM. In base a questa colorazione i batteri possono essere divisi in due grandi gruppi: GRAM POSITIVI, che si presentano colorati in viola, GRAM NEGATIVI, che si presentano colorati in rosso.

Fasi della colorazione di Gram:1. Ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal-violetto per 1 minuto. Tutte le cellule si

coloreranno di viola.

2. Aggiungere soluzione iodata per 3 minuti. Le cellule rimarranno viola.

3. Decolorare in alcol per circa 20 secondi. Le cellule Gram+ risulteranno viola, quelle Gram-

incolori.

4. Controcolorare con safranina per 1-2 minuti. Le cellule Gram+ risulteranno viola, quelle

Gram- avranno una tonalità da rosa a rosso.

MORFOLOGIE CELLULARICOCCO = batterio con una morfologia sferica o ovale.

BASTONCELLO = batterio a forma cilindrica.

SPIRILLO = bastoncello curvo con forma anche spiraliforme.Cocchi e bastoncelli: dopo la divisione cellulare le loro cellule rimangono insieme a formare gruppi o agglomerati la cui forma è spesso una lunga catena.

SPIROCHETE = batteri spiraliformi. PEDUNCOLATI = batteri con cellule che possiedono estrusioni a forma di lunghi tubi o peduncoli.

FILAMENTOSI = batteri che formano lunghe e sottili cellule o catene di cellule.

Le dimensioni dei microrganismi (procariotici ed eucariotici) sono dell’ordine del micron (μm).

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CITOPLASMA BATTERICOÈ un sistema colloide, cioè molecole che interagiscono con acqua come proteine solubili. Il citoplasma può essere diviso in tre aree funzionali:

1. AREA CITOPLASMATICA GRANULARE: ricca di rRNA (RNA)2. AREA NUCLEARE: contiene la matassa di DNA, di solito al centro della cellula (DNA)3. PORZIONE LIQUIDA: è lo strato di citoplasma più a contatto con la membrana dove si

sciolgono i nutrienti. Infatti qui avviene la maggior parte del metabolismo batterico grazie alla presenza di molti enzimi nella membrana.

La membrana citoplasmatica è costituita da:• Elevata quantità di proteine (50% del peso secco totale)• Acidi nucleici diffusi (elevato RNA → basofilia)• Non c’è RE perché le sue funzioni sono svolte dalla membrana• Granulazioni: ribosomi e polisomi (= aggregati di ribosoma) composti dal 60% di RNA e

40% di proteine.La cellula esprime una carica negativa sulla superficie esterna, importante per l’utilizzo dei coloranti (dissociano come basi). In soluzione idroalcalina dissocia come catione (base). Per colorare le cellule si utilizzano ematossilina ed eosina che distinguono il nucleo (-, acido) ed il citoplasma (+, base).

GRANULI = inclusioni citoplasmatiche. Sono fonti nutritive di riserva e/o sorgenti di energia. G. DI GLICOGENO = polimeri di glucosio racchiusi o no da membrana. Sono molecole unite da legami α-1,4 glucosidici (α-1,6 glucosidici per le ramificazioni). Prodotti quando c’è eccesso di C e carenza di N, S, P o se il pH è basso. Nell’uomo si trovano nel fegato.G. DI POLI-META-FOSFATI = polimeri ad alto PM, si accumulano durante la crescita attiva. Il Corynebacterium li produce da entrambi i poli.G. DI POLI-β-IDROSSIBUTIRRATO (PHB) = polimero dell’acido β-idrossibutirrico. Sono circondati da membrana. Agiscono come sorgente di C e di energia nella maturazione delle spore. G. DI ZOLFO = presenti nei solfobatteri, si presentano gialli al microscopio, l’energia viene ricavata mediante ossidazione → lo zolfo polimerizzato è una riserva.RIBOSOMI e POLIRIBOSOMI

STRUTTURA DEL DNA: il superavvolgimentoIl DNA di E. coli misura più di 1 mm, è quindi 500 volte più lungo della cellula stessa (μm). Ciò avviene perché il DNA è superavvolto. Con il termine di superavvolgimento si intende quello stato del DNA nel quale i filamenti a doppia elica vengono ulteriormente attorcigliati. Il DNA può essere superavvolto sia in senso positivo che negativo. Il superavvolgimento negativo avviene quando il DNA si attorciglia intorno al suo asse in direzione opposta a quella della doppia elica destrosa. Nel superavvolgimento il DNA forma dei domini superavvolti in modo da formare delle anse. Ogni dominio è legato all’altro da proteine.

Ipotesi di ripiegamento del DNA:- La molecola a doppia elica circolare è ripiegata per effetto di alcune molecole di RNA che stabilizzano anse cromosomiche (~50).- All’interno di ognuna di queste anse il DNA è superspiralizzato.

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- L’introduzione di una rottura a singola elica di DNA di un’ansa rimuove la superspiralizzazione (→ enzima DNasi).- La rottura di una molecola di RNA rompe la separazione tra due anse senza rilasciare il superavvolgimento (enzima RNasi).

La duplicazione del DNA avviene con un “breathing” del DNA circolare, cioè con un’apertura e chiusura fisiologica della doppia elica in zone ricche di coppie A-T.Il DNA segue una duplicazione semiconservativa, cioè la nuova elica è composta da un filamento nuovo e uno vecchio.

REPLICAZIONE SIMMETRICA o A TETA (θ)Il cromosoma procariotico di E. coli è una molecola di DNA circolare dove vi è un singolo sito di origine di replicazione dove la doppia elica si apre e la replicazione inizia su entrambi i filamenti. Spesso la replicazione è bidirezionale con formazione di due forche di replicazione che si muovono in direzioni opposte. Nel DNA circolare ciò porta alla formazione di una struttura detta forma teta.A livello delle forche di replicazione l’enzima principale nel processo replicativi è la DNA polimerasi II e l’enzima elicasi lo aiuta srotolando il DNA a doppia elica.La replicazione avviene in modo diverso nei due filamenti:

- nel filamento guida va dal 5’→ 3’ in modo continuo- nel filamento copia va dal 5’ → 3’ in modo discontinuo, perché non c’è a livello della forca un gruppo 3’-OH al quale può essere aggiunto il nuovo nucleotide. Ogni breve sequenza sintetizzata si dice frammento di Okazaki.

Nel filamento copia deve perciò essere sintetizzato un piccolo innesco di RNA da una primasi, in modo da fornire gruppi 3’-OH liberi. Dopo aver sintetizzato l’innesco la primasi è sostituita dalla DNA polimerasi III che, una volta raggiunto l’innesco di RNA di un altro frammento, viene sostituita dalla DNA polimerasi I che continua a sintetizzare il DNA mentre rimuove l’innesco di RNA dal frammento precedente grazie alla sua attività di esonucleasi 5’ → 3’. La DNA ligasi poi sostituisce la DNA polimerasi I quando l’innesco è stato rimosso ed unisce i due frammenti.Il DNA procariotico ha le seguenti caratteristiche:

• è policistronico, cioè tutto codificante. Infatti non esiste distinzione tra introni ed esoni.• Presenta la superspiralizzazione negativa.• Forza di coesione del DNA (L) = forza di contorsione (W) + forza di torsione (T).

L dipende dall’attorcigliamento delle due eliche; W dai giri dell’asse della doppia elica; T è il numero totale dei giri della doppia elica. L diminuisce per azione della topoisomerasi I (durante la replicazione) ed aumenta per azione della topoisomerasi II (DNA girasi → ricombatta il DNA).

• Presenta fenomeni di breathing, cioè apertura e chiusura della doppia elica nelle zone ricche di A-T.

• Presenta proteine basiche stabilizzanti simili agli istoni: HU e H.

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PLASMIDI ed EPISOMISono strutture genetiche accessorie

- Elementi extracromosomici capaci di - Sono plasmidi integrati nel cromosoma replicazione autonoma batterico ed in questo modo la loro - Struttura circolare superspiralizzata replicazione procede sotto controllo del - Può essere: - unico o più copie uguali cromosoma stesso - diversi

PLASMIDIHanno un DNA bicatenario circolare ed esistono all’interno della cellula semplicemente come acido nucleico. Gli enzimi coinvolti nella replicazione sono quelli della cellula ospite. Ogni tipo di plasmide è presente in un numero particolare di molecole per cellula, che viene detto numero di copie: alcuni sono presenti solo in 1-3 copie, altri oltre 100 copie. Il numero di copie è quindi variabile e viene controllato dai geni del plasmide e dall’interazione tra ospite e plasmide.I plasmidi nei batteri Gram- si replicano con inizio da un’origine e processo di replicazione bidirezionale in modo circolare, dando un intermedio con forma teta. Altri hanno una replicazione unidirezionale. Molti plasmidi dei batteri Gram+ si replicano con un meccanismo a cerchio rotante che porta alla formazione di intermedi a singolo filamento, per cui talvolta si parla di plasmidi a DNA a singolo filamento (replicazione asimmetrica o sigma dato che solo una delle eliche parentali continua a fungere da stampo mentre l’altra viene usata una sola volta). Quando un plasmide viene trasferito in una cellula che già contiene un altro plasmide a volte si osserva che il secondo plasmide non può essere mantenuto e viene perso durante la successiva replicazione della cellula: in questo caso i due plasmidi sono detti incompatibili. I plasmidi di un gruppo di incompatibilità si escludono l’un l’altro, ma possono coesistere con plasmidi di gruppi diversi con cui condividono un meccanismo comune di regolazione della replicazione e quindi sono correlati gli uni con gli altri.Il principale meccanismo di trasferimento da cellula a cellula è la coniugazione, una funzione codificata dagli stessi plasmidi. È un processo replicativo ed entrambe le cellule figlie conterranno una copia del plasmide. I plasmidi che governano il loro stesso trasferimento grazie al contatto cellula-cellula sono detti coniugativi, ma ci sono anche plasmidi non coniugativi. La trasmissibilità mediante coniugazione viene controllata da geni contenuti nella regione tra, che contiene geni che codificano proteine che agiscono nel trasferimento del DNA, nella replicazione ed in altre funzioni necessarie per la formazione delle coppie di coniugazione. Se il plasmide si integra nel cromosoma può mobilizzare il trasferimento del DNA cromosomiale da una cellula all’altra. I ceppi batterici che durante la coniugazione trasferiscono una gran quantità di DNA cromosomiale sono detti Hfr = high frequency of recombination. I plasmidi che non hanno i geni tra, cioè i geni del trasferimento, si replicano verticalmente.

Classi di plasmidi: F, R, Col, Catabolici, etc.Plasmidi R = di resistenza, cioè che conferiscono resistenza agli antibiotici e altri inibitori di

crescita; ai metalli pesanti; ai raggi LIV = assorbiti dagli acidi nucleici a 260 nm; alle batteriocine, cioè delle sostanze prodotte da molti batteri e che hanno uno spettro di azione più ampio rispetto agli antibiotici; ai fagi con attività litica del siero.

Col = codificano per batteriocine prodotte da E. coli dette colicine che si legano a recettori, che sono dei componenti la cui funzione è quella di trasportare sostanze attraverso la membrana esterna (lo strato lipopolisaccaridico) della cellula. Le colicine uccidono la cellula distruggendone alcune funzioni fondamentali, come ad esempio la formazione di canali nella membrana cellulare che fanno uscire ioni K+ e H+ cosicché la cellula perde la capacità di produrre energia. I plasmidi Col possono essere coniugativi o non coniugativi.

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I plasmidi producono anche:- proteasi, cioè delle proteine instabili e vengono riconosciute da enzimi che le degradano rapidamente (es. in E. coli è il fattore σ32).- esotossine, sono proteine- enterotossine, sono sostanze che causano danni all’ospite (es. in E. coli produce l’enterotossina che induce un’intensa secrezione di acqua e sali nell’intestino provocando la diarrea)- emolisine, sostanze che creano danni all’ospite (es. in E. coli produce l’emolisina che lisa le cellule del sangue)- antibiotici

Plasmide pBR322 = viene utilizzato come vettore di clonaggio che si replica in E. coli.

In origine la nomenclatura dei plasmidi era di tipo formale, cioè in base alle loro caratteristiche: Col = produzione di colicina;Ent = produzione di enterotossina;CAM = degradazione canforaOggi, invece, è di tipo alfanumerico: pAC25 = degradazione acido 3-clorobenzoico pSJ23a = antibiotico resistenza

MEMBRANA CITOPLASMATICAÈ una struttura sottile che circonda completamente la cellula e che separa il citoplasma dall’ambiente. La natura idrofoba della membrana le permette di funzionare come una barriera altamente selettiva, che capta alcune sostanze e ne esclude altre. Benché alcune piccole molecole idrofobiche possano passare attraverso di essa per diffusione, quelle idrofiliche e polari non riescono ad attraversarla liberamente e richiedono un sistema di trasporto specifico. La struttura della membrana è un doppio strato fosfolipidico, con una componente idrofoba (acidi grassi) rivolta verso l’interno ed una idrofila (glicerolo) rivolta verso l’esterno acquoso. Questo ingloba al suo interno molecole proteiche, formando le unità di membrana. A differenza delle cellule eucariotiche, le cellule procariotiche non possiedono steroli, che contribuiscono a stabilizzare la struttura della membrana ed a renderla meno flessibile, mentre gli acidi grassi sono molecole flessibili. Molti batteri presentano al posto degli steroli delle molecole simili dette opanoidi.La membrana si colora molto più facilmente del citoplasma e trattiene facilmente il colore.In alcuni batteri sono presenti lamelle e vescicole dette mesosomi che presentano connessioni con la sostanza nucleare. I mesosomi sono importanti nella riproduzione cellulare, nella sporulazione, nella secrezione di esoenzimi. Praticamente il mesosoma funziona come il fuso mitotico nelle cellule eucariotiche, tirando da un lato un filamento e da un altro lato l’altro filamento.

LE PROTEINE DI MEMBRANA

E = estrinsecheI = intrinsecheG = glicoproteine transmembrana

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INTRINSECHE – penetrano nella membrana, a volte la attraversano completamente, e sono costituite da regioni polari e non polari (possono essere estratte solo rompendo legami idrofobici, ad es. con detersivi).

ESTRINSECHE – non penetrano nella membrana, ma interagiscono con la sua superficie mediante legami elettrostatici con le “teste” polari dei fosfolipidi (possono essere estratte mediante variazioni di pH).

PERIPLASMATICHE – localizzate nello spazio tra membrana citoplasmatica e la parete cellulare.

“Shock – proteins” - sono presenti soprattutto nei batteri Gram-, che possiedono uno spazio tra m.c. e p.c. detto periplasma

- sono in massima pare enzimi idrolitici (es. citocromi, enzimi biosintesi lipidi, enzimi biosintesi parete)

“Binding – proteins” - sistemi di trasporto: ioni, amminoacidi, etc

Anche se all’apparenza può sembrare rigida, la membrana plasmatica ha una struttura a mosaico fluido, nel quale proteine globulari si estendono attraverso lo strato fosfolipidico, altamente mobile, ma ordinato.

Funzioni della membrana:1. diffusione semplice (o passiva):

- le molecole attraversano la membrana senza interagire con delle proteine (es. osmosi)- non c’è dispendio di energia- processo lento e aspecifico, secondo gradiente di concentrazione

L’ossigeno diffonde passivamente attraverso lo strato fosfolipidico senza interagire con le proteine. 2. diffusione facilitata

- passaggio di sostanze mediante formazione temporanea e reversibile di un complesso con proteina di membrana (permeasi)

- flusso unidirezionale o polarizzato: esterno → interno- processo rapido e aspecifico, perché le permeasi al contrario di enzimi

specifici hanno alcune specie aspecifiche (es. una permeasi per più zuccheri)Il glicerolo attraversa la membrana secondo la diffusione facilitata grazie alla permeasi.La proteina di membrana cambia conformazione con l’ingresso della molecola.

