1

Biologia dei biofilm

aus C. E. Zobell: "The effect o f sur faces on bacterial activity", J. Bacterio l. 46, 39-56 (1943)

...

J. Bacteriol. 25, 277-286 (1933)

BIOFILM

Comunita‘ ben strutturatadi batteri e cellule eucarioticheracchiuse in una matrice polimericaprodotta dalle cellule stesse, e che cresce susuperfici (inerti o „biologiche“), soprattuttoall‘interfaccia con una fase liquida

2

Importanza dei biofilm microbici

• Biofilm come fattore di virulenza: infezioni da biofilm più virulente, più tendenti a cronicizzarsi e più resistenti alle terapie

• Batteri adesi ad una superficie solida o “flocculati” sono utilizzati preferenzialmente in bioreattori industriali e nella depurazione delle acque di scarico

• I biofilm sono ubiquitari

Un caso “reale” di biofilm misto come osservato in microscopia elettronica

3

Adesione Colonizzazione Maturazione

Interazioni fisico-chimiche (idrofobicità, carica elettrica)FlagelloProteine di membrana esterna, parete cellulare, LPS…..

PiliPolisaccaridi (alginato)Fattori di aggregazione cellulare(curli, ecc…)

EPS: produzione/organizzazioneQuorum sensing

La formazione di biofilm è correlata con la coniugazione ed il trasferimento orizzontale

di materiale genetico

Pilus

Due effetti dell’espressione del pilus: consente la coniugazione batterica e stimola la produzione di biofilm

4

Trasferimento genico orizzontale

• Permette di trasferire plasmidi coniugativi, (evtl. con trasposoni annessi) o frammenti cromosomali

• Tra i geni trasmessi, resistenza ad antibiotici ed enzimi di degradazione di sostanze organiche

• Considerato come un’efficiente strategia di adattamento

• L’alta frequenza di coniugazione nei biofilm rappresenta quindi un vantaggio di questa forma di organizzazione cellulare

Biof.

Singlecells

Genomic analysis of biofilm-dependent gene expressionthrough microarray analysis

5

Il numero di geni che si esprime in maniera diversa in singole cellule e nei biofilm comprende una % molto alta del genoma (10-30%).

Tutti coinvolti nella formazione del biofilm?

[O2],Nutr.

Anaerobi,Crescita + lenta

Aerobi,Crescita + veloce

L’eterogeneità di espressione genica riflette anche (soprattutto?)le diverse condizioni fisiologiche dei batteri in un biofilm complesso

6

Quorum sensing: da curiositàevolutiva a processo biologico

globale

Vibrio fischeri

Eurpymna scolopes

Bassa concentrazionecellulare

Alta concentrazionecellulare

Gene target

Molecola segnale

Attivatoretrascrizionale

Molecola segnale

Gene target

Attivatoretrascrizionale

Quorum sensing: espressione genica dipendentedalla concentrazione cellulare

7

La comunicazione intercellulare da quorum sensing è favorita in biofilm piuttosto che in colture liquide

Cultura liquida: 108-109 cfu/ml

Molecole segnale (in Gram negativi): acil-omoserin-lattoni (AHL o HSL)

Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa: Il sistema lasR/lasI e rhlR/rhlI costituiscono una cascata regolativa

C12-HSL

C4-HSL

8

Studi genomici stimano al 5-6% la percentuale di geni regolati da QS

Geni regolati da Quorum Sensing in Pseudomonas aeruginosa

Tre classi funzionali principali: fattori di virulenza, sintesi di EPS, uptake del ferro

Il cluster rhlR/rhlI è così chiamato per il suo ruolo nella biosintesi dei rhamnolipidi

Rhamnolipidi: un esempio di biosurfattanti e i responsabili della“gliding motility”

9

I promotori QS-dipendenti sono spesso co-regolatida meccanismi legati a stimoli ambientali/fisiologici

(sito di legame per LuxR)

Geni quorum sensing-dipendenti determinano la “struttura ordinata”all’interno di un biofilm batterico

10

La biosintesi degli AHL ha come unico scopo la creazione di una molecola segnale

Le proteine regolatrici della famiglia LuxRsono tipici regolatori di risposta

11

12

Il QS è direttamente coinvolto in meccanismi di patogenesi nei mammiferi

Gli induttori (molecole segnale) appartengono a classi chimiche diverse

13

Un caso a sé: gli Streptomyces

S. coelicolor

Streptomiceti/Attinomiceti:Batteri (Gram +) del suolo(30 °C temperatura ottimale di crescita)Organismo multicellulare(Uniche forme monocellulari: spore e protoplasti)Sporigeno (su substrati solidi, spore in circa 7 gg)Crescita come micelio in terreno liquidoPrincipale produttore di antibiotici

Numero di ORF predette

S. coelicolor 7825 E. coli 4289B. subtilis 4099S. cerevisiae 6203

Geni regolatori:

65 fattori sigma

TCRS:85 sensor kinases79 response regulators

“A factor”:

O

O

OH

O

identificato in S. griseusMutanti incapaci di produrre A factor sono Spo-, StrS and Str-

A factor aggiunto esternamente ripristina il fenotipo originario

A factor lega il repressore ArpA, inibendone l’attivitàE’ in grado di agire a concentrazioni nM

Coinvolto nella produzione di numerosi composti antimicrobici

14

O

OO

O H

A factor, S. griseus

O

O O H

O H

O

O O H

O H

O

O O H

O H

O

O O H

O H

O

O O H

O H

O

O O H

O H

S. bikiniensis, S. cyanofuscatus, S. viridochromogenes

S. virginiae

Streptomyces sp. FRI-5

S. bikiniensis, S. cyanofuscatus

S. virginiae

S. virginiae

O

O O H

O H

O

O O H

O H

S. virginiae

S. virginiae

γ-butirrolattoni in Streptomyces

Quorum sensing in batteri Gram +

• Molecole segnale: peptidi (modificati)• Processi biologici regolati da QS:

Coniugazione, virulenza, produzione di enzimi extracellulari, adesione cellulare, formazione di biofilmCompetenzaProduzione di peptidi antimicrobici

15

Peptidi segnale (auto-induttori) in batteri Gram positivi

Sistemi agr e com: una struttura comune

agrD(virulenza in S. aureus)

comX(competenza in B. subtilis)

16

Secrezione e uptake del peptideAgrD

AgrA regolatore di risposta

AgrB: secrezione/modificazioneAgrC/A: sistema a due componenti

AgrC:sensore

A

PO4

Il sistema agr si autoregola tramite un RNA (hld)

hld modula l’attività di AgrA e di altri regolatori globali

17

Schema generale del QS in Gram +

Confronto tra processi di QS in Gram - e Gram +

Molecole segnale o “feromoni”Feromoni: HSLLibera diffusione attraversola membranaSistemi a due componenti(entrambi citoplasmatici)

Feromoni: peptidiSecrezione attivaSistemi a due componenti:Un sensore inserito nella membranaUn regolatore citoplasmatico

18

La “doppia vita” dei peptidi segnale: attività antimicrobica

• Un vasto gruppo di peptidi segnale presenta un’attività antimicrobica (generalmente mediata da destabilizzazione della membrana) particolarmente spiccata contro altri batteri Gram+ (plantaricina, enterocina, lantibiotici)

• Particolarmente presenti in batteri lattici (importanti per biotecnologie alimentari)

Un peptide antimicrobico “utile”: la nisina

Prodotta da lactobacilli; espressione richiede alta densità cellulare(QS) unitamente a fase stazionaria di crescita.Ampio spettro d’azione contro Gram + (a concentrazioni nM)Prodotta spontaneamente (o aggiunta) nella preparazione dei formaggi

19

Se ricordiamo lo schema generale del QS in Gram+…….

…..possiamo comprendere il sistema di produzione e processamento della

nisina!

Oltre al sistema di modificazione/esporto e di trasduzione del segnale, i ceppi produttori di nisina posseggono geni per l’immunità

20

Biosintesi e processamento dei lantibiotici

• Auto-regolazione (+ regolazione da segnali ambientali e fisiologici)

• Largo numero di geni coinvolti in: modificazione, esporto, trasduzione del segnale ed immunità (da 10 a 18)

• Interesse come “nuovo” agente antimicrobico e per applicazioni biotecnologiche (ind. alimentare)

Anche i geni dell’immunità sono sotto il diretto controllo della nisina

21

Nisin-controlled expression (NICE)

Espressione di geni letali tramite induzione con nisina

Enzimi intracellulari di lactobacillo sono essenziali nella maturazione dei formaggi

La lisi “controllata” potrebbe accelerare e standardizzare questo processo

22

Referenze biofilm/QS

• Winzer, Hardie, and Williams. Bacterial cell-to-cell communication: sorry, can’t talk now — gone to lunch! Current Opinion in Microbiology 2002, 5:216–222

• Withers, Swift, and Williams. Quorum sensing as an integral component of gene regulatory networks in Gram-negative bacteria. Current Opinion in Microbiology 2001, 4:186–193

• O‘ Toole and Kolter. Flagellar and twitching motility are necessary forPseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 1998, 30:295-304

• O‘ Toole, Kaplan, and Kolter. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 2000, 54:49-79.

• Davies, Parsek, Pearson, Iglewski, Costerton, and Greenberg. Theinvolvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterialbiofilm. Science 1998, 10:295-298

• Kleerebezem. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis Peptides 2004, 25:1405-1414

• Web: http://www.erc.montana.edu/ (University of Montana)• http://gasp.med.harvard.edu/ (Kolter lab)• http://www.nottingham.ac.uk/quorum/ (Quorum sensing network)