Prima ora della lezione di immunologia del 24/11/06.….

La volta scorsa abbiamo incominciato a vedere ,per quanto riguarda il recettore dei linfociti Bcioè un recettore immunoglobulinico di membrana,come fosse possibile che ciascun organismo si doti di una diversità recettoriale tale da poter far fonte della maggiore diversità antigenica ipotizzabile. Questo è vero per i recettori immunoglobulinici ed è vero per i recettori T,che cominciano ad inalare comunque, che il recettore è in grado di riconoscere l’antigene ma non altre molecole che insieme al recettore formano il complesso recettoriale e servono per trasmettere all’interno della cellula, l’avvenuto riconoscimento cioè, il legame tra il recettore e il suo antigene specifico. Queste molecole sono chiamate Ig alfa e Ig beta quindi sono due catene immunoglobuliniche e viene chiamato CD3 complessivamente e più le catene beta per quanto riguarda il recettore di T. Il termine CD è usato per rendere omogeneo e confrontabile l’uso dei termini ed è in riferimento a molecole, ed indica la classe di designazione seguite da un numero quindi, il termine CD ci identifica una molecola di cui si sa qual è la struttura e qual è la funzione,il numero indica la sequenza, in pratica nome e cognome della molecola. TCD3 fa parte del complesso recettoriale ed è presente ovunque sia presente un recettore di TCR, tanto è vero che se noi vogliamo ricercare i linfociti T, non cerchiamo il TCR ma il CD3. In pratica la volta scorsa abbiamo visto per quanto riguarda la sintesi delle immunoglobuline come avveniva la generazione di diversità.

-la parte costante di una catena pesante è codificata da un unico gene

-parte variabile è codificata da un gene variabile funzionale che si è formato per la ricombinazione, per l’assemblaggio di tre segmenti genici e sono: il segmento D ,J ed uno V, questo a livello di DNA; questo è il gene funzionale che si forma a livello di DNA, il resto di DNA non è toccato, non è ricombinato, cioè l’ulteriore modifica quella che porterà a sintetizzare una catena mi al posto di sintetizzare una catena alfa o gamma, avviene per splicing del RNA,però il patrimonio genetico ,anche nel linfocitaB,rimane intatto a parte la ricombinazione gene funzionale variabile. Una volta che si ha il trascritto primario,per splicing, questo gene funzionale che codifica per il dominio variabile,viene associato il gene per una catena pesante, il primo gene che sempre viene associato è quello mi,c’è una gerarchia prima ricombinano i J,poi i V così a livello di RNA, lo splicing prevvede sempre che venga accostato il gene con la catena mi. Arrivati a questo punto, abbiamo un RNA che si è comportato da stampo e può portare alla sintesi della catena polipeptidica mi a livello del reticolo endoplasmatico che viene glicosilata e così via.PRIMO EVENTO la SINTESI della catena mi, fondamentale, all’inizio solo nel citoplasma,però una volta sintetizzata questa catena viene trasportata sulla superficie della cellula a fare da prerecettore, comunque la sintesi della catena mi, dà inizio ad un altro evento, blocca la possibile attivazione dell’altro cromosoma, per quanto riguarda il cromosoma 14 quindi da un fenomeno di inibizione allelica e invece inizia l’attivazione, la ricombinazione su uno dei due cromosomi21 e 22 per quanto riguarda la catena leggera. Allora anche qui primo effetto grazie ai geni che attivano la ricombinazione, che sono attivi solo nei linfociti, solo nelle catene leggere trovo una ricombinazione VJ, anche qui, c’è una diversità tra i vari segmenti con la possibilità di ricombinazione,che è la base di una notevole variabilità. Poi la ricombinazione, tagli di ricombinazione, vengono provvisti di nucleotidi, quindi aggiunta di nucleotidi per avere una sequenza attiva,nella catena leggera c’è una grande variabilità. Anche qui c’è un trascritto primario, c’è uno splicing e arriviamo alla combinazione di geni VJ per dominio variabile e quello costante per l’altro dominio che portano alla sintesi della catena leggera, anche in questo caso se il processo avviene con successo cioè, con la sintesi della catena,c’è un inibizione a carico dell’altro cromosoma,e a carico del cromosoma, che se si è attivato sul 2 verrà bloccata l’attivazione del 22 , alla fine si avrà l’assemblaggio all’interno della molecola del sistema reticolo endoteliale,delle varie catene con formazione del tetramero base che verrà espresso poi, sulla superficie cellulare attraverso il Golgi verrà portato in superficie e inchiodato a recettore del B. Quindi diversità anticorpale, diversità di segmenti genici, diversità giunzionali e diversità delle combinazioni perché per ogni catena questi stessi fenomeni avvengono e poi dobbiamo calcolare la diversità che dipende dalla associazione di una catena con l’altra. Per quanto riguarda solo il recettore immunoglobulinico,un ulteriore modificazione in modo particolare per quanto riguarda l’affinità del recettore,sia ha al difuori dell’organo linfatico primario durante la risposta anticipale. Questo invece avviene a livello dell’organo linfatico primario, al di là di qualsiasi contatto con l’antigene estraneo.

