MUTAGENESI MIRATA E MANIPOLAZIONE DELLE PROTEINE

SPESSO LE PROPRIETA’ FISICHE E CHIMICHE DELLE PROTEINE “NATURALI” NON SONO ADATTE ALL’APPLICAZIONE DI TIPO INDUSTRIALE

LA MUTAGENESI CONVENZIONALE E GLI SCHEMI DI SELEZIONE POSSONO SERVIRE A CREARE UNA FORMA MUTANTE DI UN GENE CHE CODIFICA UNA PROTEINA AVENTE LE PROPRIETA’ DESIDERATE

MUTAGENESI MIRATA E MANIPOLAZIONE DELLE PROTEINE

APPLICANDO UN INSIEME DI TECNICHE CHE CAMBIANO IN MODO SPECIFICO GLI AMINOACIDI CODIFICATI DAL GENE CLONATO E’ POSSIBILE CREARE PROTEINE LE CUI PROPRIETA’ SI POSSONO ADATTARE MEGLIO ALLE APPLICAZIONI INDUSTRIALI E TERAPEUTICHE RISPETTO ALLE SOSTANZE OMOLOGHE NATURALI

MUTAGENESI MIRATA E MANIPOLAZIONE DELLE PROTEINE

ESEMPI: Alterazioni della resistenza al calore e/o

la stabilità al pH Modificazione del co-fattore metallico

necessario Aumento della resistenza nei confronti

delle proteasi cellulari

INGEGNERIA PROTEICA

ALCUNE STRATEGIE BASATE SULLA MUTAGENESI MIRATA DEGLI

OLIGONUCLEOTIDI PER MODIFICARE:

TERMOSTABILITA’

ATTIVITA’ ENZIMATICA

SPECIFICITA’ ENZIMATICA

MUTAGENESI MIRATA DEGLI MUTAGENESI MIRATA DEGLI OLIGONULEOTIDI CON DNA PLASMIDICOOLIGONULEOTIDI CON DNA PLASMIDICO

Inserimento Inserimento del DNA del DNA bersaglio in bersaglio in un sito di un sito di clonazione clonazione multiplo nel multiplo nel vettore vettore plasmidico plasmidico pALTERpALTER

MUTAGENESI MIRATA DELGLI MUTAGENESI MIRATA DELGLI OLIGONULEOTIDI CON DNA PALSMIDICOOLIGONULEOTIDI CON DNA PALSMIDICO

I)I) Trasformazione Trasformazione in in E. coliE. coli e e denaturazione denaturazione con alcalicon alcali

TetS

MUTAGENESI MIRATA DELGLI MUTAGENESI MIRATA DELGLI OLIGONULEOTIDI CON DNA PALSMIDICOOLIGONULEOTIDI CON DNA PALSMIDICO

II) II) Trasformazione in Trasformazione in E. E. colicoli e selezione e selezione

III)III) Identificazione delle Identificazione delle cellule (90%) in cellule (90%) in possesso della possesso della mutazione specificata mutazione specificata nel gene bersaglio nel gene bersaglio (ibridazione del DNA)(ibridazione del DNA)

TetS

TERMOSTABILITA’ DI UNA PROTEINA

TEMPERATURA ALLA QUALE LA STRUTTURA COMPLESSIVA

DELLA PROTEINA VIENE DENATURATA AL 50%

AUMENTO DELLA TERMOSTABILITA’

IMPEDIRE ALLA MOLECOLA DI PERDERE IL SUO RIPIEGAMENTO AD

ALTE TEMPERATURA

AGGIUNTA DEI LEGAMI DISOLFURO (MUTAGENESI MIRATA DEGLI OLIGONUCLEOTIDI

INTRODUZIONE DI NUOVI LEGAMI DI SOLFURO INTERNI)

LE PROPRIETA’ DEL LISOZIMA T4 E DI SEI VARIANTI MANIPOLATE GENETICAMENTE

Mutati in cisteinacisteina vari residui aminoacidici, testate: Termostabilità Attività enzimatica

AUMENTO DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

RIDUZIONE DEL NUMERO DEI RESIDUI SOLFIDRILE LIBERI

ES: INTERFERONE INTERFERONE UMANOUMANOMUTAGENESI MIRATA DEGLI

OLIGONUCLEOTIDI

TRASFORMAZIONE DI UN CODONE DELLA CISTEINA IN CODONE DELLA

SERINA

POSIZIONE DEI RESIDUI DI CISTEINA E POSIZIONE DEI RESIDUI DI CISTEINA E DEI LEGAMI DISOLFURO DI DEI LEGAMI DISOLFURO DI

IFNIFN E IFN E IFN

Ser 17 (VARIANTE ATTIVA)Ser 17 (VARIANTE ATTIVA)

AUMENTO DELLA SPECIFICITA’ ENZIMATICA

MUTAGENESI MIRATA DEGLI OLIGONUCLEOTIDI

ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO (tPA)

STABILITA’ E ATTIVITA’ DI VARIE STABILITA’ E ATTIVITA’ DI VARIE VERSIONI MODIFICATE DI tPAVERSIONI MODIFICATE DI tPA

VARIANTE

tPA

MODIFICAZIONI SPECIFICITA’

1. Thr (103)---Asn Permanenza nel plasma di coniglio di circa 10 volte più a lungo della forma nativa

2. LysHisArgArg(296-299)---AlaAlaAlaAla

Enzima più specifico per la fibrina rispetto alla forma nativa

3. Asn(117)---Gln Attività fibrinolitica tipica della forma nativa