3. trasporto attivo- accumulo di nutrienti contro gradiente osmotico di concentrazione o

elettrochimico- è implicata una molecola trasportatrice specifica detta “carrier” che oscilla

tra una parte e l’altra della membrana. Sono proteine specifiche o non, che vengono attivate da composti ad alta energia

- è richiesta energia (ATP, PEP = fosfo-enol-piruvato → P si stacca e si libera energia)

Il lattosio attraversa la membrana secondo il trasporto attivo, ma con simporto con H+ che danno energia; il glucosio viene fosforilato grazie al sistema delle fosfotransferasi e passa la membrana

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attraverso la traslocazione di gruppo. La traslocazione di gruppo è una modificazione chimica della sostanza trasportata durante l’attraversamento della membrana, controllata dal PEP che fornisce l’energia al sistema. Prima che lo zucchero venga trasportato all’interno della cellula, le proteine del sistema vengono anch’esse fosforilate e defosforilate con un meccanismo a cascata, a partire dal PEP finché una proteina integrale di membrana con funzioni di trasporto non riceve il gruppo fosfato e fosforili a sua volta lo zucchero.

Entità di trasporto mediato da carrierIncorporazione (diffusione facilitata e trasporto attivo)

diffusione semplice

Concentrazione esterna dei solutiL’ingresso mediato da carrier è molto più elevato finché la curva non si appiattisce perché il carrier limita il processo. La diffusione semplice è direttamente proporzionale alla concentrazione interna.

PARETE CELLULARELa parete cellulare è una struttura caratteristica dei batteri che serve a sopportare la pressione dei soluti ed a conferire alla cellula forma, rigidità e resistenza, essendo una struttura semirigida. Essa non è visibile alla microscopia ottica, ma occorre una sezione sottile per la microscopia elettronica. La parete protegge anche il batterio da alcuni fattori dell’ambiente esterno come lisi osmotica, sostanze tossiche, etc. I batteri possono essere distinti in due gruppi principali grazie alle diversità strutturali della parete cellulare. I Gram- presentano una parete con struttura complessa e multi-stratificata, mentre quella dei Gram+ consiste di un singolo tipo di molecola ed è molto più spessa.

Nella parete dei batteri vi è uno strato che è il principale responsabile della rigidità della parete, che è detto peptidoglicano. Ogni suo strato è una sottile lamina costituita da due derivanti polisaccaridici, il NAM (= acido N-acetilmuramico) e il NAG (= N-acetil-glucosamina), e da un piccolo gruppo di aminoacidi. Questi costituenti sono assemblati a formare il glican tetrapeptide. Le catene di glicano, formate da zuccheri, sono tenute insieme da legami crociati peptidici tra aminoacidi. I legami 1,4-β-glicosidici che uniscono gli zuccheri sono molto forti, ma tali catene non sono sufficienti a dare rigidità alla cellula. La robustezza si ottiene quando queste catene vengono allacciate tra loro da aminoacidi mediante legami crociati. Il peptidoglicano può essere distrutto da diversi agenti chimici, tra i quali il lisozima, una proteina che rompe i legami 1,4-β-glicosidici tra NAM e NAG, indebolendo la struttura. Questo può essere isolato dalle secrezioni animali, come lacrime, saliva e altri fluidi corporei e svolge una funzione di prima difesa contro le infezioni batteriche.

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Batteri Gram+: la parete ha uno spessore di 150-800A e con una struttura relativamente semplice. È composta da: - aminozuccheri, NAM e NAG, che formano la maggior parte della parete: 10-30%

- lipidi: 0,2% - presenza di Acidi Teicoici - peptidoglicano: 30-70% del peso della parete

Gli acidi teicoici sono polimeri della parete, della membrana e della capsula contenenti residui di glicerofosfato e ribitolfosfato, che sono generalmente associati ad altri zuccheri e alla D-alanina, con legami covalenti con il peptidoglicano. A causa della loro carica negativa, sono in parte responsabili della complessiva carica negativa della superficie cellulare e possono contribuire al passaggio di ioni. I batteri Gram+ sono costituiti da un peptidoglicano con struttura spaziale, dove dalle catenelle verticali si uniscono catenelle orizzontali formando una struttura abbastanza spessa.

Batteri Gram-: la parete ha uno spessore di 80-100A ed una struttura relativamente complessa. È composta da: - aminozuccheri, NAM e NAG: 1-10% - lipidi: 10-20%

- presenza di membrana parietale - peptidoglicano: 20% del peso della parete

La membrana parietale è una caratteristica dei Gram- ed è uno strato esterno alla parete costituito da lipopolisaccaride (LPS). Pur trattandosi di un doppio strato lipidico, esso è costituito anche da polisaccaridi e proteine oltre ai fosfolipidi.I batteri Gram- non hanno catenelle orizzontali nel peptidoglicano, ma sono le verticali a cambiare direzione, formando legami peptidici tra i due filamenti.

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La porzione polisaccaridica è composta di due frazioni: il polisaccaride interno o core polisaccaridico, a cui è strettamente connesso il polisaccaride esterno o polisaccaride O. Questi sono composti da zuccheri che si legano a formare delle catene con la formazione di un lungo polisaccaride esterno.La porzione lipidica del LPS è detta lipide A: gli acidi grassi sono legati tramite un legame estere-aminico ad un NAG. Il LPS si associa a varie proteine a formare la metà esterna della membrana. Sul lato interno della membrana esterna è presente un complesso lipoproteico, cioè una proteina che svolge funzioni di ancoraggio tra membrana esterna e peptidoglicano. La membrana esterna dei batteri Gram- è parzialmente permeabile a piccole molecole. Ciò avviene grazie alla presenza di piccole proteine transmembrana dette porine che svolgono la funzione di canali attraverso di essa, permettendo l’entrata e l’uscita di sostanze idrofiliche a basso PM. Sono state identificate sia porine specifiche che aspecifiche. Le porine aspecifiche formano canali acquosi dove transitano piccole molecole di ogni tipo; le porine specifiche, invece, sono altamente specifiche per una o più sostanze a cui corrisponde lo specifico sito di legame.

Un’importante proprietà biologica della membrana esterna di molti batteri Gram- è la tossicità per gli animali. Tra i batteri Gram- patogeni per l’uomo e per altri mammiferi ci sono membri dei generi Salmonella, Shigella ed Escherichia. Le proprietà tossiche dipendono da una porzione del LPS, e in particolare del lipide A, definito endotossina.

CAPSULAMolti microrganismi secernono alla loro superficie sostanze mucose o vischiose, in genere costituite da polisaccaridi (destano, levano, cellulosa…, con differenze tra specie e specie), più raramente da proteine. La capsula è appunto un involucro viscoso, mucogelatinoso che funge da un ulteriore strato protettivo della cellula. A seconda della composizione chimica di uno specifico microrganismo, può essere sottile o spessa, rigida o flessibile. La capsula può essere considerata come fattore di virulenza in quanto impedisce la fagocitosi.È presente più frequentemente in batteri isolati da materiali patologici che da batteri ambientali e alcuni batteri, come Streptococcus, presentano capsula solo in colture giovani.

GLICOCALICE È una struttura nota anche come Slime Layer e produce i cosiddetti Biofilms. Il glicocalice è costituito da polisaccaridi e glicoproteine e in percentuale più bassa da polialcooli e aminozuccheri. Gli strati polisaccaridici esterni hanno un ruolo importante nell’adesione di alcuni microrganismi patogeni ai loro ospiti. L’adesività batterica è prodotta anche dalla presenza di fibrille lasse.

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STRUTTURE FILAMENTOSE ESTERNE: ciglia, flagelli, fimbrie, piliCIGLIASono filamenti cilindrici, flessibili, variamente disposti, ma è frequente la disposizione periferica. Nei microrganismi cigliati ci sono differenze con l’età, le specie e a causa dei fattori ambientali. Le ciglia originano dalla membrana citoplasmatica; sono filamenti sottili con core e guaina; presentano una strato basale ed hanno uno spessore di circa 20 nm ed una lunghezza massima di 70 nm. Sono di natura proteica, costituiti da flagellina e pilina. Si muovono per ruotazione e traslazione.

FLAGELLILa capacità di muoversi autonomamente della maggior parte dei procarioti dipende in genere da una particolare struttura che è il flagello. Sono appendici cellulari lunghe e sottili, libere ad una estremità e intimamente legate alla cellula dall’altra. Il filamento dei flagelli batterici è costituito da numerose subunità di una proteina detta flagellina. Hanno una composizione simile a quella delle ciglia, ma con dimensioni maggiori: uno spessore di 20 nm e una lunghezza di 15-20 μm. I flagelli sono disposti in modo diverso nei diversi batteri: distribuzione polare (= attaccati a uno o entrambi i poli); distribuzione lofotrica (= un ciuffo di flagelli può originarsi a un’estremità della cellula); distribuzione peritrica (= i flagelli si originano da numerosi punti della superficie cellulare). Presentano una struttura tipica ad uncino, formata da un singolo tipo di proteina, e con la funzione di connettere il filamento alla porzione del motore del flagello. Il motore flagellare, ancorato alla membrana citoplasmatica e alla parete cellulare, è formato da una piccola regione bastoncellare centrale che passa attraverso un sistema di anelli (L, P, S, M). Nei batteri Gram- la coppia esterna di anelli è ancorata allo strato lipopolisaccaridico e al peptidoglicano della parete cellulare, mentre la coppia più interna è localizzata all’interno della membrana citoplasmatica. Nei batteri Gram+, che sono privi dello strato lipopolisaccaridico esterno, è presente solo la coppia più interna.

FIMBRIE e PILISono presenti nei batteri Gram- e sono simili ai flagelli, ma non sono coinvolti nel movimento. La proteina delle fimbrie e dei pili è la pilina. Hanno uno spessore di 0,01 μm ed una lunghezza di 0,5-20 μm. Le fimbrie sono notevolmente più corte dei flagelli e molto più numerose, ma come questi sono di natura proteica. I pili sono strutture simili alle fimbrie, ma più lunghi e presenti sulla cellula in una o più copie. Sono coinvolti nel processo di coniugazione nei procarioti. La coniugazione batterica è un processo di trasferimento genetico che comporta il contatto cellula-cellula. Molti geni nella regione tra sono coinvolti nella formazione delle coppie di coniugazione e la maggior parte di questi ha a che fare con la sintesi del pilo sessuale. Solamente le cellule donatrici hanno questi pili che permettono l’appaiamento specifico tra cellula donatrice del plasmide e cellula ricevente.

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Molti batteri sono mobili anche in assenza di flagelli. Questi batteri si muovono attraverso una superficie solida mediante scivolamento. I batteri che si muovono in questo modo sono filamentosi o bastoncellare e si muovono molto più lentamente di quelli provvisti di flagelli.I movimenti direzionali dei procarioti sono detti tassie e nelle cellule batteriche i più studiati sono la chemiotassi, la risposta ad una sostanza chimica, e la fototassi, la risposta alla luce. In assenza di un gradiente le cellule di E. coli, costituite da flagelli peritrichi, si muovono seguendo una modalità casuale, che comprende l’avanzamento (la cellula nuota in avanti in modo lineare) e il capovolgimento (la cellula si ferma e si piroetta). Se è, invece, presente un gradiente chimico di una sostanza attraente, i movimenti diventano orientati, con avanzamenti più lunghi e minori capovolgimenti. Il movimento in avanti avviene quando il motore del flagello si muove in direzione antioraria. Quando il flagello ruota invece in senso orario, il fascio di flagelli si apre, il movimento di avanzamento cessa e la cellula si capovolge.

SPORE BATTERICHEAlcune specie di batteri producono delle strutture all’interno delle loro cellule dette endospore, di forma ovale o sferica ed in posizione centrale, paracentrale o terminale, durante il processo di sporulazione. Le endospore sono cellule differenziate molto resistenti ad agenti chimici e fisici, come calore, disidratazione, radiazioni, acidi e disinfettanti chimici e possono restare quiescenti per periodi di tempo molto lunghi. Possono avere una superficie liscia o rugosa, non possono essere distrutte facilmente e sono difficilmente colorabili, perché sono impermeabili ai coloranti. I generi Bacillus e Clostridium sono tra i batteri sporigeni più studiati, ma anche Sporosarcina e Thermoactinomyces. Le endospore appaiono al microscopio ottico come strutture fortemente rifrangenti. Una spora ha una struttura costituita da numerosi strati di rivestimento. Lo strato più esterno, detto esosporio, è una struttura accessoria che conferisce ulteriore protezione, sottile e delicato. All’interno dell’esosporio si trova la tunica, che è un involucro compatto, rigido e composto da uno o più strati proteici con proteine cheratino-simili (ricche in legami s-s). Al di sotto di questa si trova la corteccia, uno strato di peptidoglicano lasso, all’interno della quale è situato il core, costituito da parete cellulare, membrana citoplasmatica, citoplasma, ecc. La tunica è caratterizzata da: impermeabilità a composti chimici, resistenza all’idrolisi enzimatica, resistenza alle radiazioni UV. La corteccia presenta le seguenti caratteristiche: termoresistenza, elasticità, rifrangenza, resistenza al lisozima. Quindi una spora differisce dalla cellula vegetativa per gli involucri presenti all’esterno della parete cellulare. Il core di un’endospora matura contiene dal 10 al 30% di acqua e la sua consistenza appare quella di un denso gel. Il grado di disidratazione del core aumenta la resistenza al calore dell’endospora, conferisce resistenza ad alcune sostanze chimiche, come il perossido di H (H2O2), e causa la parziale inattività degli enzimi. La disidratazione modifica la conformazione di enzimi e proteine citoplasmatiche e si ha la comparsa di SASP (= small acid-soluble spore proteins), cioè delle proteine core-specifiche prodotte durante il processo di sporulazione che legano fortemente il DNA nel core e lo proteggono dai potenziali

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danni dei raggi UV, dall’essiccazione e dal calore. Inoltre le SASP funzionano come fonte di carbonio e di energia per la formazione della nuova cellula vegetativa a partire dall’endospora, cioè per la germinazione. In più un’endospora matura non presenta attività metabolica e l’energia è conservata sotto forma di 3-P-glicerato. Una sostanza tipica delle endospore, assente nelle cellule vegetative, è l’acido dipicolinico. Questa sostanza è stata è localizzata a livello del core. Le spore presentano inoltre un’elevata concentrazione di ioni calcio. La sporulazione batterica non avviene quando le cellule sono in fase esponenziale, ma soltanto quando la crescita cellulare si blocca a causa dell’esaurimento di sostanze nutritive essenziali. Ad esempio, le cellule di Bacillus iniziano la sporulazione quando un nutriente chiave come il carbonio o l’azoto diventa limitante.

NUTRIZIONE = processo in base al quale un organismo assume elementi e sostanze e li converte in energia e in strutture cellulari.

Esigenze e fattori nutrizionali dei batteri: nutrienti: composti organici vari: C, N, P, S, ioni metallici come Fe; ossigeno: presenza o assenza; energia; acqua; temperatura; pH; forza ionica.Non tutti i nutrienti sono necessari nella medesima quantità: alcuni, i macronutrienti (C, N, P, S, K, Mg, Ca, Na), sono richiesti in grande quantità, mentre altri, i micronutrienti (Cu, Zn, Mo, Fe, Mn), sono richiesti in quantità minore se non addirittura in tracce. I fattori di accrescimento sono composti organici necessari in piccolissima quantità, che comprendono vitamine, aminoacidi, purine e pirimidine. Nonostante la maggior parte dei microrganismi sia in grado di sintetizzarli, per alcuni è invece indispensabile che uno o più di questi composti siano presenti nell’ambiente. Le vitamine sono i fattori di crescita più comunemente richiesti, come la tiamina (B1), piridossina (B6), B12, la biotina. Sono richiesti anche acidi come a. folico, a. pantotenico, a. paraminobenzoico e aminoacidi come leucina, lisina, fenilalanina, arginina.