Vediamo il recettore del linfocita T, vi ricorda la struttura della catena quella immunoglobulina, fa parte della stessa super famiglia e il recettore dei T è costituito da un eterodimero, con una catena alfa, ed una beta, l’estremità C anche qui è nel citoplasma, un tratto transmembrana, un legame covalente per le due catene e per quanto riguarda la sequenza amminoacidica anche qui abbiamo due domini,un dominio variabile N-terminale ed un dominio costante più vicino alla membrana cellulare, questo è il recettore che la grande maggioranza dei nostri linfociti T presenta in superficie e viene chiamato recettore alfa-beta,in realtà esistono 2 tipi di recettori che ci identificano due popolazioni di T differenti almeno,riguardo al recettore stesso,il 95% porta il recettore alfa-beta,mentre il restante 5% ha sulla superficie un recettore definito gamma-delta perché è costituito da un eterodimero dove le catene sono per l’appunto le catene gamma e delta. Vediamo ora dal punto di vista genetico la situazione per il recettore dei T: è simile a quella delle immunoglobuline, tra l’altro anche nel recettore abbiamo una situazione di catena leggera e catena pesante cioè, il recettore alfa-beta, in

pratica la alfa è codificata da dei geni che hanno le stesse caratteristiche di quelli della catena leggera quindi V J e C, mentre la delta V D J e C che è appunto la catena pesante. Quindi la catena pesante ha il recettore che è espresso sulla maggior parte dei linfociti T anche qui abbiamo dei segmenti genici V che arrivano fino a 50 e dei D e dei J e poi abbiamo la parte costante per il resto della catena, nel cromosoma 14, è lo stesso in cui si hanno i geni che codificano per la catena delle immunoglobuline, abbiamo una situazione particolare, viene infatti codificata la catena leggera del recettore alfa-beta cioè la catena alfa, vedete che abbiamo V e J niente segmenti D e poi la parte costante alfa. Interposta in questo locus, ne abbiamo un’altra dove abbiamo i geni che codificano per la catena delta è una situazione un po’ particolare dove, la catena pesante del gamma-delta e quindi V D J e la parte costante di delta, sempre sul cromosoma 7 analogamente troviamo il locus per la catena gamma quindi V J e la parte costante. I meccanismi di ricombinazione sono sempre identici, tutte le nostre cellule hanno questo patrimonio, solo le cellule che diventeranno o cercheranno di diventare linfociti T, cominciano a ricombinare su questo patrimonio genetico fino ad arrivare se ci riescono alla sintesi di un recettore che sia funzionante. La progressione è la stessa, qui abbiamo exscissione del RAD poi quella del TDT per l’aggiunta dei nucleotidi, la ricombinazione, la trascrizione sull’RNA, lo splicing, e poi la sintesi sempre prima la catena pesante e poi quella leggera, alla fine, si ha la sintesi della molecola che viene trasportata in superficie.Qui dobbiamo affrontare un problemino un po’ diverso, cioè che il recettore dei T non ha bisogno di riconoscere il proprio antigene specifico, processato come unico peptide lineare quindi, come il risultato di una processazione, degrazione di un’altra cellula che poi è poi presente nel contesto di molecole di istocompatibilità,così dette di MHC di classe prima o seconda, quindi, per quanto riguarda il recettore abbiamo che il riconoscimento e la specificità è valutata sul peptide e sul complesso peptide-MHC e perché questo avvenga è necessario che MHC sia autologo cioè i nostri linfociti, riconoscono l’antigene sulla superficie di cellule che hanno un patrimonio MHC uguale al nostro altrimenti non sono in grado di interagire con queste molecole e non è possibile il riconoscimento.Allora, immunoglobuline TCR: è possibile riconoscere la variabilità data dal numero di segmenti genici, dal numero di segmenti genici D e J, poi diversificazione combinatoria e la possibilità ,vedete che quella del TCR è tripla rispetto a quella delle immunoglobuline poi, la diversificazione combizionale,giunzionale porta ad un ulteriore aumento della variazione di repertorio dei T. Quindi ricapitolando, abbiamo visto che, queste molecole servono per il riconoscimento.. Prima grande differenza tra il recettore monoglobulinico che riconosce l’antigene naive non modificato esattamente il contrario per quanto riguarda il linfocita T che riconosce solo un oligopeptide e lo riconosce solo nel contesto di molecole MHC autonome. Altro punto: da quanto abbiamo detto di fatto,i linfociti T riconoscono essenzialmente dei determinati antigenici derivati da proteine, abbiamo sempre detto peptidi, e alcune sottoclassi da cui gamma e delta, possono riconoscere dei lipidi, ma è un campo non ancora conosciuto, quello che invece è vero è che i linfociti T con il loro recettore immunoglobulinico sono in grado di riconoscere polisaccaridi,lipidi, proteine, acidi nucleici, e composti chimici anche a basso peso molecolare,quindi il range di antigeni che l’immunoglobulina e il recettore o una molecola solubile può gestire è enorme, mentre il recettore dei T che si riconosce essenzialmente le molecole proteiche, questo ha creato notevoli problemi riguardanti i vaccini, la maggior parte di quelli obbligatori sono diretti verso i virus,mentre pochi sono diretti contro i batteri, ma contro la tossina batterica sono ugualmente molti, i vaccini più efficaci sono quelli verso emofili perché la superficie presenta dei polissaccaridi contro i quali il virus deve combattere e non si instaura un immunità permanente come invece accade per i vaccini virali.La natura dell’antigene ha importanza pratica!!!Gli effetti di ricombinazione che portano alla sintesi di diversi recettori cioè, recettori a diversa specificità, avvengono nell’organo linfatico primario, il fine ultimo di questo fenomeno di maturazione della cellula che da staminale diventerà linfocita T o B è rappresentato dalla sintesi e dall’espressione di un recettore per l’antigene perfettamente funzionante,ovviamente associato a tutto ciò che serve per rendere funzionante il recettore stesso, però nel processo di maturazione, un aumento chiave essenziale è rappresentato dalla sintesi dall’espressione del così detto prerecettore, rispettivamente B e T, quindi un recettore 3B ed un recettore 3T.Allora abbiamo detto che il processo di ricombinazione di aggiunta promosso da RAG1 e RAG2 e l’aggiunta di nucleotidi promossa dal desossinucleotidil-terminale,ecc..,ecc.,che porta alla formazione del trascritto primario e dà luogo all’RNAmessaggero ,avviene negli organi linfatici primari, è un fenomeno progressivo che parte da una cellula con un DNA non arrangiato, si parla di stimoli che riceve da una cellula emopoietica e avviene negli organi linfatici primari, in realtà, il meccanismo è molto simile per quanto riguarda i T e i B linfociti. Vediamo uno schema di differenziazione,per meglio dire di maturazione, che varia sia per i B che per i T, allora, si parte da una cellula staminale, si passa attraverso uno stadio estremamente precoce di prolinfocita,il linfocita altamente immaturo che però si caratterizza perché ha già ricombinato il proprio DNA con successo ed è riuscito sempre con successo a sintetizzare la catena mi o la catena beta e l’ha espressa essendo una catena invariante fissa sulla superficie come prerecettore T o B, successivamente, si va al linfocita immaturo e poi al linfocita maturo che all’esterno dell’organo linfatico potrà svolgere la propria funzione. Nella prima fase, abbiamo una proliferazione con un aumento delle cellule che derivano dalle cellule staminali originarie e con un iniziale differenziazione. In questa fase di proliferazione e di differenziazione, non tutte le cellule sopravvivono perché lo scopo finale è quello di arrivare ad avere una cellula efficiente e l’efficienza caratteristica della cellula sono fortemente condizionati dalla sintesi ed espressione di un adeguato recettore. Quindi le cellule in cui gli eventi di ricombinazione,ecc. ecc.,non sono adeguati al processo vanno incontro a morte. Allora, le cellule che invece sopravvivono, e riescono a sintetizzare almeno la catena pesante del recettore, in pratica lo stimolo di superficie da questo momento in poi, la loro sopravvivenza o non sopravvivenza dipenderà dall’interazione di questo

