Lenergia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck: E = h E = h Campo magnetico...

L’energia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck:L’energia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck:

E = h E = h

Campo magnetico

Campo elettrico

Direzionedi

propagazione

lunghezza d’ondalunghezza d’onda

a

aaampiezza d’ondaampiezza d’onda

PROPRIETA’ DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHEPROPRIETA’ DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE

: frequenza d’onda

tempo

ampiezza

spazio

ampiezza

4 Hz

1 s

tempo

ampiezza

spazio

ampiezza

2 Hz

1 s

E’ importante ricordare che frequenza e lunghezza d’onda non si possono confrontare sullo stesso grafico

Lunghezza d’onda, frequenza e velocità di una qualsiasi onda elettromagnetica sono correlate dalla relazione

c

Passando dall’aria al vetro, la velocità di propagazione diminuisce a causa dell’indice di rifrazione; pertanto, rimanendo costante la frequenza (dipendente solo dalla sorgente

luminosa), diminuisce anche la lunghezza d’onda.

Variazione di con l’indice di rifrazione del mezzo

ampiezza

distanza

aria ariavetro

= 6,0 x 1014 Hz = 500 nm

= 6,0 x 1014 Hz = 500 nm

= 6,0 x 1014 Hz = 350 nm

Onderadio

Microonde

IR lontano

IR medio

IR vicinoVisibile

UV vicinoUV lontano

Raggi X

Frequenza,Energia

Frequenza,Energia

1-1000 m1-1000 m

0,1-100 cm0,1-100 cm

50-1000 50-1000 mm

2,5-50 2,5-50 mm

0,75-2,5 0,75-2,5 mm

400-750 nm400-750 nm200-400 nm200-400 nm10-200 nm10-200 nm

1010-2-2- 100 Å- 100 Å

REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICOREGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO

1 Å = 10 1 Å = 10 -10-10 m m

1 nm = 10 1 nm = 10 -9-9 m m

1 1 m = 10 m = 10 -6 -6 mm

REGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICOREGIONI DELLO SPETTRO ELETTROMAGNETICO

Principali applicazioni delle diverse onde

INTERAZIONI TRA MOLECOLE ED ENERGIA RADIANTEINTERAZIONI TRA MOLECOLE ED ENERGIA RADIANTE

E0

E1

E2

v0

v1

v2

r0r1r2

UV-VIS

IR

E

SCHEMA DEI LIVELLI ELETTRONICI, VIBRAZIONALI E ROTAZIONALI DI UNA MOLECOLA

EE00 , E , E11 , E , E22 : livelli elettronici : livelli elettronici

vv00 , v , v11 , v , v22 : livelli vibrazionali : livelli vibrazionali

rr00 , r , r11 , r , r22 : livelli rotazionali : livelli rotazionali

L’energia assorbita viene cedutaL’energia assorbita viene ceduta per per diseccitazione termicadiseccitazione termica o, più o, più

raramente,raramente, radiativa radiativa(fluorescenza(fluorescenza o o fosforescenza)fosforescenza)

SPETTROFOTOMETRIA UV E VISIBILESPETTROFOTOMETRIA UV E VISIBILE

SoluzioneSoluzionecampionecampione

I0 (P0) I (P)

Potere radiante (P):Potere radiante (P): energia che attraversa un’area energia che attraversa un’area unitaria in un secondo (J/sec)unitaria in un secondo (J/sec)

Intensità (I):Intensità (I): potere radiante per unità di angolo potere radiante per unità di angolo solido (steradiante) della sorgentesolido (steradiante) della sorgente

TRASMITTANZATRASMITTANZA

IIII00

T =T =

0 ≤ T ≤ 1 0% ≤ T ≤ 100%

ASSORBANZAASSORBANZA

TT

11A = - log T = log = logA = - log T = log = log II

II00

0 ≤ A ≤ ∞numerinumeriadimensionaliadimensionali

numerinumeriadimensionaliadimensionali

radianter

r

steradiante

Spettro di assorbimento della clorofilla

max

Spettro di assorbimento: diagramma ottenuto misurando l’assorbanza in funzione di

max max : :

lunghezza d’onda a cuilunghezza d’onda a cuicorrisponde un massimocorrisponde un massimo

di assorbimentodi assorbimento

LEGGE DI LAMBERT-BEERLEGGE DI LAMBERT-BEER

II00 II

dndn

II00 IIII’’

cammino otticocammino ottico

bb

Valida per radiazioni monocromaticheValida per radiazioni monocromatiche

- dI’ = KI’dn

dI’ = - KdnI’

ln I = - KNI0

dI’I’