CARBONIOAlcuni procarioti sono autotrofi, cioè sono in grado di costruire tutte le loro strutture a partire dalla CO2 grazie all’energia ricavata dalla luce, e quindi con la fotosintesi, o dal catabolismo composti chimici inorganici. Gli eterotrofi, invece, sono incapaci di usare la CO2 atmosferica e per questo usano carbonio organico ricavato attraverso la commensalità.

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ENERGIAL’energia è ottenuta per ossidazione (rimozione di elettroni) dei composti e viene conservata all’interno della cellula sotto forma di molecole come l’ATP dagli organismi chemiotrofi. Gli organismi in grado di ottenere energia dai composti organici sono chiamati chemio-organotrofi. Un certo numero di organismi possono ottenere energia dai composti inorganici. Questa forma di metabolismo è caratteristica degli organismi chemio-litotrofi. I microrganismi fototrofi contengono pigmenti che gli permettono di usare la luce come fonte di energia, attraverso la fotosintesi.

TEMPERATURAConsiderando la temperatura di crescita, alcuni microrganismi sono caratterizzati da temperature ottimali molto basse, altri invece prediligono temperature molto elevate. In funzione della temperatura ottimale essi possono essere suddivisi in quattro gruppi principali: gli psicrofili, che hanno un optimum a temperature basse (ambienti molto freddi); i mesofili, temperature a valore medio (+37°C, infatti possono essere patogeni od opportunisti); i termofili, temperature elevate (ambienti molto caldi); gli ipertermofili, temperature estremamente elevate (nei geyser e sorgenti termali).

pHAlcuni batteri prediligono un pH neutro, mentre altri possono crescere e/o sopravvivere a pH acido o a pH alcalino.

OSSIGENOI microrganismi dimostrano una certa esigenza e tolleranza. In funzione delle loro relazioni con l’ossigeno, i microrganismi possono essere suddivisi in diversi gruppi.Gli aerobi obbligati sono organismi capaci di crescere alla presenza di ossigeno e molti sono anche capaci di tollerare elevate concentrazioni. Questi microrganismi ricavano energia dalla fosforilazione ossidativi. I microaerofili, al contrario, sono aerobi che possono impiegare l’ossigeno solo se è presente a livelli ridotti rispetto a quello nell’aria. Quindi non sono né strettamente aerobi né anaerobi e si coltivano in laboratorio in un termostato con 5% di CO2 + aria. Molti aerobi sono facoltativi, ossia in appropriate condizioni di coltura e nutrienti, possono crescere in condizioni sia aerobiche sia anaerobiche. Quindi questi microrganismi possono sia fermentare che respirare. Alcuni microrganismi non possono utilizzare l’ossigeno come accettare finale di elettroni e sono detti anaerobi. Esistono due tipi di anaerobi: gli anerotolleranti, capaci di tollerare l’ossigeno e di crescere in sua presenza sebbene non possano utilizzarlo nel loro metabolismo, e gli obbligati, che sono inibiti o uccisi dall’ossigeno. Questi svolgono processi di fermentativi e sono

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inattivati dall’ossigeno. Inoltre mancano di due enzimi che sono la superossido dismutasi, che trasforma l’anione superossido in perossido di idrogeno, e la catalasi, che trasforma il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno.

TERRENI DI COLTURAÈ una preparazione in grado di permettere sviluppo microbico in vitro. Il ricorso a determinati terreni di coltura permette di ottenere l’isolamento di colonie, l’ottenimento di elevate quantità di cellule, lo studio di proprietà biochimiche.I terreni possono essere divisi in base alla loro composizione in terreni complessi, cioè composto dei prodotti di digestione di sostanze chimiche indefinite come estratti di lievito e di carne, e terreni minimi, cioè si conosce la composizione chimica; in base allo stato fisico in liquidi, cioè una certa composizione nutriente sciolta in acqua in beute o bottigliette (es. brodo nutriente), solidi (non si usano più, come la patata) e solidificabili, cioè gli stessi terreni liquidi vengono fatti solidificare con aggiunta di agar (= cioè un polisaccaride formato da agarosio + agaro pectina che non altera la composizione chimica e nutritiva del terreno perché, essendo un polisaccaride complesso, i batteri non lo utilizzano; si sciogli a 97-100°C e gelifica a 42°C) per studiare le colonie (Nutrient Agar); in base alle loro funzioni in elettivi, sono terreni completi e arricchiti (proteine, zuccheri, sali, sangue) e permettono la crescita di molti microrganismi, selettivi, sono terreni di arricchimento e selezione che permettono di selezionare le microflore in base ai nutrienti che gradiscono, e differenziali, sono terreni minimi contenenti un unico componente. In base alla composizione i terreni minimi vengono usati per studi di metabolismo, selezione di mutanti, dosaggi microbiologici, mentre i terreni complessi per crescita rapida, crescita abbondate, crescita di microrganismi con particolari esigenze. Nel terreno liquidi la manifestazione della crescita si ha con l’intorbidamento del liquido, mentre nel terreno semisolido compaiono le colonie isolate o in patina confluita. Le colonie si formano come unità isolate per carenza di nutrienti intorno alla zona di crescita primaria, per accumulo di cataboliti, per carenza di ossigeno. In genere il numero di cellule per colonia va da 106 a 107, formandosi in 20-25 generazioni. Usare i terreni solidificabili comporta dei vantaggi come l’isolamento delle colonie, si può osservare la morfologia e l’aspetto della colonia, per il conteggio delle colonie.

In base alla funzione o applicazione:TERRENI ELETTIVI (o completi)Si distinguono terreni elettivi normali e terreni elettivi arricchiti. Quelli normali sono ricchi di sostanze che permettono lo sviluppo indiscriminato delle varie specie batteriche (es. brodo, nutrient-agar). Quelli arricchiti, invece, hanno un’aggiunta di estratto di lievito o di vitamine e aminoacidi, infuso di cuore, cervello ecc, aggiunta di siero, sangue, liquido ascetico.

TERRENI DI ARRICCHIMENTO E TERRENI SELETTIVIEntrambi contengono sostanze che interferiscono con la riproduzione di specie non desiderate. Un esempio di terreno di arricchimento liquido è il brodo selenite o il brodo Kaufman-Muller.

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I terreni selettivi solidificabili contengono sostanze batteriostatiche o battericide a differente spettro di azione e a differenti concentrazioni. Un esempio è dato da: sali biliari, tellurito di potassio (K2TeO3), cloruro di sodio, azide sodica, coloranti vari (es. verde brillante), antibiotici.I terreni selettivi possono essere anche differenziali.Nel terreno selettivo è inoltre possibile svelare un determinato metabolismo, es. carboidrati, per la presenza di indicatori di pH (es. terreni per l’isolamento delle Enterobacteriaceae).

PRINCIPALI COMPONENTI DEL TERRENO SELETTIVO:1. Bile: inibisce la crescita della flora batterica Gram+2. Lattosio: può essere fermentato o meno a seconda della specie3. Indicatore: mette in evidenza se è avvenuta o meno la fermentazione del lattosio

Variando la concentrazione della bile, della composizione organica, in sali e dell’indicatore si hanno terreni più o meno selettivi:

- Mac Conkey Agar (MCA): sali biliari 0.15% indicatore rosso neutro- SS – Agar (SSA): 0.85% rosso neutro- Hectoen Enteric Agar (HEA): 0.90% fucsina acida + blu timolo

TERRENI DIFFERENZIALIPermettono di definire le caratteristiche biochimiche dei batteri e contengono un’ unica componente chimica metabolizzabile, come carboidrato, aminoacido, etc. Non contengono fattori di selettività, ma è tassativo che l’inoculo sia costituito da batteri già isolati in coltura pura. La positività del test può essere valutata mediante: rilievo di crescita, viraggio indicatore di pH, aggiunta di reattivi. La lettura può anche derivare dall’intorbidimento della provetta che indica che il batterio sta utilizzando il substrato. Un terreno differenziale, però, da solo non serve. Si deve fare quindi una batteria di terreni: otterremo una stringa di risultati, alcuni positivi e altri negativi. Industrialmente si producono dei kit con l’inserimento di alcuni caratteri per un terreno differenziale per un determinato batterio (Enterobatterio, Streptococchi, Stafilococchi, etc.). Un esempio di questi kit è l’Enterotube utilizzato per gli Enterobatteri. Questo è una specie di contenitore di plastica trasparente dove sono ricavati dei scompartimenti dove ci sono terreni differenziali organizzati. È coperto da due coperchi per non avere contatto con l’aria in modo da non avere contaminazione. Una volta tolti i coperchi c’è una specie di ago, da un lato la punta e dall’altro il manico, che serve a toccare la colonia di interesse e tirando su il manico inoculo tutti i terreni. Poi si richiude con i coperchi e viene messo ad incubare in termostato. I diversi colori dipendono dal diverso indicatore di pH all’interno del terreno. Se il colore non è cambiato significa che non è cresciuto nulla, quindi si è sbagliato ad allestire la prova oppure il microrganismo inoculato non è un Enterobatterio. Se il colore varia la reazione è positiva, anche se ovviamente non saranno tutte positive. I primi tre scompartimenti (destrosio = glucosio; lisina; ornitina) hanno un velo di paraffina che copre completamente il terreno in modo da non far venire a contatto il terreno con l’ossigeno durante l’aspirazione con l’ago. Se diventa giallo e la paraffina non si stacca, il batterio ha fermentato ma non ha prodotto gas. Se, invece, la paraffina si è staccata il batterio ha fermentato e prodotto gas. L’interpretazione dei risultati ottenuti viene fatta attraverso degli appositi foglietti che ripropongono il kit, dove sono riportati, con un valore numerico, ogni reazione che può avvenire. Tali numeri sono stabiliti in modo che le reazioni che leggiamo siano riunite a tre a tre e i codici sono sempre 4, 2, 1. Attraverso questi pesi si possono ottenere otto combinazioni:

1. nessuna reazione positiva = 02. positivo solo lisina = 13. positivo solo il gas = 24. positivo solo il primo = 45. positivi i primi due = 66. positivi gli ultimi due = 3

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7. positivi il primo e l’ultimo = 58. positivi tutti e tre = 7

Il calcolo combinatorio può dare tantissime combinazioni e in questo modo possiamo trovare tanti numeri da cinque cifre che opportunamente codificati sono correlati al nome del batterio che ha dato quei risultati, cioè che ha avuto quelle reazioni. Tutti i batteri fermentano il glucosio, quindi il primo numero combinatorio non sarà mai inferiore a 4, ma sarà 4, 5, 6 o 7. Il numero di cinque cifre deve essere letto nella stampa fornita dalla ditta produttrice del kit o nel loro database (es. 40165 = Enterobacter agglomerans). Numeri vicini tra di loro corrispondono alla stessa specie e questo è dovuto al fatto che sono ceppi diversi della stessa specie: differiscono soltanto per qualche caratteristica (una o più di una). Quando un numero corrisponde a più nomi significa che le reazioni del kit non hanno una corretta discriminazione e quindi occorrono ulteriori test da fare per risolvere il dubbio diagnostico, che vengono riportare accanto al nome dei batteri trovati insieme alla percentuale di probabilità che sia l’uno o l’altro. Un altro esempio è l’API 20 Є dove Є sta per Enterobatteri. Questo sistema viene prodotto da una ditta diversa ed è un insieme di capsule con all’interno i vari terreni differenziali liofilizzati. Dalla mia piastra con le colonie trasferisco con l’ago delle colonie in provetta per avere una soluzione. Con una microprovetta metto la soluzione in tutte le capsule, il terreno si scioglie e ottengo il terreno differenziale. All’interno di ogni capsula sono presenti già dei coloranti che danno colori diversi in base alla reazione. In questo test troviamo sette cifre invece che cinque perché ci sono più reazioni e disposte in modo diverso. Perciò bisogna usare dei manuali diversi per avere il risultato. Alle sette combinazioni numeriche se ne possono aggiungere altre due con una combinazione accessoria. Per gli Stafilococchi, invece, il kit si chiama API Staf, mentre per gli Streptococchi è API Strept.

Utilizzazione di carboidratiEsosi (C6H12O6): glucosio, fruttosio, galattosio, mannosio, sabosioPentosi (C5H10O5): arabinosio, xilulosio, ramnosio (C6H10O5)Alcoli polidric…: mannitolo, glicerolo, adonitolo, dulcitolo, sorbitoloDisaccaridi (C12H22O11): maltosio, saccarosio, lattosio, cellobiosio, melibiosioTrisaccaridi (C18H32O16): raffinosio, melizitosioEsani (C6H10O5): amido, inulina, destrina, glicogeno, galattano, cellulosaPentani (C5H8O4): arabaro, filanoGlucosidi: salicina, amigdalina, esculina

Utilizzazione di aminoacidiDecarbossilazione: l’enzima decarbossilasi toglie un carbossile (COOH) e si ha un aumento di pHDeamminazione: la deamminasi toglie un gruppo amminico(NH3) e si forma un complesso coloratoProduzione di H2S (acido solfidrico): l’enzima riduttasi porta all’annerimento delle colonie in

presenza di sali di ferro

Produzione di indolo: TEST INDOLOIl terreno di coltura contiene il triptofano (un aminoacidi con gruppo eterociclico). Se il batterio produce triptofanasi, il triptofano viene degradato e si forma una zona isolata: l’indolo + ammoniaca + acido piruvico. Altri batteri rompono l’anello e non si forma l’indolo, ma ciò non si vede perché l’indolo non dà colore. Se aggiungiamo con la siringa un reattivo detto reattivo di Kovacs (para-dimetil-amino-benzoaldeide), il reattivo si complessa con l’indolo incolore e si forma una colorazione rossa e quindi il batterio è indolo positivo.

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COLTIVAZIONE ANAEROBIInnanzitutto bisogna fare in modo che i campioni, già dal prelievo, non vengano a contatto con l’ossigeno, perché se il batterio anaerobio obbligato viene a contatto con l’ossigeno il suo metabolismo produce sostanze tossiche per sé (ossidi, anioni superossidi) che non vengono smaltiti e quindi il batterio poi muore. Quindi il materiale verrà messo in delle provette contenenti il tioglicolladio di sodio (una sostanza riducente) che viene mescolato con il campione (Mezzo di trasporto di Stuart).Dispositivi di coltivazione:

- Giara con candela : è uno dei primi usati ed in pratica è un contenitore con coperchio, dove viene messo all’interno una candela e le piastre con i microrganismi con dei batuffoli di cotone immersi d’acqua in modo che non si essicchi l’ambiente di coltura ed umidifichi in modo da favorire la crescita. Viene poi chiuso con il coperchio. La fiamma quindi smette di bruciare perché non c’è più ossigeno e si mette ad incubare. In realtà, però, questa atmosfera di incubazione va bene per i microaerofili, cioè quelli che preferiscono un ambiente con anidride carbonica.- Dispositivo di Maymore : CO2 10%; H2 10%; N2 80%: è un ulteriore sviluppo del sistema precedente. Si ha un contenitore con un tappo, dei tubicini con rubinetti per inserire o togliere i gas. Con una pompa si toglie l’aria e dagli altri tubicini si aggiungono dei gas inerti. È un dispositivo laborioso e non viene più usato.- Sistema brevettato Gaspack : è una giara, cioè un contenitore che sostituisce gli altri, dove si può fare una chiusura con un coperchio avvitabile (ha una chiusura a tenuta) dove all’interno si possono mettere le piastre impilate. In presenza di acqua: si mette una bustina (aperta precedentemente) contenente Mg + ZnCl2 e si aggiunge 10 ml di acqua e si formano → MgCl2 + Zn(OH)2 + H2. All’interno c’è un catalizzatore per la trasformazione (palladio o asbesto platinato): H2 consuma O2 e forma H2O in modo che l’atmosfera di ossigeno viene trasformata in atmosfera di idrogeno. Per sapere se la reazione è avvenuta viene fatto un controllo:

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1. dalla bustina si tira fuori una strisciolina di carta impregnata di blu di metilene. Quando si forma l’idrogeno questo si trasforma in una leucobase, cioè si decolora e diventa bianca e deve rimanere bianca per tutto il tempo dell’incubazione, altrimenti significa che è entrata aria.

