Metodologie di analisi di risorse geneticheper il loro utilizzo nel miglioramento

genetico

PolimorfismoDifferenza genetica

relativamente comune inuna popolazione

Nota:Una persona puo’ avere solo

1 o 2 alleli di unparticolare gene.

In una popolazione, cipossono essere molti allelidiversi di un particolare

gene

Polimorfismi del DNAPolimorfismi del DNA

Polimorfismi del DNA = differenzenella sequenza di DNA

Per definizione, in una popolazione ilpolimorfismo è determinato dallapresenza di due o più alleli ad un locuscon frequenza>1%

MARCATORI GENETICI

• MORFOLOGICI: descrittori morfo-bioagronomici

• BIOCHIMICI: isoenzimi, proteine di riserva

• MOLECOLARI: polimorfismi del DNA. Leclassi maggiormente usate per lo studio dellerisorse genetiche sono RAPD, SSR, AFLP

CARATTERISTICHE FAVOREVOLI

• Non influenzati dall’ambiente

• Neutrali

• Stabili

• Numerosi

• Polimorfici (sequenze non codificanti)

• Campioni di qualsiasi tessuto

• Analisi indipendenti da sesso ed età

• Facili da monitorare

• Analisi automatizzabili

AFLP MARKERS.

DNA extraction

DOUBLE

DIGESTION EcoRI e MseI

5’AATTCCAC TCGT 3’

3’GGTG AGCAT 5’

ADAPTORS adaptors (ds) EcoRI 3’ CATCTGACGCATGGTTAA 5’

LIGATION adaptors (ds) MseI 5’TACTCAGGACTCTA 3’

5’AATTCCACN NTCGTTA 3’

3’TTAAGGTGN NAGCAAT 5’

SELECTIVE primer EcoRI “+1” A

PREAMPLIFICATION primer MseI “+1” C

A 5’AATTCCACN NTCGTTA 3’ 3’TTAAGGTGN NAGCAAT 5’ C

5’AATTCCACA GTCGGTTA 3’

3’TTAAGGTGT CAGCAAT 5’

SELECTIVE primer EcoRI “+3” AAC

AMPLIFICATION primer MseI “+3” CAA

AAC

5’AATTCCACNNN NNNTCGGTTA 3’

3’TTAAGGTGNNN NNNAGCAAT 5’

AAC

5’AATTCCACAAC TTGTCGGTTA 3’

3’TTAAGGTGTTG AACAGCCAAT 5’

PRINCIPALI APPLICAZIONI

Studi di Mappatura

Studi di diversità genetica

Loma long

H1

Principali applicazioni : studi di diversità genetica

Scavina 6, due cloni provenienti dall’EcuadorNessuna differenza fenotipica

Analisi microsatellite su Scavina 6

mTc15 mTc8 mTc2 mTc19

Referenceclones

Referenceclones

Referenceclones

Referenceclones

alcuni cloni sono differenti

ANALISI DELLA VARIABILITA’GENETICA

Caratterizzazione di germoplasma

Stima delle relazioni filogenetiche

Fingerprinting varietale

Struttura genetica delle popolazioni

Primer Marker

25 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 18 21

M 260 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

250 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

200 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0

190 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

150 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

N 200 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

190 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

180 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

165 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

160 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

150 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

145 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

140 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

125 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0

115 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0

Q 150 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0

125 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1

65 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0

CAMPIONI

1 114 17L 1 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 18 21

0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0

0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0

0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0

I. Calcolo delle similarità genetiche

II. Costruzione di una matrice di similarità

III. Rappresentazione grafica delle relazioni filogenetiche(costruzione di un dendrogramma)

Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica

Spesso viene valutata la Dissimilarità (o Distanza) Genetica (GD).

GD = 1 indica completa diversità mentre GD = 0 indica completa identità

Indipendentemente dal tipo di coefficiente utilizzato, la Similarità Genetica(GS) rappresenta la quota di marcatori molecolari condivisi tra due individui

messi a confronto

GS = 1 indica completa identità tra i due individui confrontatiGS = 0 indica completa diversità

Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica

Coefficiente di Nei e LiNLxy=2a / (a+b) + (a+c)

a = numero di bande condivise tra gli individui x ed y,

a+b = numero di bande presenti in x,

a+c = numero di bande presenti in y

Y + −

+ a b X − c

Coefficiente di Jaccard

Jxy=a/(a+b+c)

a = numero di bande condivise tra gli individui x ed y,b = numero di bande presenti in x ed assenti in y,c = numero di bande presenti in y ed assenti in x.

Y + −

+ a b X − c

Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica

Coefficiente Simple Matching

SMxy=a+d / (a+d) + (b+c) a+ d= numero di siti condivisi, per presenza o per assenzadi bande tra gli individui x ed y,b + c = numero totale di differenze (polimorfismi) tra iprofili molecolari degli individui x ed y

Y + −

+ a b X − c d

A B C D

Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica

Marcatori dominanti:

NLAB = 4/6 = 0.66

JAB = 2/4 = 0.50

SMAB = 5/7 = 0.71

NLBC = 0/5 = 0

JBC = 0/5 = 0

SMBC = 2/7 = 0. 285

NLxy=2a / (a+b) + (a+c)

Jxy=a/(a+b+c)

SMxy=a+d / (a+d) + (b+c)

Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica

Marcatori co-dominanti:

NLAB = 2/4 = 0.5

JAB = 1/3 = 0.33

A B C D

SMAB = 4/6 = 0. 66

Tali matrici sono necessarie per condurre le analisi di raggruppamentoattraverso la costruzione dei dendrogrammi

Coefficienti di SimilaritCoefficienti di Similaritàà Genetica Genetica

Matrici di similarità/dissimilarità

A B C D E F G A / 0,957 0,942 0,941 0,923 0,914 0,897 B 0,044 / 0,940 0,947 0,918 0,898 0,888 C 0,060 0,062 / 0,937 0,911 0,897 0,879 D 0,061 0,055 0,066 / 0,907 0,889 0,877 E 0,081 0,085 0,093 0,098 / 0,963 0,945 F 0,090 0,108 0,108 0,117 0,038 / 0,954 G 0,109 0,119 0,129 0,131 0,057 0,047 /

Costruzione di un dendrogramma mediante l’utilizzo del metodoUPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)

Primo ciclo

Secondo ciclo

A B C D E B 0,8 C 0,6 0,6 D 0,4 0,4 0,4 E 0,4 0,4 0,4 0,6 F 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

A,B C D E C 0,6

D 0,4 0,4

E 0,4 0,4 0,6 F 0,2 0,2 0,2 0,2

Costruzione di un dendrogramma mediante l’utilizzo del metodoUPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)

A,B C D,E C 0,6 D,E 0,4 0,4 F 0,2 0,2 0,2

AB,C D,E D,E 0,4

F 0,2 0,2

Terzo ciclo

Quarto ciclo

Costruzione di un dendrogramma mediante l’utilizzo del metodoUPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)

ABC,DE F 0,2

Ultimo ciclo

Esempio

A B C D E B 0,70 C 0,75 0,65 D 0,64 0,60 0,64 E 0,67 0,60 0,67 0,72

Punto debole del metodo UPGMA

Studi di diversità genetica: elaborazione di dendrogrammi di distanzegenetiche intra ed interspecifiche

Principali applicazioni: studi di mappatura genica

– Mappe fisiche: utili per la conoscenzadella sequenza nucleotidica del DNA

– Mappe Comparative: utili per lo studiodi regioni cromosomiche coinvolte nelcontrollo di geni di interesse agronomico;per lo studio di regioni regolatorie