= - K dn∫0

N

∫I0

I

ponendo N = K’bc (c: conc. soluzione)

ln I = - (K · K’)bc = - a’bcI0

I = e-a’bc

I0

T = e-a’bc

passando ai log e ponendo a = a’log e

log T = -abc T = 10-abc

Poiché A = - log T

A = - log 10-abc = abc

A = abcA = abc

N° totalemolecole

Per b Per b == c c == 1 1

A A == a ab cb c

AA1%1%1 cm1 cm

: in F. U. : in F. U. estinzione specificaestinzione specifica di soluzioni 1% p/v e cammino ottico 1 cm di soluzioni 1% p/v e cammino ottico 1 cm

A A == a ( a (assorbivitàassorbività, costante per , costante per costante) costante)

coefficiente di estinzionecoefficiente di estinzione (o (o assorbanza specificaassorbanza specifica))se se bb espresso in cm e espresso in cm e cc in g/L in g/L

coefficiente di estinzione molarecoefficiente di estinzione molare (o (o assorbanza specifica molareassorbanza specifica molare))se se bb espresso in cm e espresso in cm e cc in mol/L in mol/L a a ==

A = abcA = abc

concentrazioneconcentrazione

AA

Deviazioni dalla legge di Lambert-BeerDeviazioni dalla legge di Lambert-Beer

a) a) deviazioni fisichedeviazioni fisiche

- a concentrazioni elevate il soluto può formare dimeri, polimeri o aggregati con il solvente - a concentrazioni elevate il soluto può formare dimeri, polimeri o aggregati con il solvente generando deviazioni positive o negativegenerando deviazioni positive o negative

concentrazioneconcentrazione

AA

- a concentrazioni elevate cambia anche l’indice di rifrazione della soluzione e quindi la - a concentrazioni elevate cambia anche l’indice di rifrazione della soluzione e quindi la della della radiazione che l’attraversa; di conseguenza, l’assorbanza di soluzioni di diversa concentrazione radiazione che l’attraversa; di conseguenza, l’assorbanza di soluzioni di diversa concentrazione viene misurata, di fatto, a viene misurata, di fatto, a diverse con scostamento dalla linearità diverse con scostamento dalla linearità

b) b) deviazioni strumentalideviazioni strumentali

Dipendono essenzialmente dalla monocromaticità della radiazione incidente: Dipendono essenzialmente dalla monocromaticità della radiazione incidente: le deviazioni dalla linearità sono tanto più grandi quanto maggiore è la le deviazioni dalla linearità sono tanto più grandi quanto maggiore è la banda passantebanda passante

Banda passanteBanda passante: : intervallo di radiazioni isolateintervallo di radiazioni isolatedallo strumento e convogliate dallo strumento e convogliate

sulla soluzione in esamesulla soluzione in esame

Skoog, West, Holler, Crouch

c) c) deviazioni chimichedeviazioni chimiche

Più apparenti che reali, sono dovute di solito ad alterazioni dell’equilibrio chimico Più apparenti che reali, sono dovute di solito ad alterazioni dell’equilibrio chimico tra due specietra due specie

maxmax: 372 nm: 372 nm maxmax: 450 nm: 450 nm

Cr2O7 2- + H2OCrO4

2- + 2H+EsempioEsempio:

Se a 372 nm e pH Se a 372 nm e pH == 1, 1,Assorbanza (CrOAssorbanza (CrO44 2-2-) ) == x x

Se a 450 nm e pH Se a 450 nm e pH == 1, 1,Assorbanza (CrAssorbanza (Cr22OO7 7

2-2-) ) == y y

Diluendo successivamente Diluendo successivamente nel rapporto 1 a 10:nel rapporto 1 a 10:

Diluendo successivamente Diluendo successivamente nel rapporto 1 a 10:nel rapporto 1 a 10:

Assorbanza (CrOAssorbanza (CrO44 2-2-) ) > > 1 1 xx

1010

Assorbanza (CrAssorbanza (Cr22OO7 7 2-2-) ) < < 1 1 yy

1010

ANALISI QUANTITATIVAANALISI QUANTITATIVA

Viene effettuata Viene effettuata quasi semprequasi sempre in corrispondenza della in corrispondenza della maxmax in modo che: in modo che:

- aumenti l’intervallo di linearità della legge di Lambert-Beer (- aumenti l’intervallo di linearità della legge di Lambert-Beer (vedi primavedi prima))

- aumenti la sensibilità del metodo analitico, infatti- aumenti la sensibilità del metodo analitico, infatti

A = abcA = abc

Sensibilità = Sensibilità = dAdA = ab = abdCdC

La sensibilità è cioè La sensibilità è cioè al cammino ottico al cammino ottico bb e al coefficiente di estinzione e al coefficiente di estinzione aa

ANALISI IN ASSORBIMENTOANALISI IN ASSORBIMENTO

a) a) Metodo di confrontoMetodo di confronto

Il confronto con soluzioni standard a differente concentrazione è visivo Il confronto con soluzioni standard a differente concentrazione è visivo e limitato alle soluzioni coloratee limitato alle soluzioni colorate

AA11 AA22 AA33 AA44AAxx

Mantenendo il cammino ottico costante, se AMantenendo il cammino ottico costante, se Axx = A = A11ccxx = c = c11

AAxx = A = A11

E’ possibile anche usare una sola soluzione standard E’ possibile anche usare una sola soluzione standard e variare i cammini ottici fino a quando:e variare i cammini ottici fino a quando:

AAxx = A = A11 a ba bxx c cxx == a b a b11 c c11ccxx == b b1 1 cc11

bbxx

b) b) Metodo direttoMetodo diretto

AAx x == a b c a b cxx

Conoscendo il coefficiente di estinzione Conoscendo il coefficiente di estinzione aa (tabulato o calcolato) ed il cammino ottico (tabulato o calcolato) ed il cammino ottico bb, , è possibile risalire alla concentrazione è possibile risalire alla concentrazione ccxx

Questo metodo implica una linearità tra assorbanza e concentrazione Questo metodo implica una linearità tra assorbanza e concentrazione che andrebbe preliminarmente verificatache andrebbe preliminarmente verificata

Conc.Conc.

AA

c) c) Metodo retta di taraturaMetodo retta di taratura

A1

c1

A2

c2

A3

c3

Ax

cx

d) d) Metodo delle aggiunteMetodo delle aggiunte (per matrici complesse) (per matrici complesse)

- aggiunta singola (di analita puro)- aggiunta singola (di analita puro)

xx x x ++ a a

AA

mgmg

xx x x ++ a a00

aa

AA11

00

AAxx

AA

mgmgaa

AA11

2a2a

AA22

3a3a

AA33

xx

00

AAxx

- aggiunte multiple- aggiunte multiple

xx xx ++ aa xx ++ 2a2a xx ++ 3a3a

Spettri in derivata:Spettri in derivata: Ottenuti tracciando la derivata della funzione A / Ottenuti tracciando la derivata della funzione A /

Nella pratica non si va oltre la derivata quarta perché aumenta troppo il Nella pratica non si va oltre la derivata quarta perché aumenta troppo il rumore di fondorumore di fondo

Derivata 1Derivata 1aa


AASpettro UV-VisSpettro UV-Vis

Gli spettri in derivata consentono una migliore Gli spettri in derivata consentono una migliore risoluzionerisoluzione di bande sovrapposte di bande sovrappostenegli spettri normalinegli spettri normali

AA

Spettro UV-VisSpettro UV-Vis

Analita 1Analita 1

Analita 2Analita 2


Analita 2Analita 2

Analita 1Analita 1

AA

AA

ADDITIVITA’ DELLE ASSORBANZEADDITIVITA’ DELLE ASSORBANZE

x

y

x + y

AAtottot = = A Ai i = = a aii b c b cii

Nel caso di due sostanze:Nel caso di due sostanze:

11 AA11 = A = A11x x + + AA1 1

yy = a = a11x x b cb cxx + a + a11

y y b cb cyy

22 AA22 = A = A22x x + + AA2 2

yy = a = a22x x b cb cxx + a + a22

y y b cb cyy

2211

A

Punto isosbestico:Punto isosbestico: punto di intersezione degli spettri di assorbimento di specie in equilibriopunto di intersezione degli spettri di assorbimento di specie in equilibrio

Es.: HA H+ + A-

pH: 3.0pH: 3.0

pH: 4.0pH: 4.0

pH: 5.0pH: 5.0

pH: 6.0pH: 6.0

pH: 7.0pH: 7.0

AAisis == aaisis b [HA] b [HA] ++ aaisis b [A b [A- - ]] = = aaisis b ( [HA] b ( [HA] ++ [A[A- - ])]) = = aaisis b c b ctottot

Operazioni di taraturaOperazioni di taratura

TRASMITTANZATRASMITTANZA

ASSORBANZAASSORBANZA

0%0%

corpo opacocorpo opaco

100%100%

biancobianco

campionecampioneanaliticoanalitico

azzeramentoazzeramento

operazione dioperazione di

biancobianco

soluzione identica al soluzione identica al campione analitico,campione analitico,

ma priva dell’analitama priva dell’analita

Limiti di trasparenza (Limiti di trasparenza (cut offcut off))di alcuni solventi: di alcuni solventi:

Acqua 180 -195 nm Metanolo 200 -210 nmAcqua 180 -195 nm Metanolo 200 -210 nm Cloroformio 250 -260 nm Benzene 280 -290 nmCloroformio 250 -260 nm Benzene 280 -290 nm

Errore fotometricoErrore fotometrico

Valori ottimali di trasmittanza: 20 - 60%Valori ottimali di trasmittanza: 20 - 60% Assorbanza: 0.2 - 0.7Assorbanza: 0.2 - 0.7

00 2020 4040 6060 8080 100100

± 1.0± 1.0

± 2.0± 2.0

± 3.0± 3.0

± 5.0± 5.0

± 4.0± 4.0

Trasmittanza %Trasmittanza %

Errore %Errore %relativorelativo

Combinazione lineare di orbitali atomici a formare orbitali molecolari (LCAO)Combinazione lineare di orbitali atomici a formare orbitali molecolari (LCAO)

EENNEERRGGIIAA

Assorbimento molecolare di una radiazioneAssorbimento molecolare di una radiazione

Per una molecola:Per una molecola:

EEtottot = E = E nuclearenucleare + E + E elettronicaelettronica + E + E vibrazionalevibrazionale + E + E rotazionalerotazionale + E + E traslazionaletraslazionale

Assorbimento radiazioni dell’UV e del visibile Assorbimento radiazioni dell’UV e del visibile transizioni elettronichetransizioni elettroniche

Orbitale molecolareOrbitale molecolareantileganteantilegante

OrbitaleOrbitale

atomicoatomico

OrbitaleOrbitale

atomicoatomico

Orbitale molecolareOrbitale molecolarelegantelegante

Diagramma dei livelli energetici degli orbitali molecolariDiagramma dei livelli energetici degli orbitali molecolari

EENNEERRGGIIAA

nn non legantenon legante

**

antilegantiantileganti}

legantileganti}

Scarso interesse analitico: Scarso interesse analitico: assorbimenti nell’UV lontanoassorbimenti nell’UV lontano

Es. di Es. di maxmax per per **CHCH44: 125 nm ; C: 125 nm ; C22HH55: 135 nm: 135 nm

Es. di Es. di maxmax per n per n **HH22O: 167 nm ; CHO: 167 nm ; CH33OH: 185 nmOH: 185 nm

Limitato interesse analitico; assorbimento nell’UV vicino, ma con bassi valori di Limitato interesse analitico; assorbimento nell’UV vicino, ma con bassi valori di assorbività (assorbività ( ≤ 10 ≤ 1022, , transizioni proibitetransizioni proibite dalle cosiddette regole di selezione quanto- dalle cosiddette regole di selezione quanto-meccaniche)meccaniche) EsempioEsempio: acetone, : acetone, maxmax (esano) 279 nm, (esano) 279 nm, ~ 20 ~ 20