2. alcune giare hanno un manometro. Quando la reazione avviene si forma idrogeno che porta all’aumento di pressione. Se il manometro è in pressione, all’interno c’è ancora idrogeno; se invece c’è qualche rottura delle guarnizioni l’idrogeno esce e la pressione cala.

- Cappa per anaerobiosi : è come un box che ricopre il bancone con un vetro e si deve lavorare con i guanti posti all’interno dei fori. All’interno di questo ambiente c’è un’atmosfera di incubazione in cui ci sono dei tubi che tolgono aria e mettono idrogeno.

I terreni di coltura devono avere un basso potenziale redox (E0 = 0 mV), cioè assenza di ossigeno. Questa si ottiene mettendo nei terreni una grande quantità di sostanza riducente che possono essere metabolizzate dal microrganismo (zuccheri, carboidrati). A questi terreni si possono aggiungere sostanze che mettono in evidenza se c’è o non c’è il potere riducente: ad esempio si può mettere 1-2 gocce di blu di metilene.

CRESCITA BATTERICA

Una curva di crescita batterica, quella ottenuta coltivando una popolazione cellulare in un contenitore chiuso, può essere suddivisa in diverse fasi distinte tra di loro: fase di latenza, fase esponenziale, fase stazionaria e fase di morte. La crescita di una popolazione batterica inoculata in un terreno fresco di solito non inizia subito, ma solo dopo un periodo di tempo detto fase di latenza. Questo periodo può essere più o meno lungo a seconda della provenienza della coltura e delle condizioni di crescita: quando una popolazione batterica è trasferita da un terreno di coltura ricco ad uno più povero, perché le cellule trasferite in un nuovo terreno hanno bisogno di tempo per la sintesi di nuovi enzimi; se un inoculo prelevato da una coltura in fase stazionaria viene inoculato in un terreno con la stessa composizione, di solito si osserva una fase di latenza, perché le cellule provenienti da una coltura in fase stazionaria mancano in quantità ottimali di coenzimi o altri costituenti essenziali per la crescita e necessitano di un certo periodo di tempo per risintetizzarli. La fase esponenziale è conseguenza del fatto che ogni cellula si divide per formare due nuove cellule figlie capaci a loro volta di duplicarsi per formarne quattro, e così via. Le cellule in fase esponenziale di crescita sono quelle che solitamente si trovano nel migliore stato di salute e per tale motivo le cellule che si trovano nella parte centrale di tale fase sono spesso utilizzate per gli studi su enzimi o altri componenti cellulari. La velocità di tale crescita, però, è molto variabile. Ad influenzarla concorrono sia le condizioni ambientali (temperatura, composizione del terreno colturale) sia le caratteristiche genetiche del microrganismo.

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Coltivando una popolazione cellulare in un contenitore chiuso, la crescita esponenziale non può continuare per un tempo indefinito perché esistono dei meccanismi che limitano la crescita della popolazione. Generalmente, il termine della fase esponenziale è determinato da o dall’esaurimento di un nutriente essenziale del terreno di coltura o dall’accumulo, fino a livelli inibitori, di prodotti di rifiuto riversati nel terreno dal microrganismo stesso. Al verificarsi di una o di entrambe queste situazioni, la popolazione cellulare entra nella fase stazionaria, durante la quale il numerosi cellule non aumenta né diminuisce.Se l’incubazione prosegue oltre la fase stazionaria, le cellule possono sopravvivere e continuare il loro metabolismo o entrare nella fase di morte. Durante questo periodo la conta totale può rimanere costante, mentre la conta vitale diminuisce lentamente. Quando la morte è accompagnata da lisi cellulare sia la torbidità che il numero di cellule contate direttamente al microscopio diminuiscono parallelamente alla diminuzione registrata con una conta vitale. Le diverse fasi della curva di crescita di una popolazione batterica sono il risultato di eventi che interessano tutta la popolazione e non una singola cellula. Quindi queste fasi non sono applicabili alle singole cellule, ma soltanto a popolazioni di cellule. La velocità di crescita è la variazione del numero di cellule o della massa per unità di tempo. L’intervallo di tempo durante il quale da una singola cellula si formano due cellule figlie è definito generazione e il tempo richiesto per l’intero processo è detto tempo di generazione o di duplicazione. Il tempo di generazione può variare molto da un microrganismo all’altro e dipende in una certa misura dal terreno di crescita utilizzato e dalle condizioni di incubazione ed è dato da:

g = t/nL’aumento del numero di cellule durante la crescita esponenziale di una coltura batterica non è altro che una progressione geometrica in base 2 (21→22→23 e così via). Proprio per questa progressione geometrica, esiste una relazione diretta tra il numero di cellule presenti inizialmente in una coltura e il numero di cellule presenti dopo un certo periodo di crescita esponenziale: Nt = N02n

dove: Nt = numero finale di cellule al tempo t t = tempo N0 = numero iniziale di cellule al tempo 0 n = numero di generazioni avvenute nel periodo di crescita esponenzialePer esprimere l’equazione in funzione di n si passa al logaritmo:

log Nt = log N0 + log 2n = log N0 + n log 2 n = (log Nt – log N0) / log 2 (log 2 = 0,301)Un altro indice della velocità di generazione è la costante della velocità di crescita, k. Essa può essere calcolata come: velocità media: k = n/t e velocità massima: k =∆N/∆t, dove ∆N = log Nt2 – log Nt1 e ∆t = t2 – t1

Il tempo di generazione è dato da μ = 1 / k.La temperatura è uno dei più importanti fattori ambientali in grado di influenzare la crescita e la sopravvivenza dei microrganismi. Sebbene questi non possano crescere a temperature troppo basse o troppo alte, i valori assoluti di temperatura minima e massima variano ampiamente da un microrganismo all’altro ed in genere riflettono le oscillazioni di temperatura e la temperatura media dei loro habitat. All’aumentare della temperatura le reazioni chimiche ed enzimatiche della cellula procedono a una velocità maggiore e la crescita diventa più rapida. Tuttavia, oltre certi valori di temperatura, alcune proteine possono risultare danneggiate in modo irreversibile. Esiste quindi sia un intervallo di temperatura in cui le funzioni metaboliche e la crescita aumentano, sia un punto in cui iniziano reazioni di inattivazione; al di sopra di questo punto, le funzioni cellulari risultano azzerate. Per ogni organismo è possibile definire: una temperatura minima, al di sotto della quale non si ha crescita; una temperatura ottimale, alla quale si ha la massima velocità di crescita; una temperatura massima, al di sopra della quale non si ha crescita. La temperatura ottimale è sempre più vicina alla temperatura massima che alla minima. Queste temperature sono caratteristiche per ogni tipo di microrganismo, ma possono essere modificate da fattori ambientali e dalla composizione del terreno di coltura. Mentre la temperatura massima di un microrganismo è

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determinata dall’inattivazione di una o più proteine aventi un ruolo fondamentale nella cellula, meno chiari sono i fattori che determinano la temperatura minima. In un terreno complesso E. coli, tipico microrganismo mesofilo, presenta come temperatura ottimale circa 39°C, la massima a 48°C e la minima a 8°C. Questi valori sono soggetti a leggere variazioni legate al ceppo. Nella crescita diauxica l’organismo cresce dapprima utilizzando una fonte di energia e poi segue un lungo intervallo prima che la crescita ricominci utilizzando la seconda fonte.

lattosio CRESCITA DIAUXICA - 2 fonti di carbonio (glucosio, xilosio) densità ottica glucosio - 2 fasi esponenziali

tempo (ore)

Il grafico illustra la crescita diauxica in presenza di una miscela di glucosio e lattosio. Finché il glucosio è presente nel mezzo, l’enzima responsabile dell’utilizzazione dello lattosio, la β-galattosidasi, non viene sintetizzato e l’organismo cresce utilizzando il glucosio lasciando intatto il lattosio. Quando il glucosio è esaurito, la repressione da catabolita finisce. Dopo un intervallo si osserva sintesi di β-galattosidasi e inizia la crescita basata sul lattosio come fonte di carbonio. Le cellule crescono più rapidamente in presenza di glucosio. Le due fonti di carbonio vengono utilizzate in tempi diversi perché gli enzimi vengono prodotti quando servono. Quelli che servono all’utilizzazione del glucosio vengono sempre prodotti e vengono detti costitutivi, mentre gli enzimi per la degradazione del lattosio vengono sintetizzati solo quando viene utilizzato il lattosio e sono detti inducibili. Tra l’utilizzo del glucosio e quello del lattosio c’è una fase di latenza, perché la cellula si sta attivando per sintetizzare enzimi inducibili per degradare il lattosio. Un fenomeno complementare alla repressione è l’induzione di un enzima, cioè la sintesi di un particolare enzima solo quando è presente il suo substrato.

log N

tempo (ore)

Se il lattosio è assente nel mezzo, l’enzima β-galattosidasi non viene sintetizzato, mentre la sintesi inizia non appena al terreno viene aggiunto lattosio. Gli enzimi coinvolti nel catabolismo del carbonio o di altre fonti di energia sono spesso inducibili. La sostanza che dà inizio all’induzione di un enzima si chiama induttore; quella che ne reprime la sintesi si chiama corepressore. Queste sostanze, in genere molecole di piccole dimensioni, sono spesso indicate come effettori. Non tutti gli induttori o i corepressori sono substrati o prodotti finali degli specifici enzimi regolati. Nella crescita sincronizzata le cellule si dividono tutte insieme.

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Gli scalini tendono ad essere via via più piccoli perché anche se le cellule iniziano a dividersi insieme, a lungo andare si sfalsano, ma anche perché in ordinata c’è il logaritmo, quindi più si dividono più diventano numerose ed il logaritmo misura grandi numeri.

Metodi che agiscono sul metabolismo cellulare:- sbalzi termici (temperatura subottimale es. 37°C → 25°C)- affamamento = carenza di metabolici essenziali: amminoacidi, vitamine,basi azotate, etc.- pressione selettiva (concentrazione cellulare ~ 109 cellule/volume)- illuminazione (microrganismi fotosintetici: cicli luce/buio)

Metodi fisici:- centrifugazione in gradiente di saccarosio (le cellule sedimentano con velocità circa uguale alle

dimensioni)- filtrazione (condotta in serie su più filtri)

PRINCIPALI METODI PER MISURARE LACRESCITA BATTERICA (diretti e indiretti)Metodo Applicazione NOTECONTA MICROSCOPICA DIRETTA

Conteggio di batteri (latte, vaccini cellulari, colture)

Non permette di distinguere cellule vive e morte

CONTA VITALE Conteggio di batteri (latte, alimenti, acque, suolo, colture, etc.)

Molto sensibile (se condotta in condizioni ottimali)

NEFELOMETRIA (torbidità di sospensioni cellulari)

Stima di concentrazioni batteriche in mezzi liquidi (terreni liquidi, soluzione fisiologica, etc.)

Metodo rapido (sensibilità limitata, richiede retta di taratura a 520 nm)

Misura di N totale o proteine Stima totale del contenuto cellulare in mezzi ad alta densità

Applicazione perlopiù limitata al settore di ricerca

Attività biochimica (es. consumo O2, produzione CO2, produzione ATP, etc.)

Saggi di attività microbica

Misure ponderali (peso secco o umido di cellule, presenti in un determinato volume, raccolte per centrifugazione o filtrazione)

Stima del contenuto totale in biomassa (cell yield)

CONTEGGIOLa crescita di una popolazione batterica è misurata seguendo nel tempo la variazione del numero di cellule o del peso di alcuni elementi della massa cellulare (es. proteine) o, ancora, del peso secco delle cellule stesse. Esistono molti metodi per contare il numero di cellule o per valutare la massa cellulare, a seconda del tipo di microrganismo e del problema che s’intende affrontare. Il numero di cellule di una popolazione può essere determinato mediante conta diretta al microscopio. Tale tipo di conta può essere fatto sia su campioni essiccati su un vetrino sia su campioni sospesi in liquido. In quest’ultimo caso è necessario l’impiego di camere di conta, nelle quali il vetrino di superficie è inciso con un reticolo quadrettato di cui è nota l’area di ogni riquadro. Dato che lo spessore tra il reticolo e il vetrino coprioggetto è noto, è possibile determinare il volume di sospensione batterica contenuta in ogni riquadro. In pratica, il numero delle cellule presenti in ogni riquadro del reticolo è contato al microscopio; tale valore è poi convertito in numero di cellule per ml di sospensione moltiplicandolo per un fattore di conversione basato sul volume della camera. Eseguendo una conta totale si contano sia le cellule vive che quelle morte. Nei casi in cui, invece, si interessati solo alle cellule vive, si ricorre alla conta vitale. Si definisce vitale una cellula capace di dividersi e dare origine ad una progenie. Una conta vitale consiste nel determinare il numero di

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cellule di un campione in grado di formare colonie su un opportuno terreno agarizzato; è così anche detta conta in piastra o conta delle colonie. Il presupposto di tale conta è che ogni colonia sia originata da una singola cellula vitale. Vi sono due metodi per eseguire una conta in piastra:

1. il piastramento in superficie, dove il volume noto di una coltura opportunamente diluita, non maggiore di 0,1 ml, viene distribuito, con una spatola di vetro sterile, sulla superficie di un terreno agarizzato. La piastra viene poi incubata fino alla comparsa delle colonie, che vengono quindi contate. 2. il piastramento per inclusione, dove un volume noto, 0,1-1,0 ml, di coltura viene pipettato in una piastra di Petri sterile; viene poi aggiunto un terreno agarizzato fuso e il tutto viene mescolato facendo ruotare delicatamente la piastra sul piano di lavoro. In questo caso bisogna essere certi che il microrganismo incluso nell’Agar sia in grado di sopportare, per breve tempo, una temperatura di 45°C, pari a quella dell’Agar fuso.