prerecettore, poi del recettore completo con l’esterno, quindi la prima fase avviene indipendentemente dal contatto tra recettore e dalla proliferazione mediata dall’interleuchina7, voluta dalle cellule del timo, del midollo osseo e del contatto cellula cellula. Una volta sintetizzato il prerecettore la sopravvivenza dipende dalle caratteristiche del recettore e da recettore2. Riguarda gli organi linfatici primari e non c’è nessuna dipendenza da antigene estranei mentre, nell’ultima parte la dipendenza per la sopravvivenza dipenderà dal tipo di reattività con l’antigene….Sia per i T che per i B, ci sono i famosi punti di controllo,e ne esistono anche nella fase di maturazione. Un primo punto di controllo in cui si passa dalla cellula staminale indifferenziata alla proliferazione e l’incapacità di riarrangiare in modo tale da dare un prerecettore. Tutte le cellule inadeguate vengono eliminate.Secondo punto è rappresentato dal la presenza del prerecettore, consente proliferazione e nel frattempo, finita la proliferazione si ha un ulteriore differenziazione perché viene montata l’altra catena e si arriva al recettore completo. Anche qui, chi non riesce a fare il recettore completo perché la ricombinazione sull’altro cromosoma non ha successo viene eliminato, alla fine abbiamo il recettore completo T o B e in questo caso comincia un altro tipo di selezione, cioè, se è in grado di interagire, per esempio con gli antigeni self,se quest’interazione avviene con un alta affinità,quindi con un legame molto stabile e duraturo, la cellula viene eliminata perché potenzialmente auto-reattiva e quindi pericolosa. Le cellule che interagiscono con gli autoantigeni con un livello troppo basso di affinità,se l’interazione è troppo debole, la cellula viene eliminata.Quando l’interazione è ad un livello intermedio di affinità e di tempo allora, non troppo forte, né troppo debole allora la cellula sopravvive.Solo dopo questo processo se fatto di fasi di proliferazione,di fasi di differenziazione,di selezione e eliminazione di una quota cellulare inadeguata si arriva alla produzione di cellule B e T mature che possono lasciare l’organo linfatico primario, entrare in circolo,e svolgere la loro funzione.Per intenderci, nel Timo sopravive da 1a5 ogni 100 cellule, c’è quindi una grande selezione, questo fenomeno, sta alla base non solo dell’immunocompetenza cioè, capacità di rispondere,ma anche della tolleranza nei confronti dei nostri costituenti, detta tolleranza centrale perché viene impostata durante la fase di maturazione dei linfociti T e B negli organi linfoidi centrali!!!!!!