Transizioni elettroniche Transizioni elettroniche **Collocazione variabile:Collocazione variabile: ~ 160-230 nm (sistemi~ 160-230 nm (sistemiisolati, isolati, transizioni E o etilenichetransizioni E o etileniche) ) ~ 250-280 nm (anelli benzenici, ~ 250-280 nm (anelli benzenici, transizioni B o benzenoiditransizioni B o benzenoidi) ) ~ 220-750 nm (sistemi aromatici e/o coniugati, ~ 220-750 nm (sistemi aromatici e/o coniugati, transizioni K o di coniugazionetransizioni K o di coniugazione))

max (cloroformio): 466, 497 nm

-carotene

Transizioni elettroniche n Transizioni elettroniche n ** (R o radicaliche come quelle n n *)*)

{

{E0

E1

Possibili transizioni tra due livelli Possibili transizioni tra due livelli elettronici con sottolivelli elettronici con sottolivelli vibrazionali e rotazionalivibrazionali e rotazionali

VaporeVaporeVaporeVapore

SoluzioneSoluzionedi esanodi esano

SoluzioneSoluzionedi esanodi esano

SoluzioneSoluzioneacquosaacquosa

SoluzioneSoluzioneacquosaacquosa

Lunghezza d’onda, Lunghezza d’onda, nmnmLunghezza d’onda, Lunghezza d’onda, nmnm

Ass

orb

anza

Ass

orb

anza

Ass

orb

anza

Ass

orb

anza

[Skoog-West-Holler][Skoog-West-Holler]

Spettro di assorbimento Spettro di assorbimento della 1,2,4,5-tetrazina in della 1,2,4,5-tetrazina in

tre diverse condizionitre diverse condizioni

Gli elettroni coinvolti in legami doppi e tripli di molecole organiche sono legati più debolmente

e sono perciò più facilmente eccitabili

CROMOFORI Gruppi funzionali insaturi le cui transizioni elettroniche danno luogo ad assorbimento nel visibile e nel vicino UV

Cromofori più comuni:

C C C C C N C O C S

N N N O Sistemi aromatici in genere

Ogni cromoforo ha di massimo assorbimento (max) e coefficienti di estinzione caratteristici che variano però in funzione del

solvente e della struttura molecolare complessiva

Cromoforo Transizione max

C = O * 180 9000

n * 200 --

n * 280 20

Possibilitransizioni

per uncarbonile

Fattori che influenzano il valore di

- Probabilità della transizione elettronica > 104 probabilità elevata < 103 probabilità bassa

- Variazione del momento dipolare legato alla transizioneL’assorbimento è tanto più intenso quanto maggiore la separazione di carica nello stato eccitato

- Natura del solvente

- Tipo di sostituentiInfluenzano sia la probabilità di transizione che la variazione del momento dipolare

Effetto ipercromico: aumento del valore di Effetto ipocromico: diminuzione del valore di

Effetto ipsocromico (blue shift): opposto al precedente e causato dal solventeo da interruzione della coniugazione con un gruppo cromoforo o auxocromico

Fattori che influenzano il valore di max

Effetto batocromico (red shift): spostamento della max verso valori più alti (frequenza ed energia più basse)

Possibili cause

-solvente: importante la polarità

coniugazione con altri cromofori

-sostituenti iperconiugazione

coniugazione con auxocromi

Auxocromi: gruppi funzionali saturi con doppietti elettronici di non legame; la coniugazione con un cromoforo comporta generalmente un aumento sia di max che di

Effetti sulla transizione * dell’iperconiugazione e della coniugazione con auxocromi

cromoforo lmax eCH2 = CH2 162 10.000

CH2 = CH – CH3 168 10.000

CH3 – CH = CH – CH3 177 11.000

CH3 – CH = C – (CH3)2 187 12.000

(CH3)2 – C = C – (CH3)2 196 12.400

Cl – CH = CH – Cl 193 11.000

Cromofori multipliSe non coniugati: sono additivi- max costante

CH3CH2CH2CH=CH2 max= 184 max = ~10,000

CH2=CHCH2CH2CH=CH2 max=185 max = ~20,000

Se coniugati:- effetto batocromico- effetto ipercromico

H2C=CH-CH=CH2 max=217 max = ~21,000

energia

N° doppi legami

-carotene(: 100.000)