Sia nel piastramento in superficie che in quello per inclusione è importante che il numero di colonie che si sviluppano su una piastra non sia troppo elevato, ma anche che non sia troppo basso. Per ottenere un numero di colonie appropriato, il campione da contare deve, quasi sempre, essere diluito. Di solito occorre fare più di una diluizione, usando una serie di diluizioni scalari in base 10. Per ottenere una diluizione di 10 volte si possono mescolare 1,0 ml di campione con 9,0 di diluente (acqua + soluzione fisiologica NaCl 85%?). Se è necessaria una diluizione di 100 volte si posso mescolare 0,1 ml di campione con 9,9 di diluente oppure si possono fare due successive diluizioni per dieci prelevando 0,1 ml dalla prima diluizione. Nella maggior parte dei casi è necessario effettuare diluizioni seriali ed il fattore di diluizione sarà il reciproco della diluizione.Es. diluizione 1/103 → piastro → conto 159 colonie → 159x103=1,59x10i cellule unità formanti colonia presenti in 1 ml del campione originario.Un metodo semplice e molto utile per ottenere una stima relativa della massa cellulare consiste nel misurare la torbidità. Una sospensione cellulare appare torbida perché ogni singola cellula riflette la luce. Quanto maggiore è il numero di cellule presenti, tanto più la sospensione riflette la luce e tanto maggiore sarà la torbidità. La torbidità può essere misurata con uno spettrofotometro o con un nefelometro, che fanno passare la luce attraverso una sospensione cellulare e misurano il primo la quantità di luce non riflessa che riemerge e il secondo la luce dispersa piuttosto che la luce residua non dispersa. Per gli organismi unicellulari, l’assorbanza (A = ε*c*d dove ε = costante, coefficiente di estensione; c = concentrazione; d = distanza) è proporzionale, entro certi limiti, al numero di cellule, perciò i dati sulla torbidità possono essere impiegati in sostituzione dei metodi per la conta diretta. Comunque, prima di questo, è necessario preparare per ogni microrganismo una curva standard che metta in relazione alcune misure dirette del numero di cellule (conta diretta al microscopio o conta vitale) o della massa cellulare (peso secco) con misure indirette, ottenute misurando la torbidità. A elevate concentrazioni di cellule, la luce riflessa da una cellula può essere mandata all’indietro da un’altra: di conseguenza alla fotocellula dello spettrofotometro risulterà che la luce non è stata riflessa in alcun modo. Quando accade ciò, la corrispondenza uno a uno tra numero di cellule e torbidità perde di linearità.

LOTTA ANTIMICROBICASterilizzazione: processo diretto alla distruzione mediante agenti fisici o chimici di tutti i microrganismi presenti in un determinato materiale; vale a dire uccisione di tutte le forme di vita, cioè vegetative, spore e virus. Non c’è un metodo migliore dell’altro, perché o sterilizza oppure no.Disinfezione: processo diretto all’annullamento della potenziale infettività di un materiale, non comporta l’eliminazione di tutti i microrganismi viventi; vale a dire distruzione mirata della maggior parte degli agenti patogeni. Si può parlare di un disinfettante migliore di un altro.Antisespsi: processo che mira ad impedire l’accrescimento o l’azione dei microrganismi.Asepsi: consiste in un insieme di norme atte ad impedire che su un determinato substrato pervengano germi infettanti.

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Mezzi fisici impiegati per ottenete sterilizzazione e disinfezione1) calore

2) radiazioni

3) filtrazione sterilizzazione a freddoCALORESterilizzazione diretta alla fiamma o flambaggio: è il metodo più semplice e rapido e si usa per anse, aghi, pinze e per le imboccature delle provette e delle beute. Si ottiene passando i suddetti oggetti attraverso la fiamma, ad esempio quella di un becco Bunsen.Calore secco: si utilizzano apposite stufe nelle quali si sistema il materiale che viene riscaldato con aria calda. In questa maniera si possono trattare oggetti di vetro, di metallo, polveri e sostanze oleose, mentre non è applicabile a materiale che può essere alterato da temperature elevate come la gomma, la plastica e la carta. Il calore secco causa la precipitazione dei soluti e l’ossidazione delle macromolecole più che la loro coagulazione. Devono essere impiegate temperature di 160°C per 1 ora. Ne consegue che le soluzioni acquose non possono essere sterilizzate con questo sistema, in quanto non si possono raggiungere nei liquidi temperature superiori a quelle di ebollizione.Calore umido: l’umidità ad elevate temperature determina la coagulazione delle macromolecole, ma gli effetti letali del calore sono dovuti probabilmente alla disintegrazione della membrana citoplasmatica e alla inattivazione degli enzimi. Questa procedura si può realizzare in due modi: utilizzando vapore sotto pressione oppure a pressione atmosferica (vapore fluente).

- Autoclave (vapore sotto pressione): è una sorta di camera metallica a chiusura ermetica (simile a una pentola a pressione) in cui viene generato vapore saturo sotto pressione. L’aumento della temperatura oltre i 100°C si ottiene con l’aumento della pressione interna del vapore. I valori di temperatura e pressione possono variare a seconda delle esigenze: in genere si usano 120,6°C (corrispondente ad 1atm) per 15 minuti o 111,7°C (corrispondente ad 0,5atm) per 30 minuti. L’eliminazione delle endospore resistenti al calore richiede temperature superiori al punto di ebollizione dell’acqua e l’uso di vapore sotto pressione.- L’uso del vapore fluente si realizza in autoclave lasciando la valvola di scarico aperta: in questo modo non si ha aumento di pressione, per cui la temperatura non va oltre i 100°C, per un tempo di 30-60 minuti. È usato per soluzioni di sostanze tremolabili, come certi aminoacidi, zuccheri, vitamine, che si alterano se sottoposti a temperature troppo elevate.

N.B. L’agente sterilizzante è il calore e non la pressione, perché questa serve solo per far aumentare la temperatura.

Pasteurizzazione: fu messa a punto da Pasteur per distruggere i microrganismi presenti nel vino e nella birra; viene impiegata per la conservazione degli alimenti dato che non ne altera le caratteristiche organolettiche. La pastorizzazione del latte, ad esempio, consiste nel sottoporlo alla temperatura di 65°C per 30 minuti (pastorizzazione bassa) o alla temperatura di 85°C per pochi minuti (pastorizzazione alta); questo trattamento serve per distruggere quei germi patogeni che possono essere trasmessi attraverso il latte.Tyndalizzazione o sterilizzazione frazionata: può essere considerata una pastorizzazione ripetuta. I liquidi organici da sterilizzare vengono sottoposti per 3 volte, a distanza di 24 ore, alla temperatura di 65-80°C. Negli intervalli il materiale viene tenuto a temperatura ambiente. In questo modo le spore sopravvissute al primo trattamento germinano e danno luogo a forme vegetative che vengono distrutte dal successivo trattamento termico.

FILTRAZIONEÈ usata per substrati liquidi che non tollerano l’esposizione al calore. I microrganismi possono essere allontanati facendo passare detti liquidi attraverso i filtri con pori di dimensioni tali da trattenere i batteri. Filtri usati nel passato: Filtri Seitz → dischi di amianto; Filtri di Chamberland → dischi di porcellana; Filtri di Berkfeld → dischi di farina fossile.

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Filtri attualmente in uso: Filtri a membrana o molecolare (membrane filtranti) costituiti da esteri di cellulosa o da altri polimeri, con pori di diametro uniforme (0,45 o 0,22 μm) e predeterminato montati su un adatto supporto; il liquido viene forzato a passare attraverso il filtro applicando una pressione negativa alla beuta destinata a raccogliere il filtrato oppure applicando una pressione positiva sopra il fluido. I liquidi così filtrati non sono sterili, in quanto i virus, per le loro dimensioni, passano attraverso le membrane.

RADIAZIONIL’impiego è limitato ai raggi UV e alle radiazioni ionizzanti. Raggi UV: sono impiegate radiazioni con λ ~ 260 nm, in quanto le basi puriniche e pirimidiniche presentano un massimo di assorbimento a questa lunghezza d’onda. Il principale meccanismo d’azione è l’induzione di dimeri di timina sia intracatenari che intercatenari (dimerizzazione della timina). Si usano lampade con vapori di mercurio a bassa pressione che forniscono una radiazione omogenea con λ tra 250 e 260 nm. Un’importante limitazione all’uso degli UV è che la radiazione ultravioletta è molto poco penetrante, perciò possono essere impiegati soltanto per distruggere i microrganismi che risiedono sulla superficie di oggetti e materiali. I raggi UV eccitano gli elettroni e li espellono a livelli energetici superiori, originando specie chimiche diverse e attivando reazioni atipiche.Radiazioni ionizzanti: sono radiazioni ad altissima energia sufficiente a far espellere elettroni dalle molecole, ionizzandole e dando origine a radicali liberi (es. radicale ossidrile OH• e alcuni perossidi, idrogeno libero), i quali sono in grado di reagire con macromolecole cellulari, provocando danni intracellulari gravi e quindi inattivandole. Sono usati i raggi X ed i raggi γ, che dato il loro alto grado di penetrazione, sono usati per la sterilizzazione di presidi medico-chirurgici monouso, sottoposti al trattamento già confezionati nell’imballo finale. I raggi X sono letali, ma poco usati nella lotta antimicrobica; vengono usati per produrre mutanti. I raggi γ sono radiazioni ad alta energia emesse da isotopi radioattivi 60Co, 137Cs. La bassa lunghezza d’onda ne permette una facile penetrazione nei materiali sottoposti a trattamento, anche se hanno grossi spessori.

Ciclo di sterilizzazione

Il parametro più utilizzato per caratterizzare la sterilizzazione mediante calore è il tempo di riduzione decimale o D, cioè il tempo necessario, misurato in minuti, per ridurre, a una data temperatura, la popolazione al 10% del valore iniziale, ovvero inattiva al 90%.

Nell’intervallo di temperatura solitamente utilizzato nella preparazione dei cibi, la relazione tra D e la temperatura è essenzialmente esponenziale. Quindi, ponendo in grafico il logaritmo di D contro la temperatura, si ottiene una retta.

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La pendenza della retta offre un’indicazione quantitativa della sensibilità al calore dell’organismo in esame nelle condizioni adottate. Grafici di questo tipo vengono usati per calcolare i tempi di sterilizzazione necessari in diversi processi.Il tempo di riduzione decimale non è affatto semplice da determinare, dato che è necessario allestire un numero elevato di conte vitali. Un metodo più semplice per rilevare la sensibilità al calore di un microrganismo consiste nel rilevare il tempo di inattivazione termica, cioè il tempo necessario per uccidere tutte le cellule di una popolazione a una data temperatura. Questo dipende dalle dimensioni della popolazione saggiata. Per ottenere questo dato basta scaldare per tempi diversi campioni di una sospensione cellulare, mescolandoli a un terreno di coltura e incubandoli. Se tutte le cellule sono state uccise, nei campioni incubati non si osserva traccia di crescita.

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MUTAZIONI: basi molecolariUna mutazione è qualunque alterazione permanente nella sequenza delle basi del DNA che quindi porta ad una modificazione del genotipo. Le mutazioni si verificano in tutte le colture ed occorre esaminare un grande numero di cellule per trovarle perché non sempre sono manifeste in condizioni normali. A volte, infatti, possono avvenire delle mutazioni silenti, cioè quando una base viene sostituita con un’altra si può avere che:- la tripletta codifica per lo stesso aminoacido e quindi la proteina non è alterata;- il gene modificato codifica per una proteina non indispensabile;- il gene mutato non si esprime;- si origina una tripletta con codice degenerato;- il gene mutato soppresso.Quando la mutazione coinvolge singole coppie di basi si possono avere mutazioni per:

- sostituzione: è un cambiamento nel DNA tale che una coppia di basi viene sostituita con un’altra. Ci sono due tipi di sostituzioni: quelle per transizione, dove una coppia di basi purina-pirimidina viene sostituita con un’altra purina-pirimidina (es. AT in GC), e quelle per transversione, dove una coppia di basi purina-pirimidina viene sostituita con una pirimidina-purina (AT in TA). Le mutazioni geniche possono essere:• mutazioni dissenso, dove una sostituzione di una coppia di basi nel

DNA causa un cambiamento nel codone del mRNA e quindi un inserimento di un aminoacido differente;

• mutazioni non senso, determinano un cambiamento nel mRNA da un codone che specifica per un aminoacido ad un codone di stop (UAG, UAA, UGA);

• mutazioni neutre o stesso senso, determinano un cambiamento nel mRNA da un codone che specifica per un aminoacido ad un codone che codifica per un altro aminoacido ma chimicamente equivalente e quindi non altera la funzione della proteina (es. GUU codifica per valina → GCC codifica per alanina, ma sono entrambi neutri).

- inserzione, cambia la fase di lettura dei codoni del mRNA;- delezione, cambia la fase di lettura dei codoni del mRNA.

Le mutazioni cromosomiche sono le variazioni rispetto alla situazione normale selvatica della struttura o del numero di cromosomi e interessano prevalentemente gli eucarioti. Ne esistono quattro tipi principali: delezioni e duplicazioni, che implicano un cambiamento nella quantità di DNA di un cromosoma; inversioni, dove c’è un cambiamento nell’orientamento di un tratto cromosomico; traslocazioni, dove c’è un cambiamento nella localizzazione di un segmento cromosomico. Tutti e quattro hanno origine da una o più rotture nel cromosoma. Una delezione è una mutazione cromosomica in cui un tratto di cromosoma è mancante ed è prodotta da rotture nei cromosomi. Una mutazione di questo tipo non può essere riparata. Una duplicazione è una mutazione cromosomica che deriva dal raddoppiamento di un tratto di cromosoma. Questa mutazione può essere riparata con una delezione, ma è quasi impossibile.Un’inversione è una mutazione cromosomica che si verifica quando un segmento cromosomico viene exciso e poi reintegrato nel cromosoma dopo aver subito una rotazione di 180° rispetto all’orientamento originale. Questa può comprendere il centromero (pericentrica) oppure può non comprenderlo (paracentrica). Una traslocazione è una mutazione cromosomica in conseguenza della quale vi è un cambiamento nella posizione e quindi una diversa localizzazione nel genoma di segmenti cromosomici e delle sequenze geniche in essi contenute. Gli analoghi delle basi sono basi molto simili alle normali che ritrovano nel DNA. Questi esistono in stati chimici alternativi: uno normale e uno raro. Questi stati alternativi si chiamano tautomeri. Dato che questi sono molto simili alle basi normali, possono essere incorporati nel DNA al posto delle basi normali. Quando ciò avviene, l’analogo può causare una mutazione appaiandosi con una base scorretta durante la replicazione. Alcuni esempi sono: la forma tautomerica dell’adenina

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(imino invece che amino) si appaia con la citosina; la forma tautomerica della guanina (enol invece che cheto) si appaia con la timina. La genetica studia i fenomeni ereditari e di variabilità. I fenomeni ereditari sono: trasmissione dei caratteri; specificità delle strutture; specificità delle funzioni. I fenomeni di variabilità, invece, sono: modificazioni di forma; modificazioni di volume; perdita o acquisto di …; colonie a superficie liscia o rugosa; variazioni biochimiche; antibiotico-resistenza. Il genotipo è la somma dei determinanti trasmessi dalle cellule madri alle figlie. I determinanti genetici possono essere cromosomici (cromosoma a struttura circolare avente 5x106 coppie di nucleotidi) oppure extra-cromosomici (plasmidi, trasposoni ed episomi). Il fenotipo è la manifestazione dei caratteri morfologici e funzionali e, quindi, del genotipo.Il tasso di mutazione indica la probabilità associata al verificarsi di modificazioni genetiche nel tempo ed è dato da: α = m / d , dove: α è il tasso di mutazione; m è il numero di mutanti e d è il numero di divisioni cellulari (NT – N0). Poiché le colture batteriche in sviluppo non sono coincidenti si avrà che: α = m / (NT – N0)/ln2 , cioè α = m / (NT – N0)/0,69.A seconda dei caratteri interessati il valore di m può essere ricavato contando i cloni mutati su terreni selettivi (es. in presenza di antibiotici o batteriofagi) o su terreni minimi agarizzati (es. mutanti nutrizionali). Esistono due teorie sull’origine della variazione genetica:

1. teoria adattativa: il mutante si origina per azione diretta del nuovo ambiente. Tutte le cellule hanno la stessa probabilità di mutare (non clonale).2. teoria selettiva: le mutazioni avvengono spontaneamente in geni di pochissime cellule di una popolazione sulle quali il nuovo ambiente funge da agente selezionante (clonale).

RICOMBINAZIONEI fenomeni di ricombinazione sono processi mediante i quali si creano nuove associazioni di geni. È un evento raro, che interessa una parte limitata della popolazione e l’organismo interessato è detto ricombinante. La frequenza di ricombinazione è piuttosto bassa ed interessa più caratteri associati. Insieme alle mutazioni i fenomeni di ricombinazione originano la variabilità genetica su cui si opera la selezione naturale. I processi di ricombinazione nei procarioti sono: trasformazione, coniugazione, trasduzione e conversione.