Immunologia 24-11-06 2° ora

La tolleranza centrale,questi fenomeni di selezione, prima sulla capacità di sintetizzare il recettore quindi di svolgere una certa funzione e poi la selezione sul tipo di recettore,cioè, il fatto che non determini un’attivazione da parte dei costituenti self,stà alla base appunto della tolleranza centrale. Gran parte dei cloni autoreattivi vengono eliminati,altri vengono resi non responsivi,comunque il risultato è che noi di norma in circolo abbiamo dei cloni che vengono attivati da antigeni estranei e invece quelli autoreattivi sono mantenuti in una situazione cosiddetta di tolleranza o non reattività. Esistono anche dei meccanismi periferici di tolleranza. Per quanto riguarda B e T è importante la tolleranza centrale che viene creata per selezione durante la maturazione nell’organo linfatico primario.Ricordatevi che la tolleranza dei T è fondamentale,perché se il T è tollerante per l’auto-antigene, anche il B non può dare una risposta se non una risposa primaria e non si generano cellule memoria.Quindi la tolleranza T è la chiave di volta che regge la tolleranza generale.

LINFOCITA B:MATURAZIONE ANTIGENE-INDIPENDENTERiarrangiamento dei geni che codificano per la regione variabile delle Ig.

Proliferazione linfocitaria policlonale.

Progressiva e ordinata espressione di marcatori di membrana,citoplasmatici e nucleari.

La maturazione antigene-indipendente,cioè quella che avviene nell’organo linfatico centrale ha,per i B,ma un discorso analogo si può fare per i T,come primo obbiettivo il riarrangiamento dei geni che codificano per la regione variabile delle immuno globuline,quindi la formazione,la sintesi,l’espressione di un recettore immunoglobulinico con una specificità che è diversa da clone a clone.Quindi non solo l’espressione del recettore ma anche diversificazione delle specificità dei vari recettori.Poi proliferazione leucocitaria policlonale: significa che ogni cellula con questo riarrangiamento,con questi procedimenti random,và a sintetizzare un unico tipo di recettore,diverso da quello di altre cellule,e ciascuna di queste và a proliferare,quindi abbiamo, alla fine, tanti cloni cellulari, ciascuno dotato di un proprio recettore e di una propria specificità.In contemporanea si ha l’espressione di marcatori di membrana,citoplasmatici,nucleari che avviene progressivamente e in maniera ordinata durante la maturazione e che consentono appunto l’acquisizione delle caratteristiche che saranno poi del linfocita B, la cellula responsiva e responsabile della risposta di tipo umorale.

(figure 7-12:stages of B cell maturation)

STEM CELL PRO B PRE B IMATURE B MATURE B

Qui entriamo nelle modalità di maturazione del B.Cellula staminale,cellula pro B,pre B,B Immaturo e linfocita B maturo. La prima fase della cellula staminale è caratterizzata da una forte proliferazione,quindi un’espansione del numero di cellule.Successivamente comincia l’espressione della RAG,dei geni vengono trascritti ed espressi,prodotti gli enzimi codificati dai geni RAG 1 e RAG 2.Abbiamo detto che questi enzimi vengono prodotti solo a livello dei linfociti,pur essendo dei geni presenti in tutte le cellule.Sono dei geni che promuovono la ricombinazione,la attivano.Contemporaneamente si ha anche l’espressione dell’enzima desossi-nucleotidil-transferasi terminale.In questa fase non abbiamo ancora niente che ci indichi che questa cellula diventerà un linfocita,per giunta B.Qui,nella fase pro B, abbiamo delle indicazioni in base all’espressione dei RAG e del TDT che diventerà un linfocita.Il DNA e l’RNA,in questa fase cellula staminale pro B,sono ancora assolutamente immodificati,non c’è ancora nessuna espressione di immunoglobulina nè di parti,comincia invece l’ espressione di molecole di superficie,tra queste CD43+,CD19+,CD10+.Il CD10 è il marcatore di una leucemia acuta,leucemia linfoblastica acuta dell’infanzia,che è marcata proprio dalla presenza del CD10,che segnala come il punto di arresto della maturazione normale e dell’emergere della leucemia acuta si ha a questo stadio maturativo.Il CD10,per fortuna,è un marcatore prognostico positivo,la maggior parte di questi bambini guarisce.Non è curabile è guaribile.E’ una forma con antigeni della leucemia linfoblastica positiva.Nella fase pre B comincia la proliferazione,cominciamo a vedere la ricombinazione del gene della catena pesante, con la sintesi e la produzione dell’mRNA per la catena mi.Questo comporta la sintesi della catena m che troviamo a livello citoplasmatico e a livello della membrana associata ad una catena leggera invariante e questo forma il recettore pre B.In questa fase, fino alla sintesi del pre-recettore, la sopravvivenza della cellula è garantita dalla presenza di interleuchina 7 verso cui ha i recettori specifici e dal C-kit(?) che le consente mediante l’interazione con cellule stromali di proliferare e di continuare nella sua progressione.Una volta che c’è la sintesi e l’espressione del pre-recettore, questi meccanismi non hanno rilievo e invece quello che conta è l’interazione del pre-recettore con l’esterno.Nella fase successiva,B immaturo,abbiamo ripresa della proliferazione,dobbiamo amplificare i cloni.Qui c’è una catena m però le altre catene sono ancora da sintetizzare.Cambiando la catena leggera e la parte variabile della catena leggera che si associa con la catena pesante, avremo cloni a specificità diversa,quindi, generazione di diversità.Abbiamo di nuovo l’espressione del RAG e,una volta che anche la catena leggera è stata sintetizzata, abbiamo la produzione di un recettore completo IgM.Solo secondariamente verrà sintetizzato anche il recettore di tipo IgD,che vengono espressi in contemporanea sulla superficie cellulare e che hanno la stessa specificità.In questa fase,B immaturo, anche per D abbiamo una selezione in base all’affinità di auto-antigeni presenti nell’organo linfatico primario e abbiamo anche un fenomeno che è tipico solo dei B:se è presente eccessiva affinità,eccessiva auto-reattività,la cellula non viene immediatamente indotta all’apoptosi,ma c’è una specie di meccanismo di recupero che si chiama “editing”.Sulla catena leggera,ammettiamo che sia stato attivato il cromosoma 2 per la k,viene attivato il cromosoma 22,bloccata la sintesi della catena k e si ricomincia da capo sul cromosoma 22 con la catena lambda.Quindi alla catena mi sintetizzata viene annessa la catena L di nuova sintesi.Se ancora il recettore completo che si forma è fortemente auto-reattivo la cellula muore,và in apoptosi.Se però questa ri-edizione del recettore completo non ha più quelle caratteristiche di forte auto-reattività, la cellula sopravvive.Diciamo che c’è un meccanismo di recupero cellulare sfruttando la possibilità di utilizzare la sintesi di un’altra catena di tipo diverso,k o lambda.Alla fine il B lascia l’organo linfatico primario con delle IgM di membrana.La differenza stà,rispetto alle IgM secrete,stò parlando della struttura,del fatto che ci sono dei tratti trans-membrana,citoplasmatici,che però sono codificati da esoni distinti da quelli della parte costante della catena pesante.

