METODI METODI DIDDIIDICAMPIONAMENTO … · Tossine biologiche Screening di zone molto piccole...

METODI METODI METODI METODI DIDIDIDI CAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTONEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO NEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO NEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO NEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO

AMBIENTALE IN AMBIENTALE IN AMBIENTALE IN AMBIENTALE IN ANIMAL FACILITYANIMAL FACILITYANIMAL FACILITYANIMAL FACILITY

Dott.ssa Piera Anna MartinoDott.ssa Piera Anna MartinoDott.ssa Piera Anna MartinoDott.ssa Piera Anna MartinoDIPAV, Sezione di Microbiologia e Immunologia Veterinaria

Facoltà di Medicina VeterinariaUniversità degli Studi di Milano

Siena, 16 settembre 2011

Il monitoraggio microbiologico all’internodi una animal facility è molto importante e, in

genere, è associato al controllo dello stato sanitario degli animali stabulati

superficiariaacqua

SUPERFICISUPERFICISUPERFICISUPERFICI

CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI

Permette di determinare o confermare la presenza di agenti biologiciÈ fondamentale come supporto

All’attività di monitoraggio sanitarioNella determinazione dell’ampiezza della contaminazioneNella valutazione dell’attività di disinfezione


Il campionamento necessita La scelta di una porzione della superficie da indagare

Superfici non porose (plastica, metallo, acciaio, …)La scelta di uno strumento efficace per la raccolta dei contaminanti microbici

Fase di indagineTipologia dell’agenteDimensione e tipologia della/e superficie/iLimiti del metodo di campionamento


Gli elementi essenziali per ottenere un campionamento “di successo” includono:

Personale adeguatamente istruitoStrategia di campionamento

Definizione degli obiettiviScelta del numero e dei tipi di campioni ambientali da raccogliereScelta dei terreni colturali

Laboratorio qualificato di sostegnoControllo di qualità


In ogni procedura sperimentale di campionamento di agenti biologici dovranno essere utilizzati

Materiali steriliPre-sterilizzati in autoclave o irradiati

Tecniche di asepsiGarantiscono un campione significativo


Tre possibili fasi del campionamento delle superfici:1. Fase di screening iniziale2. Fase di caratterizzazione/identificazione3. Fase di pulizia e controllo post-disinfezione


1. Fase di screening inizialeCampionamento qualitativoPresenza o assenza del microrganismo/i nell’ambienteScelta di punti sicuramente o molto probabilmente contaminati

Porzioni di filtri di ventilazione/condizionamentoAttenzione alle dimensioni del campione

Fase rapida


2. Fase di caratterizzazione/identificazioneCampionamento quantitativoImportanza dell’area campionata in quanto i risultati sono riportati come concentrazione/areaPermette di identificare le potenzialità dell’infezione, le possibili vie di diffusioneIdentifica le zone da decontaminare/disinfettareFase più indaginosa


3. Fase di pulizia e controllo post-disinfezionePermette di controllare l’efficacia delle procedure di disinfezione

Riduzione del numero dei microrganismi ~0 UFC o al limite dello strumento/metodo utilizzato

Tre possibilità di campionamento:Più campioni per avere un’area maggioreZone raggiungibili dal trattamentoZone “difficili” da raggiungere

Attenzione alla presenza di residui di disinfettantiUso di terreni con neutralizzanti

MA QUALI AGENTI BIOLOGICIMA QUALI AGENTI BIOLOGICIMA QUALI AGENTI BIOLOGICIMA QUALI AGENTI BIOLOGICISONO DA RICERCARE NELLSONO DA RICERCARE NELLSONO DA RICERCARE NELLSONO DA RICERCARE NELL’’’’AMBIENTE?AMBIENTE?AMBIENTE?AMBIENTE?

MEDCHROME.COM

GLI STRUMENTI A DISPOSIZIONEGLI STRUMENTI A DISPOSIZIONEGLI STRUMENTI A DISPOSIZIONEGLI STRUMENTI A DISPOSIZIONE

salviette/spugnettesalviette/spugnettesalviette/spugnettesalviette/spugnette

tamponitamponitamponitamponi

piastre a contattopiastre a contattopiastre a contattopiastre a contatto

LE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHE

BatteriVirusTossine biologiche

Screening di piccole zone

Valutazione della contaminazione

Valutazione efficacia della decontaminazione

Campionamento di un’area piccola

Solo per superfici non porose

Garze/spugne sterili 5 x 5 cm

Inumidire con soluzione sterile

Campionamento mediante sagoma o su un’area ben definita

SPUGNETTE

Agenti biologici

UsiTargetDescrizioneTipo di campione


BatteriVirusTossine biologiche

Screening di zone molto piccole

Valutazione della contaminazione di punti critici


Campionamento di un’area molto piccola

Solo per superfici non porose, angoli e piccole fessure

Tamponi sterili singoli

Inumiditi con soluzione sterile o in terreno di trasporto

Campionamento di un’area ben definita

TAMPONE

Agenti biologici


www.skcinc.comwww.biocontrolsys.com


BatteriScreening di zone piccole

Valutazione della contaminazione


Campionamento di un’area piccola

Solo per superfici non porose

Raccolta del campione mediante pressione della piastra sulla superficie identificata

PIASTRE A CONTATTO

Agenti biologici


• Non usare su superfici molto contaminate• Breve shelf-life• Scelta del terreno colturale

PBIPBIPBIPBI

DA RICORDAREDA RICORDAREDA RICORDAREDA RICORDARE

È importante che durante la conservazione e il trasporto i campioni siano mantenuti refrigerati e inviati al laboratorio il più rapidamente possibile