TRASFORMAZIONELa prima dimostrazione della trasformazione batterica venne ottenuta dallo scienziato Griffith nel 1928. Egli stava lavorando con lo Streptococcus pneumoniae, un batterio che deve la sua abilità di invasione in parte alla presenza di una capsula polisaccaridica, che rappresenta la virulenza. È possibile isolare mutanti privi della capsula e quindi incapaci di causare infezione, detti ceppi R, perché le loro colonie appaiono ruvide in Agar, in contrasto con l’apparenza liscia di quelli capsulati che vengono detti ceppi S. Un topo infettato solo con poche cellule del ceppo S muore in uno o due giorni di infezione pneumococcica, mentre ciò non si verifica con cellule del ceppo R. Griffith dimostrò che se venivano iniettate cellule S uccise al calore insieme a cellule R vive, si sviluppava un’infezione letale e i batteri isolati dal topo morto erano di tipo S. L’esperimento fu provato con cellule S uccise al calore di ceppi diversi di Pneumococchi da quello da cui derivavano i ceppi R. Poiché le cellule S viventi isolate avevano la capsula del tipo posseduto dalle cellule S uccise al calore, si concluse che le cellule R erano state trasformate in un nuovo ceppo. La spiegazione molecolare della trasformazione dei ceppi di streptococco fu trovata dallo scienziato Avery. Egli dimostrò che, in certe condizioni, il processo di trasformazione può avvenire in provetta oltre che nel topo e che l’estratto privo di cellule uccise al calore può indurre trasformazione. La frazione attiva dell’estratto privo di cellule fu purificata e venne dimostrato che consisteva in DNA. L’attività trasformante della preparazione di DNA purificato era molto alta ed era necessaria solo una piccola quantità di materiale. In seguito venne dimostrato che la trasformazione avviene

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nel pneumococco non solo con il carattere capsulare, ma anche con altri caratteri genetici dell’organismo, come la resistenza agli antibiotici e la fermentazione degli zuccheri. La trasformazione genetica è un processo mediante il quale un DNA libero viene incorporato in una cellula ricevente e determina un cambiamento genetico. Si è osservato che numerosi procarioti hanno la facoltà naturale di trasformarsi, comprese alcune specie di batteri Gram- e Gram+. Tuttavia, anche nei generi trasformabili, solo alcuni ceppi o specie possono effettuare questo processo. Il DNA di un procariote è presente nella cellula come una singola grande molecola che fuoriesce dalla cellula quando questa è lisata delicatamente. Una singola cellula di solito incorpora solo uno o pochi frammenti di DNA, per cui solo una piccola frazione di geni di una cellula può essere trasferita a un’altra durante un singolo evento di trasformazione. Una cellula in grado di assumere una molecola di DNA e di essere trasformata è detta competente. Nella maggior parte dei batteri trasformabili la competenza è regolata e vi sono proteine specifiche che hanno il compito di prelevare e processare il DNA. I batteri utilizzano diverse strategie per acquisire DNA esogeno, sebbene entri nel citoplasma solo DNA a singolo filamento. Un batterio Gram- come Haemophilus è in grado di acquisire solo DNA a doppio filamento, nonostante che solo DNA a singolo filamento venga effettivamente incorporato nel genoma per ricombinazione. Nei batteri Gram+ come Streptococcus e Bacillus viene acquisito solo DNA a singolo filamento, mentre il filamento complementare viene simultaneamente degradato. In ogni caso è il DNA a doppio filamento che si lega effettivamente alla cellula. Durante la trasformazione vi è una prima fase in cui i batteri competenti legano il DNA in modo reversibile mentre dopo poco il legame diviene irreversibile. In Haemophilus influenzae è necessario che il frammento di DNA abbia una sequenza particolare di 11 paia di basi perché possa avvenire un legame irreversibile e quindi l’acquisizione. Il DNA trasformante si lega alla superficie della cellula mediante una proteina legante il DNA, dopo di che o penetra l’intero frammento a doppio filamento o una nucleasi degrada un filamento e l’altro viene acquisito. Non appena penetrato, il DNA si associa a una specifica proteina di competenza finché non raggiunge il cromosoma dove la proteina viene sostituita dalla proteina RecA. Il DNA viene poi integrato nel genoma del ricevente mediante un processo di ricombinazione. Durante la replicazione si formeranno una molecola di DNA parentale e una ricombinante. Quest’ultima sarà presente nella cellula trasformata, che ora risulterà geneticamente modificata. Se la ricombinazione non avviene il DNA che entra non si può replicare e viene perduto. Solamente in pochi batteri è possibile osservare un’efficiente trasformazione naturale, ad esempio Acinetobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria. Molti procarioti sono trasformati con grande difficoltà e non tutti in condizioni naturali. Il DNA di specie non affini può penetrare, ma non si integra. La penetrazione del DNA in natura avviene soprattutto nei batteri Gram+. In laboratorio, con scariche elettriche, possiamo ottenere la penetrazione nei batteri Gram-.

FIGURA DEL LIBRO A PAG….

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TRASDUZIONELa trasduzione venne scoperta da Lederberg e Zinder nel 1952. È un processo nel quale un batteriofago (= virus dei batteri) trasferisce l’informazione batterica da un batterio donatore ad uno ricevente; questi virus vengono detti fagi vettori. La quantità di DNA che un fago può trasportare è limitata.

testa Batteriofago: riconosce i recettori presenti sullacollo e colletto parete cellulare del batterio, vi si lega

e muta l’informazione geneticastilo e guainapiastra con spinefibre

Una volta che il materiale genetico è stato introdotto nella cellula ricevente può andare incontro a ricombinazione con la regione omologa del cromosoma del ricevente. I ricombinanti vengono detti trasduttanti. Ad esempio, quando il DNA del fago λ viene inoculato in E. coli possono essere seguiti due diversi cicli: il ciclo litico e il ciclo lisogeno. Nel ciclo litico il fago, che non è in grado di riprodursi da solo, si replica invadendo una cellula batterica ed utilizzando materiali del batterio per produrre nuovi virus. La cellula ospite quindi si rompe e libera la progenie virale. Nel ciclo lisogeno il cromosoma di λ non si replica, viene invece integrato in una specifica regione del cromosoma della cellula ospite. In questo stato integrato il genoma del fago è detto profago. Ogni volta che il cromosoma della cellula ospite si replica, il cromosoma λ integrato replica anch’esso. Lo stato di profago è mantenuto dall’azione di una proteina repressore che impedisce l’espressione dei geni di λ essenziali per il ciclo litico. Quando il repressore viene distrutto (es. raggi UV) viene indotto il ciclo litico. Possono avvenire due diversi tipi di trasduzione: - quella generalizzata, dove qualsiasi gene può essere trasferito da un batterio all’altro;- quella specializzata, dove solo determinati geni vengono trasferiti. Un esempio di trasduzione generalizzata è quella operata dal fago P1 in E. coli. Se il fago non mantiene lo stato di profago, entra nel ciclo litico e produce progenie fagica. Durante il ciclo litico, il DNA batterico viene degradato e in rare occasioni pezzi di DNA batterico vengono impacchettate nella testa fagica al posto del DNA fagico, formando fagi trasducenti. Quando avviene la lisi, viene rilasciato il lisato fagico che può andare ad infettare una nuova popolazione batterica.

FIGURA DEL LIBRO A PAG…..

Un esempio di trasduzione specializzata è quella operata dal fago λ in E. coli. Il cromosoma di λ si integra al cromosoma batterico con un singolo evento di crossino-over in un sito specifico (per λ è il

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sito att e per E. coli è attλ ) . Il fago è ora allo stadio di profago. Se la proteina repressore viene distrutta, lo stato di profago non viene mantenuto ed inizia il ciclo litico. Il cromosoma fagico si ripiega ad ansa e, con un singolo evento di crossino-over, in corrispondenza dei siti att-attλ, viene generato un cromosoma di λ circolare separato dal cromosoma batterico. A questo punto si possono avere due casi:

1. se avviene un’excisione precisa si genera un cromosoma di λ normale e completo, separato da quello batterico2. se avviene un’excisione anomala, che avviene in siti diversi da quelli omologhi, si genera un cromosoma di λ difettivo e non completo, contenente un pezzo del cromosoma batterico, ed un cromosoma batterico contenente un pezzo del cromosoma fagico.

FIGURA DEL LIBRO PAG…..

Un esempio di questo secondo caso può essere questo:

FIGURA DELLE DISPENSE (FOGLIETTO GIALLO)!!

CONIUGAZIONEÈ un processo nel quale avviene il trasferimento unidirezionale di informazione genetica attraverso il diretto contatto tra una cellula batterica donatrice ed una ricevente. I geni che controllano la coniugazione sono contenuti nella regione tra del plasmide. Molti geni in questa regione sono coinvolti nella formazione delle coppie di coniugazione e la maggior parte di questi ha a che fare con la sintesi di una struttura superficiale detta pilo sessuale, presente solo nelle cellule donatrici, che permette di connettere fisicamente le cellule. In seguito, un segmento del cromosoma del donatore può essere trasferito nel ricevente, probabilmente dopo fusione delle membrane esterne, e può andare incontro a ricombinazione con la regione omologa del cromosoma del ricevente. Non appena inizia il trasferimento di DNA, nel donatore, mediante il meccanismo di replicazione asimmetrica o a sigma, si ha la sintesi del DNA che porterà alla sostituzione del filamento trasferito.

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Un filamento di DNA complementare viene sintetizzato anche nel ricevente, cosicché alla fine del processo entrambi possiedono un plasmide intero. Il trasferimento del materiale genetico tra i ceppi è mediato da un fattore sessuale (F), che la cellula donatrice ha (F+) e che quella ricevente non ha (F-). In E. coli questo è un esempio di plasmide, cioè un pezzo di DNA circolare che si replica autonomamente rispetto al cromosoma dell’ospite. Il fattore F contiene una regione del DNA detta origine, dalla quale ha inizio il trasferimento del DNA al ricevente. L’unione fisica tra le cellule F+

e F- è permessa da dei geni detti pili F. Le due cellule vengono messe a contatto:- avviene un taglio di un singolo filamento di DNA del fattore F nel sito di origine e da qui procede la replicazione;- quando il fattore F entra nella cellula F-, viene sintetizzata l’elica complementare;- quando tutto il fattore F è stato trasferito, la cellula F- diventa F+.Per ottenere, attraverso la coniugazione, ricombinazione di geni cromosomici sono necessari dei ceppi detti Hfr (= alta frequenza di ricombinazione). Questi si originano per un raro evento di crossino-over tra fattore F e cromosoma batterico, quindi, a differenza delle cellule F+, sono cellule che hanno integrato il plasmide F nel cromosoma. Le cellule Hfr possono coniugarsi con cellule F-, ma in questi casi la cellula non acquisisce quasi mai il fenotipo F+, perché deve ricevere una copia completa del fattore F, che invece viene trasferita solo in parte. Le cellule Hfr possono diventare con bassa frequenza F+ per excisione del fattore F dal cromosoma. È stato studiato il trasferimento di geni cromosomici da ceppi Hfr a cellule F- attraverso la coniugazione interrotta. Questo esperimento consisteva nell’incrociare Hfr (SMS) x F- (SMR) e, a vari intervalli di tempo dopo che la coniugazione aveva avuto inizio, separare i batteri coniugati e analizzare i transconiugati piastrandoli su terreni selettivi con SM (= streptomicina) e varie combinazioni di nutrienti, per determinare quali geni del donatore erano stati acquisiti dal ricevente. Gli ultimi geni che venivano trasferiti erano quelli del fattore F. La frequenza dei ricombinanti si abbassa man mano che i geni entrano nel ricevente più tardi. Un solo fattore F è integrato in ciascun ceppo Hfr e diversi ceppi Hfr hanno un fattore F integrato in posizioni e orientamenti diversi. I ceppi Hfr differiscono l’un l’altro riguardo al punto in cui ha inizio il trasferimento e all’ordine dei geni trasferiti.

FIGURA DEL LIBRO A PAG…

CONVERSIONEÈ un fenomeno di ricombinazione che coinvolge i batteriofagi. In questo caso il genoma fagico lisogenizzato si integra nel genoma batterico, viene convertito allo stato di profago e fornisce alla cellula ospite caratteristiche non possedute in assenza di tale evento. La manifestazione più

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frequente è quella che consiste nella produzione di particolari metaboliti proteici (esotossine) espressi dall’integrazione del genoma virale in quello batterico. Alcuni esempi sono:

- il fago β si integra nel genoma del batterio Streptococcus pyogenes e si ha la produzione della tossina eritrogenica;- il fago CE β si integra nel genoma del batterio Clostridium botulinum e si ha la produzione della tossina botulinica;- il fago λ si integra nel genoma di E. coli e si ha la produzione della enterotossina.

ENZIMI BATTERICIPossono essere divisi in tre gruppi:

1. costitutivi, che sono prodotti indipendentemente dalla presenza dei rispettivi substrati (es. metabolismo glucosio in E. coli);2. inducibili, che sono assenti in mancanza di substrato specifico (es. metabolismo lattosio in E. coli);3. reprimibili, cioè la sintesi viene bloccata in presenza di sostanze prodotte dal metabolismo

(es. sintesi di triptofano).

GENI INDUCIBILI La loro l’espressione è condizionata dalla presenza di un substrato induttore:

- lattosio (espressione dei geni lac)- antibiotici (espressione dei geni di resistenza)- pathways catabolici vari

Questo tipo di geni sono implicati in processi metabolici.

GENI REPRIMIBILILa loro espressione è condizionata dalla presenza di un co-repressore originato dal metabolismo, come:

- triptofano (espressione geni tpr)- pathways biosintetici vari

Questo tipo di geni sono implicati in processi anabolici.

FOGLIETTO ROSA DELLE DISPENSE!!

Un esempio di sistema inducibile è l’operone lac in E. coli.L’operatore è la regione adiacente al promotore che regola l’inizio della trascrizione dell’operone. L’operone è costituito da un gruppo di geni, la cui espressione è coregolata dalle interazioni della proteina regolatrice con il sito operatore, dalla regione operatore stessa e dal promotore.L’ordine degli elementi di controllo e dei geni in E. coli dell’operone lac è: promotore lacI – lacI – terminatore lacI – promotore – operatore – lacZ – lacY – lacA – terminatoredove lacI è il gene regolatore dell’operone lac, cioè il repressore.