(Figure 7-15 Coexpression of IgM and IgG)Vediamo anche come può avvenire cha alla fine si abbia la produzione di recettori sulla superficie con la stessa specificità ma con isotipo diverso,cioè IgM e IgD.Tutto è legato ad uno splicing alternativo dell’RNA.Il DNA si modifica solo per quanto riguarda l’ottenimento di un gene variabile,del gene che codifica per la parte variabile.Il resto del DNA non viene toccato, viene trascritto e da un trascritto primario, poi ,per splicing,si utilizzano,assieme al gene variabile che ci interessa,i geni della parte costante ugualmente di interesse.Allora da questo trascritto primario, alternativamente, per splicing, viene associato a questo gene funzionale per la parte variabile o il mi o il delta.Per cui alla fine avremo il linfocita B,cosiddetto naive o vergine, che ha sulla sua superficie caratteristicamente IgM ed IgD.

Passiamo al TIMO.Il timo si trova nel mediastino anteriore.Conoscete la struttura,è un organo capsulato,struttura lobulare…e così via.Dobbiamo considerare per ciascun lobulo una parte corticale,una cortico-midollare e una midollare.Caratteristicamente, le cellule che arrivano dal midollo osseo entrano dalla parte più periferica e proliferano,maturano,muoiono man mano che avanzano verso il centro del lobulo.Quelle che sopravvivono lasceranno il timo attraverso la venula centro-lobulare e passeranno in circolo.Dobbiamo considerare nel timo l’esistenza non solo di una componente linfatica, ma anche la presenza di altri componenti,non per niente viene detto un organo linfo-epiteliale.Quindi esiste una componente epiteliale,presente sia nella midollare che nella corticale,sono presenti i macrofagi e sono presenti delle cellule dendritiche,prevalentemente nella zone midollare.Questo schema vi esprime come avviene questa progressione.Anche qui nella prima fase è molto importante sia l’interazione cellula-cellula con le

cellule epiteliali, sia la produzione di interleuchina 7 che promuove la proliferazione delle cellule altamente indifferenziate che arrivano dal midollo osseo.I macrofagi hanno l’importante funzione di ripulire il timo,come d’altra parte avviene nel midollo osseo,dai residui delle cellule andate in apoptosi.Le cellule dendritiche, presenti alla giunzione cortico-midollare,sono importanti nel fare una selezione in base alle caratteristiche del recettore,cioè, una volta sintetizzato il recettore completo,la selezione avviene in base alle caratteristiche del recettore stesso e il banco di prova è rappresentato essenzialmente dalle cellule dendritiche.

