lezione SNuPE 1
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Università degli Studi di Firenze Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Biotecnologie
Dott. Ferri Lorenzo Dott. Sparvoli Valentina
Single Nucleotide Primer Extension
Permette di rilevare polimorfismi puntiformi (SNPs) in qualsiasi punto di una regione del
DNA amplificabile via PCR.
Attraverso l’estensione di uno o più primerdi un solo nucleotide complementare alla base polimorfica che si vuole studiare.
T5’ 3’
A 5’3’T
Single Nucleotide Primer Extension
O BASE
H
H
H
H HH
CH2
O-PO
OPO
OO-
PO
OO-
O-
I
lunghezza
ELETTROFORESI
CAPILLARE
ANALISI SNuPE
DETERMINAZIONE GENOTIPI
Single Nucleotide Primer Extension
INDIVIDUAZIONE MUTAZIONI
IDENTIFICAZIONE di SPECIE
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICARicerca e recupero, per ogni specie, delle sequenze nucleotidiche del MARCATORE MOLECOLARE (es.
un gene) scelto come bersaglio dell’analisi, disponibili in banca dati
SPECIE ASPECIE B
SPECIE CAF108056 AF108057 AF269041 AY074260 AY460027 ........
AY473021 AF057108 AY604126 AY067403 AF269017 ........
AF247043 AF604821 AY600626 AY744103 AY690319 ........
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICAAllineamento delle sequenze recuperate per ogni specie
AF108056 Specie A AGTCAATCGACCGTTCGGACCGGTGACTATACGACG
AF108057 Specie A AGTCAACCGACCGTTCCGACCGGTGACTATTCGACG
AF269041 Specie A AGTCAATCGACCGTTCGGACCGGTGACTATACGACG
AY074260 Specie A AGTCAATCGGCCGTTCGGACCGCTGACTATACGACG
AY460027 Specie A AGTCAATCGGCCGTTCGGCCCGCTGACTATACGACG
Creazione di SEQUENZE CONSENSO
Consensus sequence AGTCAAYCGRCCGTTCGGCCCGSTGACTATWCGACG
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
1. ANALISI BIONFORMATICAAllineamento delle sequenze
consenso delle specie considerate
SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
SpecieA 215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB 215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC 215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
Individuazione SNPs SPECIE SPECIFICI
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMER
CRITERI
Devono ricadere all’interno di una regione amplificabile via PCR
Scelta SNPs utili per l’analisi SNuPE
Devono presentare regioni conservate a monte o a valle
Singolarmente o combinati insieme devono consentire di discriminare le specie
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMER
SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
SpecieA 215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB 215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC 215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
2. DISEGNO PRIMERCARATTERISTICHE
Annealing su tutte le specieDisegno primer per
l’analisi SNuPE Coda di poli T all’estremità 5’
SpecieA 215 TCTACGTRCGGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB 215 TCTACGTRCAGTGACGACGTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC 215 TCTACGTRCAGTCACGACGTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
5’-(T)5AGTCACGACGTCGCTGAGTAT-3’
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
3. PCRFw Rev
245
PURIFICAZIONE PCR
1. Marker; 2. campione; 3. controllo negativo
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE
PRODOTTO di PCR PURIFICATO
PRIMER SNuPEREADY REACTION MIX
AmpliTaq®DNA Polymerase;FS Reaction Buffer;
ddNTPs (ddGTP,ddCTP,ddTTP,ddATP)
O BASE
H
H
H
H HH
CH2
O-PO
OPO
OO-
PO
OO-
O-
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (SIMPLEX)
DenaturazioneDenaturazione..T5’ 3’Specie ASpecie AA 5’3’
AnnealingAnnealingdel primer.del primer. T5’ 3’
A 5’3’Specie ASpecie A
STRATEGIA SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (SIMPLEX)
Estensione del Estensione del primer.primer.
T5’ 3’
A 5’3’T
O BASE
H
H
H
H HH
CH2
O-PO
OPO
OO-
PO
OO-
O-
Specie ASpecie A
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (SIMPLEX)
Elettroforesi capillare.Elettroforesi capillare.