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E. coli può crescere in un terreno minimo che contiene sali e una fonte di carbonio, come il glucosio. Se gli viene fornito il lattosio viene subito sintetizzato un numero di enzimi necessari per metabolizzarlo. I geni che codificano per questi enzimi sono inattivi in assenza del lattosio e quindi sono detti iducibili. Il lattosio è un disaccaride, costituito da glucosio + galattosio. Quando questo è l’unica fonte di carbonio vengono sintetizzati tre enzimi:1. β-galattosidasi che catalizza la scissione di lattosio in glucosio e galattosio e la conversione del

lattosio in allolattosio (gene lacZ)2. Lattosio permeasi che è necessaria per il trasporto attivo del lattosio nella cellula (gene lacY)3. Transacetilasi (gene lacA)In assenza di un induttore viene sintetizzata la β-galattosidasi, ma non la permeasi. Solo con l’aggiunta del lattosio inizia la sintesi di una permeasi attiva. Quando un repressore è legato all’operone, l’RNA polimerasi può legarsi al promotore ma non può iniziare la trascrizione. Nell’istante in cui il repressore si stacca, e prima che se ne leghi un altro, la polimerasi può iniziare la trascrizione. Se, invece, c’è il lattosio, la β-galattosidasi lo converte in allolattosio, questo si lega al repressore cosicché è inattivato e non può legarsi all’operone. Quindi in assenza del repressore l’RNA polimerasi può legarsi al promotore e iniziare la trascrizione.Quindi l’operone lac è un sistema inducibile: in assenza di lattosio il repressore è attivo e si ha assenza di espressione; in presenza di lattosio il repressore è inattivo e si ha l’espressione. Un esempio di sistema reprimibile è il triptofano in E. coli.L’ordine degli elementi di controllo e dei geni in E. coli dell’operone triptofano è:

promotore – operatore – sequenza leader – trpE – trpD – trpC – trpB – trpA – terminatoreIn questo caso il controllo avviene dopo l’inizio della sintesi di RNA, ma prima che questa sia completata. Viene quindi ridotto il numero di trascritti (di un gene o di un operone) completi e non quello dei trascritti iniziati. L’operone triptofano contiene i geni strutturali per cinque proteine della via biosintetica del triptofano, oltre all’operone e alle sequenze regolatrici che si trovano prima dell’operone. La sequenza leader codifica un polipeptide contenente codoni triptofano ripetuti in tandem vicino alla sua estremità terminale e operante come attenuatore. Se nella cellula il triptofano è abbondante, il peptide leader verrà sintetizzato; se invece è scarso, il peptide leader, che è ricco di triptofano, non sarà prodotto. La sintesi del peptide leader determina la terminazione della trascrizione del restante operone trp, che comprende i geni strutturali per gli enzimi biosintetici. Se la sintesi del peptide leader è invece bloccata per carenza di triptofano, la trascrizione della restante parte dell’operone potrà aver luogo. Tutto ciò avviene perché nelle cellule procariotiche i processi di traduzione e trascrizione avvengono simultaneamente: mentre la trascrizione di regioni a valle è ancora in corso, è già iniziata la traduzione delle regioni trascritte. L’RNA polimerasi blocca la trascrizione perché una parte dell’mRNA neosintetizzato si ripiega a formare un’ansa a doppia elica seguita da una sequenza di gracili che segnalano all’RNA polimerasi di cessare l’attività. Se il trp è presente in abbondanza, il ribosoma potrà tradurre la sequenza del peptide leader fino al codone di stop. La restante sequenza di RNA leader potrà assumere una configurazione ansa-stelo, che costituirà un sito di pausa della trascrizione. Poi, trovandosi a valle di questa sequenza un tratto ricconi gracile, si avrà la terminazione. Se invece il trp è scarso, il ribosoma rallenterà in corrispondenza del codone trp; la sosta del ribosoma in questa posizione permetterà la formazione di una struttura ansa-stelo alternativa. Questa strutturanonè un segnale di terminazione e previene efficacemente la formazione del vero terminatore. L’RNA polimerasi oltrepasserà poi il sito di terminazione che non si è correttamente ripiegato e inizierà la trascrizione dei geni strutturali del trp. L’attenuazione ha luogo in E. coli anche nelle vie biosintetiche dell’istidina, della fenilalanina e di altri aminoacidi e metaboliti essenziali. Quindi l’operone trp è un sistema reprimibile: in assenza di trp si ha l’espressione; in presenza di trp il repressore è attivo e si ha assenza di espressione. Anche in alcuni batteri Gram+, come Bacillus, l’attenuazione è adottata per regolare gli operoni deputati alla biosintesi di alcuni aminoacidi. Come nei batteri Gram-, il meccanismo determina attenuazione della trascrizione e formazione di strutture secondarie alternative, che in una determinata configurazione provocano la terminazione. I meccanismi sono però traduzione-

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indipendenti e si basano non sulla capacità del ribosoma di procedere o meno alla traduzione, ma sull’interazione di una specifica proteina con l’RNA.

REPRESSIONE DA CATABOLITA o EFFETTO GLUCOSIONella repressione da catabolita la sintesi di numerosi enzimi, operanti tutti prevalentemente come attività cataboliche, viene inibita quando le cellule crescono in un terreno che contiene una fonte di energia ottimale come il glucosio. In alcuni microrganismi fonti di carbonio diverse dal glucosio determinano questo tipo di repressione. La repressione da catabolita permette al microrganismo di utilizzare inizialmente la fonte di carbonio e di energia più facile da catabolizzare. Questa si basa sul controllo della trascrizione mediato da un attivatore ed è quindi un tipo di controllo positivo. Nel catodi enzimi reprimibili da parte del catabolita, il legame dell’RNA polimerasi al DNA avviene solo quando vi si è legata un’altra proteina, chiamata attivatore proteico del catabolita (CAP). la proteina CAP può legarsi al DNA solo se prima si è legata ad un AMP ciclico. L’AMP ciclico è sintetizzato a partire dall’ATP ad opera della adenilato ciclasi. L’entrata del glucosio nella cellula inibisce la sintesi dell’AMP ciclico e stimola il suo trasporto al di fuori della cellula. Infatti, quando il glucosio viene trasportato all’interno della cellula, il livello di AMP ciclico diminuisce e l’RNA polimerasi non si lega più a quei promotori sensibili a questo tipo di controllo. Quindi, la repressione da catabolita è in realtà dovuta alla mancanza di AMP ciclico nella cellula e può essere superata aggiungendo tale composto al terreno. Finché è presente il glucosio, la repressione da catabolita impedisce l’espressione di tutti gli altri operoni catabolici soggetti a questo elemento di controllo globale. Perché la trascrizione possa avvenire, devono essere rispettate due condizioni:

1. il livello di AMP ciclico deve essere abbastanza elevato, in modo da permettere alla proteina CAP di legarsi al sito di legame per CAP (controllo positivo);2. deve essere presente un induttore come il lattosio, in modo che il repressore del lattosio non blocchi la trascrizione legandosi all’operatore (controllo negativo).

TASSONOMIA MICROBICALa tassonomia è la disciplina che si occupa della classificazione degli organismi e si articola in due suddivisioni: l’identificazione e la nomenclatura. La tassonomia batterica utilizza da sempre l’analisi fenotipica – considerando a che cosa un organismo è simile, il suo metabolismo energetico, i suoi enzimi, ecc – come base per la classificazione. Nella tassonomia batterica classica vengono misurate alcune caratteristiche, e questi tratti sono poi usati per raggruppare i microrganismi nella scala tassonomica, dalla specie al dominio. I parametri ampiamente utilizzati includono diversi aspetti della morfologia, della nutrizione, della fisiologia e dell’habitat. Ad oggi sono conosciute circa 5.000 specie, prevalentemente di importanza clinica e industriale, e ipotizzate circa 1.000.000. Solo lo 0,5% dei microrganismi esistenti sono stati isolati e studiati.

CATABOLISMO E ANABOLISMOIl catabolismo è l’insieme dei processi mediante i quali i microrganismi ottengono energia da substrati organici, creando prodotti finali organici o inorganici. L’anabolismo, invece, sono quei processi attraverso cui i microrganismi riescono a costruire la vasta gamma di sostanze chimiche di cui sono composti (macromolecole e altri composti cellulari) consumando energia. Questa energia è fornita dall’ATP, dal calore, dall’energia chimica, ecc., ottenendo accrescimento e riproduzione.

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CLASSI DI ENZIMICLASSE REAZIONE CATALIZZATA ENZIMA (esempi)LIGASI Unione di due molecole Acetil-CoA sintetasi, DNA ligasi (richiedono energia: ATP)

TRASFERASI Trasferimento di gruppi funzionali, come Acetato chinasi, Alanina deaminasi gruppi acetitici, fosfato, ecc.

IDROLASI Idrolisi (aggiunta di acqua) Lipasi, Glicosidasi

LIASI Rimozione di gruppi funzionali Decarbossilasi, Isocitrato liasi senza idrolisi

ISOMERASI Riorganizzazione molecolare Glucosio-fosfato isomerasi

OSSIDO- Ossido-riduzione in cui ossigeno e Citocromossidasi, RIDUTTASI idrogeno sono acquisiti o eliminati Lattico deidrogenasi

Un coenzima è una piccola molecola non proteica che partecipa ad una reazione catalitica come porzione di un enzima. I coenzimi sono legati debolmente agli enzimi e una singola molecola di coenzima può associarsi a enzimi differenti in momenti diversi durante la crescita. I coenzimi servono da trasportatori intermedi di piccole molecole da un enzima all’altro.La conservazione dell’energia proveniente dalle reazioni chimiche negli organismi viventi coinvolge reazioni di ossido-riduzione (redox). Un’ossidazione prevede l’acquisizione di ossigeno, la perdita di elettroni e di ioni idrogeno; la riduzione, invece, prevede la perdita di ossigeno, l’acquisizione di elettroni e di atomi di idrogeno. Esempi di coenzimi sono:

- NAD (= Nicotinamide-Adenina-Dinucleotide): NAD+ + 2H ↔ NADH + H+

- NADP (= Nicotinamide-Adenina-Dinucleotide-Fosfato): NADP+ + 2H ↔ NADPH + H+

Nella cellula il pool NAD prevale nella forma ossidata e i processi catabolici richiedono dinucleotidi ossidati. Il pool di NADP, invece, prevale nella forma ridotta e i processi anabolici richiedono dinucleotidi ridotti. Una transidrogenasi opera la seguente modificazione:NADP+ + NADH ↔ NADPH + NAD+

PRODUZIONE DI ATPL’energia ricavata da alcune reazioni metaboliche può essere trasformata da ATP a ADP + P. L’aggiunta di P ad una molecola è detta fosforilazione.

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ADP (AdenosinaDiFosfato) + energia + P → ATP (AdenosinaTriFosfato)Meccanismi di fosforilazioneIn aggiunta ai composti fosfati ad alta energia, nella cellula vengono prodotti altri composti ad alta energia che possono conservare l’energia prodotta dalle reazioni esoergoniche. Nella fosforilazione a livello del substrato un fosfato ad alta energia viene aggiunto da un intermediario (substrato) nel catabolismo per l’ADP: C-C-C-P + ADP ↔ C-C-C + ATPNella fosforilazione ossidativa, l’energia viene ricavata dagli elettroni che passano da una serie di accettore (catena di trasporto degli elettroni) e alla fine all’ossigeno (respirazione aerobica) o ad un altro composto inorganico (respirazione anaerobica). Nella fotofosforilazione, l’energia della luce viene catturata dalla clorofilla e gli elettroni passano attraverso una serie di accettori. Il trasferimento degli elettroni è usato per la sintesi di ATP.

GLICOLISI (o via EM = Embdem-Meyerhof)È la via degradativa più comune per la trasformazione del glucosio ad acido piruvico: 1 mole di glucosio → 2 moli di acido piruvico (glucosio + 2ADP + 2NAD+ → 2piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+). È ritrovata nella maggior parte dei microrganismi e procede attraverso:- strada a 6C (glucosio → fruttosio 1,6-difosfato)- strada a 3C (gliceraldeide 3-fosfato → acido piruvico)La glicolisi comporta produzione di energia per fosforilazione a livello del substrato e comprende: - reazioni di energizzazione del glucosio, che richiedono ATP (-2ATP)- reazioni che producono ATP (+4ATP)- reazioni che producono NADH (+2NADH)si ha quindi un bilancio energetico di 2ATP + 2NADH.

FERMENTAZIONEÈ un processo ossidativi nel quale donatore e accettore di elettroni sono entrambi composti organici. I donatori di H sono solo sostanze organiche come: disaccaridi (lattosio, saccarosio, ecc); pentosi (arabinosio, xilosio, ecc); esosi (glucosio, fruttosio, ecc); polisaccaridi (amido, cellulosa, pectina, ecc); polialcoli (glicerolo, mannitolo, ecc); aminoacidi. Gli idrocarburi non sono utilizzati perché sono composti organici fortemente ridotti.Gli accettore di H sono molecole organiche e, di solito, sono quelli prodotti dalla reazione, come etanolo, acido lattico, ecc.I prodotti finali hanno lo stesso stato di ossidazione del substrato di partenza e sono numerosi.

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L’energia è rappresentata dal NAD, che è l’unico trasportatore di elettroni, e dall’ATP, chesi forma solo per fosforilazione a livello del substrato.I principali tipi di fermentazione sono:Fermentazione Prodotti della fermentazione Microrganismi più rappresentativiAlcolica Alcol etilico, CO2 LievitiLattica A. lattico Streptococchi, LattobacilliPropionica A. propionico, a. acetico,

a. succinico, CO2 Propionibacterium

Formica A. lattico, a. acetico, a. succinico, a. formico o CO2, etanolo

Batteri enterici: Escherichia, Salmonella, Shigella

Eterolattica A. lattico, etanolo, CO2 LeuconostocVia Entner-Doudoroff A. piruvico, etanolo, CO2 Pseudomonas

TRASFORMAZIONE METABOLICA DELL’ACIDO PIRUVICOClostridium → A. butirrico; Alcool butilico; Acetone; Alcool isopropilico; CO2 Saccharomyces → Alcool etilico; CO2 E. coli → CO2; H2; A. acetico; A. lattico; A. succinico; Alcool etilicoEnterobacter → CO2; H2; A. formico; A. etilico; A. lattico; Glicole butilenicoLactobacillus e Streptococcus → A. latticoPropionobacterium → A. propionico; A. acetico; CO2; H2

Esempi di processi omofermentativi- Fermentazione alcolica (lieviti, miceti, raramente batteri):

2Piruvato ------→ 2Acetaldeide -----→ 2Etanolo- Fermentazione lattica (Streptococchi, Miceti, Lattobacilli, Bacillus):

2Piruvato ------→ 2Acido lattico

RESPIRAZIONEQuesto processo interessa i batteri aerobi obbligati e facoltativi. È un processo ossidativi completo (mineralizzazione) in presenza di un accettore esterno di elettroni (O2), comprendente tre stadi:

1. formazione ossidativa dell’acetil-CoA da piruvato (ac. grassi e aminoacidi)2. degradazione di residui acetitici (ciclo TCA)3. riossidazione del NADH e trasporto elettroni (catena respiratoria)

I donatori di H sono substrati organici o inorganici come glucosio, lattosio, H2, NH3, NO2-, Fe2+,

H2S, ecc. L’accettore di H è un composto inorganico (O2). I coenzimi coinvolti sono NAD, FAD, chinoni, ferro-zolfo proteine, citocromi. I prodotti finali sono CO2 + H2O. L’energia è ricavata dall’ATP che si forma per fosforilazione a livello del substrato e attraverso la catena respiratoria.

OSSIDAZIONE DEL PIRUVATO (PR)Il piruvato occupa un posto importante nel metabolismo intermedio. La maggior parte del piruvato che si forma nel catabolismo è ossidato ad Acetil-CoA, nei seguenti modi:• Batteri aerobi: enzima: piruvato deidrogenasi (E1, E2, E3) Piruvato + CoA + NAD → Acetil-CoA + 2FdH + CO2 • Batteri anaerobi: enzima: piruvato-ferridossina ossidoriduttasi Piruvato + CoA + 2Fd → Acetil-CoA + 2FdH + CO2

• Enterobatteri e vari batteri fototrofi: enzima: piruvato-formiato liasi Piruvato + CoA → Acetil-CoA + Formiato• Lieviti e alcuni batteri: enzima: piruvato decarbossilasi Piruvato → Acetaldeide + CO2

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CICLO DI KREBS (Ciclo Acidi Tricarbossilici, TCA)Prevede la degradazione dell’Acetil-CoA (2C). Coinvolge una serie di reazioni enzimatiche (reazioni di condensazione, isomerizzazione, decarbossilazione) in grado di determinare un andamento ciclico: INTERMEDI Atomi di C→ citrato → cis-aconitato → isocitrato → 6→ ossalsuccinato → α-chetoglucarato → 5→ succinato → fumarato → malato → ossalacetato → 4Per ogni molecola di piruvato si producono: 3 CO2

4 NADH2 → 12 ATP1 FADH2 → 2 ATP1 GTP → 1 ATPtotale: 15 ATP

CATENA RESPIRATORIAÈ il sistema di trasporto degli elettroni, detto anche sistema citocromico.La sua funzione è quella di accettare gli elettroni dai composti ridotti e trasferirli all’ossigeno per la formazione di acqua. Durante il trasporto degli elettroni si ha la riossidazione del NADH. Gli enzimi che ne fanno parte sono:

a. Deidrogenasi: enzimi provvisti di gruppi prostetici (coenzimi) come: NicotinAmmide (NAD); NicotinAmmide Fosfato (NADP); FlavinDinucleotide (FAD); FlavinMonoNucleotide (FMN); CoenzimaQ o Ubichinone (CoQ).b. Citocromi: enzimi provvisti di gruppi prostetici (eme) come: cyt a; cyt a3; cyt b; cyt c; cyt c1.c. Ferro-zolfo proteine (non eme).