(Figure 7-16 Stages of T-cell maturation)STEM CELL PRO T PRE T DOUBLE

POSITIVESINGLE POSITIVE IMMATURE T CELL

NAIVE MATURE T CELL

Quindi cellule staminali,cellule comunque altamente indifferenziate,che si sono ampliate come numero con un processo di proliferazione,e solo ad un certo punto anche qui comincia l’espressione di geni per la ricombinazione del TDT.Una volta che questi geni si sono espressi comincia anche la ricombinazione genica,ovviamente,e la possibilità di arrivare alla sintesi di una catena pesante, beta oppure delta, del recettore che è presente nel citoplasma e poi viene anche espressa in superficie cellulare assieme ad una catena leggera sempre uguale,recettore pre T.Contemporaneamente anche qui abbiamo l’espressione di marcatori di superficie,CD25 per esempio,CD44.Poi, proseguendo, abbiamo delle cellule che riescono a sintetizzare in modo completo il recettore,quindi i geni vengono ricombinati e la seconda catena sintetizzata con successo ed espressa:questa è una fase in cui la cellula presenta caratteristicamente sulla sua superficie,in contemporanea,la molecola CD4 e la molecola CD8,viene detta anche “fase del doppio positivo”.A questo punto, abbiamo un’ulteriore maturazione e la cellula continua a sintetizzare ed esprimere in superficie solo il CD4 oppure solo il CD8,si passa cioè alla fase di cellula positiva singola.Quindi da questo punto in poi abbiamo delle caratteristiche che sono analoghe a quelle del linfocita maturo che lascerà il timo.Anche qui abbiamo una fase di proliferazione iniziale importante,abbiamo una selezione in base alla capacità della cellula di sintetizzare il recettore,la prima catena,chi non ci riesce viene eliminato.Abbiamo ancora una selezione in base alla capacità di sintetizzare un recettore che sia in grado di interagire con le molecole HLA autologhe, di prima e seconda classe, presentate dalle cellule epiteliali e dalle cellule dendritiche.Se questo recettore T,per quanto perfettamente strutturato,non è in grado di interagire con queste molecole,non sarà in grado poi di svolgere la propria funzione in circolo,quindi viene eliminato.Successivamente, queste cellule che presentano questo recettore che è in grado di interagire con l’ MHC,viene anch’esso selezionato in base al livello di affinità per l’auto-antigene presentato nel contesto di queste molecole,e anche qui l’affinità intermedia è il criterio di sopravvivenza. Un’affinità troppo bassa,abbiamo visto,creava un’induzione all’apoptosi,un’affinità troppo elevata induce lo stesso all’apoptosi.Quindi in questa fase abbiamo che si crea la tolleranza di T per delezione clonale di almeno dei cloni più intensamente auto-reattivi.La cellula che lascia il timo presenta un recettore che per il 95% è di tipo alfa-beta,presenta sulla sua superficie ovviamente il CD3,senza il quale il recettore non esiste,fa parte del complesso recettoriale,e presenta alternativamente o il CD4 o il CD8.Quindi, entro una cellula indifferenziata, le possibilità che abbiamo per le cellule che sopravvivono sono di avere o una cellula gamma-delta o una cellula alfa-beta che puo’ essere CD4 o CD8,quindi,nel timo cominciamo a vedere in base al recettore,due tipi di cellule:cellule alfa-beta al 95%,cellule gamma-delta al 5%.Le cellule alfa beta possono essere CD4 positive o CD8 positive,all’incirca il rapporto tra le CD4 e le CD8 è di 2:1,quindi i linfociti alfa-beta CD4 positivi sono in grande maggioranza,circa il doppio di quelli CD8 positivi.A questi marcatori fenotipici,a queste caratteristiche,corrispondono anche delle caratteristiche funzionali:il CD4 è la cellula helper,il CD8 la cellula citotossica.Gamma-delta merita un discorso e sé:non esprime né CD4 né CD8,quindi quando diciamo T CD4 + diciamo automaticamente che è un’alfa beta.Non ha bisogno di CD4 e CD8 perché riconosce anche antigeni lipidici,però non li riconosce nel contesto delle molecole classiche HLA,ma nelle sue modalità di riconoscimento particolari.Questo è un genere di cellule che si trova soprattutto e livello degli epiteli,della cute e delle mucose,cioè nelle zone di contatto con l’esterno.Probabilmente ha delle modalità più rapide di risposta,non ha bisogno di un antigene processato,però ha una diversificazione di recettori abbastanza limitata,come se fosse una cellula di prima risposta in attesa che vengano reclutati i T alfa beta.

(Figure 7-20 selection processes in the thymus)Ricordiamoci che il linfocita T è la cellula chiave del sistema immunitario.Siccome la risposta anticorpale,in modo particolare la risposta di tipo secondario,la formazione di cellule di memoria è strettamente dipendente dal T helper,se T helper è tollerante,il B può essere auto-reattivo ma non riceve segnale dal T e quindi la tolleranza rimane.Quindi ricordiamoci allora come avviene la selezione dei T.Selezione positiva avviene in pratica ogni volta che c’è un’affinità bassa o comunque intermedia,con il peptide ed MHC da un lato e il TCR dall’altro.Mancanza di selezione positiva:muoiono tutte la cellule che non sono in grado di interagire,troppo bassa l’affinità o non c’è proprio,la cellula viene eliminata.Se l’affinità è troppo elevata la cellula viene lo stesso eliminata.Di fatto viene salvata dall’apoptosi soltanto la cellula T che sia in grado di interagire con i peptici, che sono peptidi self di base presentati nell’ambito delle molecole HLA con un’affinità intermedia,perché se troppo bassa o troppo elevata si ha l’eliminazione del clone.