I
lunghezza
I
lunghezza
I
lunghezza
3’ 5’TSpecie CSpecie C
Specie BSpecie B 3’ C 5’
Specie ASpecie A 3’ A 5’
G
A
T
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (SIMPLEX)
Elettroforesi capillare Elettroforesi capillare
I
3’ 5’TA
Specie BSpecie B
Specie ASpecie A 3’ AT
5’
lunghezza
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
SpecieA 215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB 215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
TGSpecie C
TASpecie B
CASpecie A
SNP 2SNP 1Specie
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
SpecieA 215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB 215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
TGSpecie C
TASpecie B
CASpecie A
SNP 2SNP 1Specie
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
SpecieA 215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB 215 TCTACGTACAGTGACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
TGSpecie C
TASpecie B
CASpecie A
SNP 2SNP 1Specie
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA 155 ACTTYCGGGCAATCTACGRYYTCAAYCGRCAGTTCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieB 155 ACYTYCGRGCAATCAACGRYCTCAAYCGRCAGTYCGGRTCACGACGACGTCYTRCAGTTC
SpecieC 155 ACTTYCGGGCAATCGACGRYYTCAATCGRCCGTTCGGATCACGACTACGTCYTRCAGTTC
SpecieA 215 TCTACGTACAGTCACGACCTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATGCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC 215 TCTACGTACAGTCACGACTTCGCTGAGTATACGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
TGSpecie C
TASpecie B
CASpecie A
SNP 2SNP 1Specie
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
SpecieA 95 AGTCAAYCGRCCGTTCGCCCGCTGACTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieB 95 AGTCAAYCGACCGTTCCACCGCTGAGTATACGACGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAYT
SpecieC 95 AGTCAAYCGGCCGTTCGACCGTTGAGTATACGGCGTCAGTAGGCACTYAYCCGACTRAAT
SpecieA 215 TCTACGTTCAGTCACGACGCCGCTGAGTATACGTCYTRCAGMCCGTTCCACCGCACGACG
SpecieB 215 TCTACGTTCAGTCACGACGTCGCTGAGTATCCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCRCGACG
SpecieC 215 TCTACGTTCAGTCACGACGTCGCTGAGTATTCGTCYTRCAGACCGGTCCACCGCACGACG
5’-(T)14CGTTCGCCCGCTGACTATACG-3’ PRIMER 1 (35 basi)
5’-(T)5TACGTTCAGTCACGACG-3’ PRIMER 2 (22 basi)
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (MULTIPLEX)
PRODOTTO di PCR PURIFICATO
READY REACTION MIX
AmpliTaq®DNA Polymerase;FS Reaction Buffer;
ddNTPs (ddGTP,ddCTP,ddUTP,ddATP)
PRIMER 1 PRIMER 2
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REZIONE SNuPE (MULTIPLEX)
DenaturazioneDenaturazione..
A
AnnealingAnnealing del primer.del primer.
A5’ 3’
T 5’3’
C
G
5’ 3’T 5’3’
CGSpecie ASpecie A
Specie ASpecie A
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
4. REAZIONE SNuPE (MULTIPLEX)
Estensione del primer.Estensione del primer.
AA
T
C 3’5’
5’3’ GCSpecie ASpecie A
I
lunghezza
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX)
Elettroforesi capillare.Elettroforesi capillare.A5’ 3’
T 5’3’
C
G
A5’ 3’
T 5’3’
T
A
Specie CSpecie C
Specie BSpecie B
G5’ 3’
C 5’3’
T
A
A
A
G
C
T
T
I
lunghezza
I
lunghezzaI
lunghezza
Specie ASpecie A
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX)
Elettroforesi capillare.Elettroforesi capillare.
I
lunghezza
A
G
C
T
A5’ 3’
T 5’3’
C
GSpecie ASpecie A
Specie CSpecie CG5’ 3’
C 5’3’
T
A
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
5. ELETTROFORESI CAPILLARE (MULTIPLEX)
Elettroforesi capillare.Elettroforesi capillare.
AT
A C
Specie BSpecie B
Specie ASpecie A
3’5’
5’3’ GC
I
lunghezzaAT
A T 3’5’
5’3’ AT
VANTAGGI TECNICA SNuPE
Single Nucleotide Primer Extension
RAPIDITA’ di ESECUZIONE
SENSIBILITA’
RILEVAZIONE SNPs in QUALSIASI PUNTO del MARCATORE SCELTO