N.B. I coenzimi trasportano 2H+ e 2e-, mentre i gruppi eme trasportano solo e-.

FERMENTAZIONE RESPIRAZIONE- Glicolisi (glucosio → 2 piruvato) - Glicolisi (glucosio → 2 piruvato) + 2 ATP + 2 ATP- Processo fermentativo (piruvato → prodotto finale) - Ciclo di Krebs (piruvato → CO2 + H2O) + 30 ATP - Catena respiratoria + 6 ATP

TOTALE: + 2 ATP + 38 ATP

Modello chemiosmotico di MitchellIl protone liberato dall’ossidazione del NADH è trasferito attraverso la membrana al mezzo esterno. Il relativo elettrone è trasferito da un ferro portatore non eme al coenzima Q-H, che prende un altro protone ed elettrone. Gli elettroni terminano nel sistema citocromo, dove sono eventualmente accettati dall’ossigeno per formare l’acqua. I protoni esterni rientrano nella cellula attraverso un canale protonico dove, usando la forza di eccitazione protonica generata dalla differenza di pH e dalla differenza di potenziale elettronico, una ATPasi converte l’ADP + P ad ATP.

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Le ATPasi di membrana sono costituite da una parte rivolta verso l’esterno (F1), che comprende 5 polipeptidi (α, β, γ, δ, ε), e da una parte che si trova inserita nella membrana (F0), che comprende 3 polipeptidi (a, b, c). Il flusso di protoni è: verso l’interno ATP e verso l’esterno ADP.

FIGURA DELLE DISPENSE

RESPIRAZIONE ANAEROBICAQuesto processo interessa i batteri anaerobi obbligati e facoltativi. È un processo ossidativi che ha luogo in presenza di un accettore esterno di elettroni (diverso dall’ossigeno, ma sempre un composto inorganico) costituito da un composto inorganico ossidato. I prodotti finali sono più ossidati del substrato di partenza che funge da donatore di elettroni. I citocromi esplicano la loro funzione in assenza di ossigeno. Nella catena respiratoria sono perlopiù presenti metallo-proteine (Fe-Mo-proteine; S-proteine). I donatori di H sono substrati organici (es. prodotti di fermentazione) e inorganici. L’accettore finale può essere o inorganico (diverso dall’ossigeno) o organico (diverso dal substrato). Ad esempio un accettore è il NO3

- che si modifica in NO2-, NO oppure N2 in

Pseudomonas e Bacillus (aerobi facoltativi); il SO42- si modifica in S2- in Clostridium (anaerobi

obbligati); il fumarato si modifica in succinato in E. coli. L’energia è ricavata dall’ATP che si forma per fosforilazione a livello del substrato e attraverso la fosforilazione ossidativi (catena respiratoria modificata rispetto a quella aerobia, ma con rese energetiche minori). Esempi di respirazione anaerobica sono:Molecole accettrici di e- Prodotti ridotti Microrganismi rappresentativiNitrati (NO3

-) Nitriti (NO2-); Ossido di azoto

(NO); Azoto (N2)Pseudomonas e Bacillus

Solfati (SO42-) Idrogeno solforato (H2S) Clostridium

Anidride carbonica (CO2) Metano (CH4) MethanobacterFumarato Succinato Streptococcus faecalis

TOSSICITA’ DELL’OSSIGENOL’ossigeno è un potente ossidante e un eccellente accettore di elettroni nel processo di respirazione. Nel suo normale stato di base l’ossigeno è definito ossigeno tripletto (3O2), mentre in una delle sue principali forme tossiche è detto ossigeno singoletto (1O2). In quest’ultima forma, caratterizzata da una maggiore energia, gli elettroni del guscio esterno che circonda il nucleo diventano altamente reattivi e sono capaci di partecipare, all’interno della cellula, a diverse ossidazioni spontanee e non programmate. L’ossigeno singoletto viene prodotto attraverso reazioni fitochimiche e biochimiche, queste ultime mediante l’azione di diversi enzimi perossidasici. Gli organismi che entrano frequentemente in contatto con l’ossigeno singoletto, quali i batteri aerobi e i microrganismi fototrofi, contengono spesso dei pigmenti detti carotenoidi la cui funzione è di contrastare gli effetti tossici dell’ossigeno singoletto convertendolo in forme non tossiche. Altre forme altamente tossiche dell’ossigeno sono l’anione superossido (O2

-), il perossido di idrogeno (H2O2) e il radicale ossidrile (OH-),le quali si formano durante la respirazione come prodotti secondari della riduzione dell’O2 a

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H2O. Le flavoproteine, i chinoni, i tioli e le proteine ferro-zolfo, sono tutti composti in grado di trasferire un e- all’O2, questo si ossida e si ha la formazione di H2O2 e O2

-. L’anione superossido è altamente reattivo e può ossidare tutti i composti organici della cellula. Il radicale ossidrile è il più reattivo degli intermedi tossici dell’ossigeno e può, come il superossido, ossidare istantaneamente qualsiasi sostanza organica presente nella cellula. Tuttavia, questo è una specie transitoria poiché la principale fonte sono le radiazioni ionizzanti, alle quali la maggior parte delle cellule non sono esposte. Batteri aerobi e anaerobi facoltativi impediscono l’accumulo di O2

- mediante l’enzima superossido dismutasi: 2 O2

- + 2H+ → O2 + H2O2. gli enzimi come la catalasi e la perossidasi, invece, decompongono il H2O2: 2 H2O2 → 2 H2O + O2 (catalasi) H2O2 + NADH + H+ → 2 H2O + NAD+ (perossidasi)I batteri anaerobi obbligati muoiono se a contatto con l’ossigeno perché non hanno gli enzimi necessari per degradare il perossido e il superossido.

Batteri Superossido dismutasi CatalasiAerobi e anaerobi facoltativies. Pseudomonas spp, E. coli

+ +

Aerotolleranties. Streptococcus faecalis

+ -

Anaerobi stretties. Clostridium spp

- -

spp = varie specie del genere

IMMUNITA’Serie di reazioni complesse rivolte verso elementi estranei all’organismo (non self), viventi e non viventi, deputate alla difesa dell’organismo. Il sistema immunitario ha, infatti, il compito di discriminare il self dal non self. Mediante le reazioni immunitarie l’organismo è in grado di:

- riconoscere elementi estranei (in base alla conformazione stereochimica);- discriminare self dal non self (tra le centinaia di migliaia di forme possibili);- reagire specificatamente con le strutture estranee (mediante produzione di sostanze con affinità chimica per tali strutture);- conservare la memoria del primo contatto: immunità naturale e immunità acquisita.

L’immunità naturale può essere distinta in passiva, cioè quando gli anticorpi passano attraverso la placenta, e attiva, cioè quando gli anticorpi vengono sintetizzati a seguito dell’infezione.L’immunità acquisita è sempre distinta in passiva e attiva: passiva quando gli anticorpi vengono introdotti mediante l’iniezione di un siero; attiva quando gli anticorpi vengono sintetizzati mediante introduzione di un vaccino.Le difese esterne e primarie dell’ospite sono la cute, l’apparato respiratorio e il tratto intestinale.Un batterio si dice invasivo quando supera connettivo e mucose, attraversa le vie linfatiche e ematiche. Si parla infatti di batteriemia quando c’è presenza di un batterio nel sangue e viene portato in circolo. Se poi il batterio non risente dei fattori dell’immunità umorale e riesce a moltiplicarsi siparla di setticemia.

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COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMII microrganismi sono organismi ad organizzazione unicellulare. È un gruppo molto eterogeneo (Miceti, Alghe, Protozoi, Batteri, ecc) e molto rappresentati in natura. Quando si parla di microrganismi si fa riferimento ad organizzazioni cellulari di tipo Procaritico (Eubatteri e Archeobatteri) o Eucariotico (Alghe, Miceti e Protozoi). Troviamo organismi patogeni negli Eubatteri, Miceti e Protozoi, ma non li troviamo mai nelle Alghe e Archeobatteri.I microrganismi hanno la capacità di moltiplicarsi in vitro se posti in appositi terreni di coltura. La popolazione cellulare che si origina è denominata coltura microbica. Un terreno è una soluzione contenente nutrienti in grado di far sopravvivere e moltiplicare i microrganismi. Una coltura è un insieme di cellule che si ottiene in laboratorio. La coltivazione è una condizione artificiale che richiede fattori chimici, come sostanze nutritive, e fattori fisici, come pH idoneo, To idonea, tenore ossigeno/anidride carbonica - anaerobiosi, concentrazione ionica, ecc. Gli enzimi dei microrganismi che stiamo coltivando devono avere un valore di pH idoneo altrimenti o la loro attività viene rallentata o cessa. Per aggiustare il pH si aggiunge o una base o un acido diluiti. Di solito si aggiungono dei sistemi tampone (di solito sono sistemi fosfato). La To ottimale è 37-38°C, ma qualche volta è necessario arrivare a 40°C. Alcuni ioni (Na+, K+, H+) facilitano gli scambi di membrana e possono essere presenti anche a basse quantità. Bisogna garantire una certa isotonicità, cosicché il terreno sia circa uguale a quello all’interno della cellula.Saprofiti: usano materiale organico in decomposizione, ma anche quelli che si trovano sulla

superficie della cute o all’interno dell’intestino, ma non sono patogeno. Il batterio da saprofita può diventare patogeno dopo mutazione.

Patogeni: usano C organicoOpportunisti: sono saprofiti in condizioni normali, ma se trovano un organismo immunodeficienze

per una malattia o perché da chemioterapia ha avuto un calo dell’immunità, diventano patogeni.

COLTUREMiste: contenenti più speciePura: contiene una sola specie (monoclonali, axeniche)

Strisciamento: per ottenere delle colonie isolate su piastra

Almeno in uno dei tre settori ho la certezza di trovare delle colonie isolate, usando solo una piastra.

Quando si fa un conteggio vitale, il campione deve essere correttamente diluito. Possono essere commessi degli errori grossolani, che quindi possono essere corretti. Altre volte, invece, possono essere fatti degli errori casuali, che non possono essere eliminati. È impossibile non commettere errori casuali, ma si possono ridurre facendo più piastre durante diluizione e conteggio e poi fare una media dei risultati. Nel conteggio si contano le piastre con colonie >30 e <300, le altre si scartano. Non si possono prendere poche colonie per il conteggio, perché l’errore diminuisce all’aumentare delle colonie contate.La visualizzazione delle colonie microbiche richiede l’allestimento di idonei preparati da esaminare in microscopia con differenti strumenti e tecniche come, ad esempio: microscopio ottico (campo luminoso e scuro); microscopio a fluorescenza; microscopio elettronico (scansione per le superfici e trasmissione per la struttura).

Allestimento di un preparato: si prende un vetrino porta-oggetti; si mette una goccia di liquido e si mette un vetrino copri-oggetti = preparato a fresco. Si osserva prima al microscopio al 10x per

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mettere a fuoco e poi al 40x. Questo tipo di visione serve per vedere se c’è mobilità (ciglia o flagelli), non essendo stata fatta alcuna colorazione.

A livello della membrana citoplasmatica, la cellula batterica presenta delle cariche negative dovute alla presenza degli acidi nucleici liberi, quindi i coloranti che si usano per impartire una colorazione alle cellule saranno coloranti con carica positiva: sono coloranti basici, in modiche la loro carica positiva viene richiamata dalla carica negativa della membrana. Quando si parla di coloratisi distinguono due gruppi funzionali:

1. cromoforo = nella molecola c’è un gruppo chimico che porta il colore2. auxocromo = il colore può reagire ed attaccarsi alla struttura biologica.

Una molecola che presenta entrambe queste caratteristiche è un colorante.

Corynebacterium diphteriaeI due granuli di poli-meta fosfati, durante la colorazione con blu di metilene, non si colorano in blu come il resto del corpo cellulare, ma quando vengono a contatto con il blu li complessa e si colorano di rosso => fenomeno della metacromasia.

Se nella colorazione si usa un solo colorante questa è una colorazione semplice. Se invece devo colorare dei batteri con forma bastoncellare devo usare una colorazione composta per avere il contrasto delle forme. La colorazione di Gram colora diversamente le pareti dei Gram- da quelle dei Gram+. Il primo colorante che si usa con il metodo di Gram è il cristal-violetto o violetto di genziana fenicato, che è, come tutti i coloranti, una soluzione idroalcalina con aggiunta di fenolo.Alla fine per distinguere i Gram+ dai Gram- si mette il liquido di Gram per 1 minuto, detto anche soluzione di Lougol, che in acqua contiene iodio + ioduro di potassio. Questo liquido agisce solo sui Gram+ perché fissa il colore all’interno della parete ed infatti viene detto anche mordenziante. Si fa quindi il lavaggio del vetrino con etanolo. La colorazione di Gram viene detta anche alcool resistente. Si fa poi una colorazione di contrasto con la fucsina basica che colora le cellule Gram-.

Diplococcus pneumoniaeÈ un Gram+ composto da due cocchi. Ha la caratteristica di avere la capsula, resiste quindi alla fagocitosi, ed è infatti fortemente patogeno.

Neisseria meningitidisÈ un altro diplococco, ma ha un eccezione perché è un Gram- ed è molto pericoloso perché è l’agente eziologico della meningite.

Vibrio coleraeÈ un Gram-, un batterio a virgola. Porta facilmente alla morte perché produce delle tossine altamente tossiche. È una patologia ha controllo internazionale.

I Micobatteri possono provocare patologie gravi a livello dei polmoni e dei reni.

Coltivazione batteri anaerobiPer coltivarli bisogna fare in modo di impedire il contatto dei campioni prelevati con l’ossigeno (produzione di forme tossiche verso se stessi). Quindi il materiale verrà messo in delle provette contenenti tioglicolladio di sodio, una sostanza riducente che viene mescolata con il campione => mezzo di trasporto di Stuart.I terreni di coltura devono avere un basso potenziale redox (Eo = 0 mV), cioè assenzadi ossigeno che si ottiene mettendo nei terreni una grande quantità di sostanze riducenti che possono essere metabolizzate dal microrganismo (zuccheri, carboidrati).

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Per l’esame microscopico diretto bisogna preparare un vetrino a fresco per verificare la mobilità, per ricercare i miceti o i protozoi, e un preparato fissato e colorato per vedere se ci sono batteri e se sono Gram+ o Gram- e quindi per avere un’indicazione sugli esami successivi. Questo esame di solito non è mai risolutivo, ma è un primo approccio. Questo perché riconosce la presenza di un microrganismo, ma non la specie.

Un esame colturale serve per il rilievo della crescita o è finalizzato all’isolamento.

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