(Fig.: linfociti T CD4+)Allora,CD4,CD8:perché sono associati alla maturazione?Perchè la stabilità del legame tra il TCR e il suo antigene specifico,che è fatto dal complesso peptide più molecola HLA,è fondamentale per l’attivazione della cellula T.Se questo legame è troppo labile,troppo breve,non si ha stabilizzazione,non si ha attivazione della cellula.Il CD4 tende a stabilizzare il complesso TCR più HLA-peptide legandosi alla molecola HLA nella sua parte invariante,HLA di seconda classe,mentre il CD8 tende a stabilizzare questo complesso legandosi alla molecola HLA di prima classe.Per cui inizialmente il timocita esprime tutti e due, il CD4 e il CD8,poi viene salvata e permane la sintesi e l’espressione solo in quella molecola che meglio si lega all’HLA di primo o secondo tipo,per cui alla fine ciascuna cellula avrà o solo il CD8 o solo il CD4.Possiamo chiamarla anche questa come una molecola del complesso recettoriale,nel senso che stabilizza l’interazione recettore-antigene-HLA.Quindi finendo col discorso:immunoglobuline:antigeni inattivi e di varia natura chimica;TCR: antigeni processati e di natura peptidica.L’affinità del legame nelle Ig è abbastanza elevata, mentre quella dei recettori T è meno elevata.Tra l’altro,l’affinità delle Ig può variare nel tempo,con ripetuti contatti con l’antigene,c’è una maturazione dell’affinità,mentre il recettore T una volta prodotto non cambia più,neanche per l’affinità.Ancora,la velocità di associazione e dissociazione:qui abbiamo una maggiore stabilità del TCR,associazione e dissociazione lenta rispetto alla molecole immunoglobuliniche.(Fig.:7-42 clonal analysis of B-cell e T-cell tumors)Queste fasi di maturazione le rincontrerete nell’oncoematologia:dalle varie fasi si possono originare neoplasie che si possono manifestare come leucemie,cioè presenza nel circolo ematico di cellule altamente immature,oppure come linfomi,cioè cellule neoplastiche presenti a livello degli organi linfatici secondari.In base all’appartenenza ai T o ai B e allo stadio maturativo di arresto da cui emerge il clone neoplastico,varia la classificazione della neoplasia e varia molto la prognosi e l’approccio terapeutico.

A questo punto vorrei iniziare l’argomento della volta prossima,ovvero l’HLA o MHC:complesso maggiore di istocompatibilità.E’ un termine generico che si riferisce a tutte le specie.Il termine che definisce l’MHC umano è L’HLA,cioè antigeni leucocitari umani.Questo nome deriva dal fatto che inizialmente questi antigeni sono stati identificati sulla superficie dei leucociti circolanti,quindi cellule facilmente accessibili,basta fare un prelievo.Nell’uomo i geni che codificano per le prime MHC sono sul cromosoma 6,che possiamo distinguere in 2 classi principali di geni di superficie cellulare che sono l’MHC di classe 1 e l’MHC di classe 2, che codificano: nel caso della classe 1 per il polipeptide alfa,che è la catena che fa parte delle molecole HLA di prima classe,che sono formate da una catena alfa assemblata con una beta 2 microglobulina, dove solo una catena alfa è codificata dai geni MHC;nel caso della MHC di classe 2 invece i geni codificano per due catene,catena alfa e catena beta,assemblate tra di loro appunto a formare la molecola di classe seconda.C’è una differenza strutturale quindi tre le 2 molecole,c’è una differenza di distribuzione nelle cellule:quelle di 1° classe le troviamo praticamente su tutte le cellule nucleate,quelle di 2° classe le troviamo solo sulle cellule dette