Il laboratorio processerà altrettanto celermente i campioni

Uso di metodi analitici validati perché i risultatisiano ripetibili, riproducibili e confrontabili

ARIAARIAARIAARIA

CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIA

Permette di raccogliere e valutare la concentrazione e la composizione di agenti biologici aerosolizzatiAttenzione alla caratteristica dei bioaerosol di sedimentare e ridisperdersi per movimenti dell’ariaLimitazioni legate al posizionamento e al tempo di campionamento (collection time) dello strumento utilizzato

Risultati negativiRisultati negativiRisultati negativiRisultati negativi indicano solo che un determinato agente non è presente in un certo sito in concentrazioni evidenziabili al momento del campionamentoRaccolta di più campioni nel tempo

CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIA

1. Campionamento passivo2. Campionamento attivo

“impattatori”/aspiratorifiltrazione

CAMPIONAMENTO PASSIVO DELLCAMPIONAMENTO PASSIVO DELLCAMPIONAMENTO PASSIVO DELLCAMPIONAMENTO PASSIVO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIA

Passivo o Passivo o Passivo o Passivo o deposizionaledeposizionaledeposizionaledeposizionaleDeposizione per via gravitazionale delle bioparticellesu una superficie

Poco costoso e facile da eseguireCampionamento non quantitativo

Volume raccolto sconosciutoParticelle più grandi si depositano prima e in maggior numero rispetto alle piccole

CAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIASistema a compressioneSistema a compressioneSistema a compressioneSistema a compressione

Campionamento forzato di aria su una superficie solida o liquida mantenendo i microrganismi aerogeni vitali o fisicamente inalteratiMetodo Metodo Metodo Metodo ““““a compressionea compressionea compressionea compressione””””

Microrganismi superficie solida o semisolidaL’aria viene aspirata e convogliata, attraverso fori circolari o ugelli, direttamente

Terreno agarizzatoAgar-sangue, TSA, R2A

Superficie adesiva

PBI InternationalPBI InternationalPBI InternationalPBI International

per batteri …

per funghi …

Campionamento forzato di aria attraverso una membrana filtranteEfficienza di raccolta legata

Alle dimensioni delle particelleAlle proprietà fisiche delle particelleAlle forze inerziali ed elettrostaticheAlle caratteristiche del campionatore

Vengono raccolte le particelle più piccole del diametro dei pori del filtro

CAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIASistema per filtrazioneSistema per filtrazioneSistema per filtrazioneSistema per filtrazione

Diverse tipologie di filtri ma attenzione alla disidratazione del campione sul filtro

Membrane in gelatina SartoriusMembrane in gelatina Sartorius

ACQUAACQUAACQUAACQUA

CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUA

Drinking waterAmpio range di microrganismi

Coliformi, E. coli, Campylobacter, virusLimite legato al bassissimo numero di organismi presenti nell’acqua di bevandaProcedure microbiologiche basate su:

Concentrazione/arricchimento del campioneIsolamento microrganismiQuantificazione (UFC/mL)

CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUA

Crescita su terreni selettivi/UFC

Colture cellulari/CPE/unitàformanti placca

Identificazione/conta

Filtrazione su membranaAdsorbimento/eluizioneConcentrazione

BATTERIVIRUS

MICRORGANISMIMICRORGANISMIMICRORGANISMIMICRORGANISMI

METODIMETODIMETODIMETODI

Necessità di un approccio multi-steps

CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUACONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONE

BATTERIFiltri con diametro 47 mm e pori da 0.22 a 0.45 µmSemina su terreni solidi o liquidi

Importante fare più repliche per ottenere una conta piùprobabile

CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUACONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONE

Uso di tecniche di pre-arricchimento e arricchimento per alcuni batteri

IN ITALIAIN ITALIAIN ITALIAIN ITALIA

Per l’acqua di bevanda (in bottiglia) i parametri sono:

Escherichia coli 0/250 mLEnterococchi 0/250 mLPseudomonas aeruginosa 0/250 mLConta a 22 °C 100/mLConta a 37 °C 20/mL

CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUACONCENTRAZIONE E CONTACONCENTRAZIONE E CONTACONCENTRAZIONE E CONTACONCENTRAZIONE E CONTA

VIRUSAdsorbimento ed eluizione su filtroUso di filtri in polisulfonato (0.02 µm)Presenza/assenza (TC)Tecnica delle placche

Metodi classici Sensibili ma indaginosi nella caratterizzazione dei microrganismiLegati al volume di campione

Metodi molecolariSensibili ed affidabiliNon discriminano tra microrganismi vivi e “morti”Non permettono di valutare la patogenicità

LIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICILIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICILIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICILIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICI

Metodi standardizzati disponibili International Organization of Standardization (ISO)European Committee for Standardisation (CEN)American Public Health Association (APHA)French Standard (NF)In continua revisione e aggiornamento

STANDARDIZZAZIONE DEI METODISTANDARDIZZAZIONE DEI METODISTANDARDIZZAZIONE DEI METODISTANDARDIZZAZIONE DEI METODI

ISOISOISOISO

QUINDI QUINDI QUINDI QUINDI …………

CAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOSIGNIFICATIVOSIGNIFICATIVOSIGNIFICATIVOSIGNIFICATIVO

OBIETTIVI STRUMENTI

CONOSCENZADELLA PROPRIA

STRUTTURA

GRAZIE PER LGRAZIE PER LGRAZIE PER LGRAZIE PER L’’’’ATTENZIONEATTENZIONEATTENZIONEATTENZIONE

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