Transcription transalationGermline MHC

genes

Class 2 MHC genes

Class 1 MHC genes

Alfa,beta polipeptide

Alfa polipeptide

Assembly of MHC molecules

Beta2-microglobulin

presentanti l’antigene professionale,che sono le cellule dendritiche,i macrofagi(monociti) e i linfociti B,tutte le altre cellule non le esprimono.Quindi:tutte le cellule nucleate hanno molecole di 1° classe;solo i linfociti B, i marofagi e le cellule dendritiche hanno quelle di prima classe e anche quelle di seconda classe.Perchè sono importanti queste molecole?Perchè presentano l’antigene al linfocita T.Il recettore del linfocita T,questo va sottolineato, non è che riconosca solo il peptide.Consideriamo l’MHC,la zona che accoglie il peptide,che è ancorato attraverso alcuni aa e altri li espone verso il recettore:il recettore non è che riconosca solo il peptide,ma riconosce un complesso che è dato da aminoacidi dell’MHC,nelle parti superiori,e aminoacidi esposti del peptide stesso.Ecco perché è fondamentale che sia in grado di interagire con L’MHC-self,altrimenti questo legame non potrebbe mai avvenire.Quindi ricordatevi che il riconoscimento è un riconoscimento combinato.Come si è arrivati alla scoperta?Nel tentativo di porre rimedio a certe situazioni patologiche mediante trapianti di organo,che servissero a sostituire organi ormai non più funzionanti.I trapianti erano aggravati da una complicanza che è il rigetto del trapianto,che,tradotto in termini pratici,significa necrosi del tessuto dell’organo trapiantato,cioè morte del tessuto trapiantato.Questo si accompagna alla perdita del vantaggio del trapianto e danno anche dell’organismo che ha subito il trapianto senza trarne alcun vantaggio.Non è che il trapianto sia un’evenienza fisiologica,è qualcosa di artificiale,però, nel tentativo di capire come mai certi organi fossero rigettatii e come mai alcuni accettassero il trapianto,si è arrivati ad individuare gli antigeni HLA,definiti di istocompatibilità.C’è il solito topolino, un topolino che ha un MHC,che nei topi si chiama H2,H2A,che viene trapiantato con cute di un altro topolino praticamente identico da un punto di vista genetico:il trapianto sopravvive,si integra,si ha quindi l’attecchimento del trapianto.Se invece a un topolino H2B viene fatto un trapianto della cute che viene dal topolino A,c’è una differenza che si tradurrà poi nella necrosi del trapianto stesso che viene quindi rigettato.Questo vuol dire che se c’era un’omogeneità genetica del donatore il trapianto sopravviveva,se c’era una differenza il trapianto non sopravviveva.Se il donatore era un gemello monozigote del ricevente il trapianto sopravviveva,se era un donatore non correlato,preso così a caso, le chances di sopravvivenza erano minime,e da lì è partito un po’ lo studio.In realtà però non è questa la funzione dei geni:la funzione dei geni è quella di garantire al linfocita T la possibilità di riconoscere i vari antigeni,cioè garantire la possibilità di una risposta immunitaria adeguata.Serve a far comunicare le varie cellule con le cellule del sistema immuno-competente.Perchè le molecole di 1°classe sono su tutte le cellule nucleate?Perchè i T citotossici CD8 positivi possono interagire con tutte le cellule nucleate ed eliminare qualsiasi cellula nucleata presenti un antigene estraneo pericoloso.Quindi è il contatto cellula-cellula e il riconoscimento dell’antigene,quella è la vera funzione degli antigeni di prima e seconda classe.(figure:location and organization of the HLA complex on chromosome 6)Dove è posto il nostro locus che accoglie i geni che codificano per l’HLA,sul cromosoma 14.La beta 2 microglobulina non è codificata dai geni dell’MHC,ma da geni posti sul cromosoma 15.Questa è la mappa dell’MHC.Qui è amplificata:in azzurro abbiamo i geni di classe seconda,in arancione i geni che codificano per la classe prima,in verde abbiamo i geni per la classe terza.La classe terza non serve per il riconoscimento dell’antigene e per l’interazione cellula-cellula,sono geni che codificano per molecole solubili,per esempio per il fattore B del complemento,per il C4 del complemento,per il C2,per il TNF-alfa,per le heat schock proteins varie,quindi codifica per molecole che sono coinvolte genericamente nella risposta immunitaria,ma non sono coinvolte nel riconoscimento specifico e comunque sono molecole solubili.Allora i geni che codificano per le molecole di classe seconda che vengono espressi sono l’HLA-DR,-DP e –DQ, mentre i geni HLA di prima classe che codificano per molecole che vengono espresse sono l’HLA-A,HLA-B e HLA-C.Oltre questi sono presenti i geni che codificano per una quantità di molecole che sono importanti nella sintesi e nell’espressione in superficie di questi antigeni,però non sono essi stessi antigeni.Per esempio abbiamo,per quanto riguarda la classe 2, i geni che codificano per TAP1 e TAP2,cioè molecole che servono per il caricamento dei peptidi all’interno della cellula e così via.Però ricordatevi le molecole espresse sono di prima classe le HLA-A,-B e -C e di seconda classe HLA-DP,-DQ e -DR.Caratteristica di questo locus genico,la prima è che viene ereditato in blocco,una zona dove avviene rarissimamente il crossing over,per cui ciascuno di noi eredita in blocco col cromatide di ciascuno dei genitori questo intero locus genico.L’altra caratteristica è che sono geni dotati di un alto polimorfismo,quindi abbiamo moltissimi alleli per il singolo locus genico.Allora,assenza di crossing over cosa significa, che ciascuno di noi col cromatide materno e quello paterno eredita un determinato aplotipo HLA,per cui i figli possono avere un aplotipo HLA che è frutto delle possibili ricombinazioni dei cromatidi;questo significa che 2 fratelli,2 gemelli omozigoti,possono essere identici tra loro,possiamo avere anche quattro fratelli che possono essere diversissimi fenotipicamente,e magari by chance,è come la lotteria la ricombinazione,possono essere tutti identici per quanto riguarda l’HLA stesso,l’aplotipo HLA. A questo proposito vi ricordo che,attualmente,è vero che si pone meno il problema dei donatori perché abbiamo le cellule staminali che possono essere condizionate per dare poi le linee cellulari che servono,però ricordiamoci che in molte patologie si utilizza,soprattutto per quanto riguarda il midollo osseo, il trapianto dal donatore,selezionato in base al proprio aplotipo HLA tenendo presente soprattutto che il vostro è un mondo di figli unici,quindi non ci sono spesso fratelli e quindi non ci sono donatori potenziali.E’ vero però che ci sono le cellule staminali che possono offrire una grossissima possibilità.Questa è la struttura, e con questo chiudiamo,dell’HLA di primo tipo: ha un’unica catena codificata dal gene MHC,tenuta in condizioni tridimensionali con la sua configurazione sterica dalla 2 beta microglobulina.La classe 2

invece è un eterodimero ,però tutte e 2 le catene sono codificate da geni MHC,tutte e due arrivano al citoplasma e anche qui troviamo delle zone di esposizione dell’antigene,il primo caso è solo la catena alfa,nel secondo caso,nella classe seconda,questa zona di esposizione è formata da una catena alfa e da una catena beta.