450 nm

Etilene: 10.000)

162 nm

Butadiene( 21.000)

217 nm

Esatriene ( 25.000)

258 nm

Distribuzione degli orbitali in dieni coniugati

Sistemi aromatici Si possono considerare sistemi polienici coniugati; sono caratteristici sia il comportamento chimico che spettroscopico

max: 184 nm ( = 60.000) e 204 nm ( = 7.900) (bande etileniche E1 e E2)

max: 256 nm ( = 200) (banda benzenoide B a struttura fine)

Solo la prima (E1) non è “proibita” ed è infatti la più intensa benzene

Effetto del pH sull’assorbimento È legato alla presenza di gruppi funzionali ionizzabili

Esempi:

Assorbimento nei composti inorganici

Transizioni elettroniche nei metalli di transizione (orbitali d)

Caso classico: ioni complessi a struttura ottaedrica

Co(NH3)62+ Co(H2O)6

2+

Teoria del campo cristallino

Energia

Orbitali d

(nessun legante)

0

Di solito 0 è piccolo per cui la transizione avviene per assorbimento

nella regione del visibile(soluzioni colorate)

(complesso ottaedrico)Orbitali d

Transizioni per trasferimento di carica

- Transizione intramolecolare: tipica dei composti di coordinazione, ma anche di ioni quali MnO4

-, CrO42-….; di solito consiste nel trasferimento di un elettrone dal

legante al metallo

Esempio 1: FeSCN2+

Fe3+ -------- -SCN Fe2+ -------- SCN.h

Più raramente è lo ione metallico a cedere un elettrone al legante

Esempio 2: ferroina:

h

- Transizione intermolecolare: tipico esempio è quello del complesso I2-benzene in cui un elettrone oscilla tra la nuvola del benzene ed un orbitale vuoto di I2

Un altro esempio classico è quello del complesso I2-amido in cui un elettrone oscilla tra la la molecola di I2e quella di amido che l’avvolge a spirale

+ I2

SoluzioneMarrone scuro

Amido + I2Soluzione

blu

h

h

COLORIMETRIA E SPETTROFOTOMETRIA UV

La colorimetria è limitata alla regione del visibile ed utilizza colorimetri fotoelettrici

La spettrofotometria UV è più affidabile, più versatile ed utilizza spettrofotometri

Caratteristiche principali:- campo di indagine esteso dal vicino UV (~ 200 nm) al vicino IR (~ 1000 nm)- condizioni di quasi monocromaticità delle radiazioni utilizzate- continuità con cui può essere variata la lunghezza d’onda della radiazione

Componenti di colorimetri fotoelettrici e spettrofotometri

Selezionatore di lunghezza d’onda

Sorgenteradiante

Cella Rivelatore

Sorgenti radianti

Emettono radiazioni policromatiche contenenti cioè le lunghezze d’onda della regione richiesta

Le sorgenti possono essere continue (a) o a righe (b)


(nm)

3400 K

2200 K

2600 K

3000 KIntensità relativa

Emissione luminosa diun corpo incandescente

Regione del visibile- lampade a filamento di tungsteno (bulbo in vetro)• temperatura di esercizio ~ 3000 K• intervallo utile di ~ 2200 ÷ ~ 350 nm

- lampade a tungsteno/alogeno (bulbo in quarzo)• temperatura di esercizio ~ 3500 K• intervallo utile di ~ 2500 ÷ ~ 240 nm• vita media doppia rispetto alla precedente

Wsublimato + I2 WI2 (gas)

W + I2

filamento caldo

si rideposita sul filamento

Regione dell’UV- lampade a scarica elettrica in vapori di deuterio (bulbo in quarzo)• intervallo utile di ~ 380 ÷ ~ 160 nm• meccanismo di emissione legato all’eccitazione di D2:

ED2* = ED’ + ED’’ + h

ED’ e ED’’ : energie cinetiche dei due atomi di deuterio

ED’ + ED’’ può variare in modo continuo tra 0 e ED2*, quindi anche h può farlo: il risultato è uno spettro di emissione continuo

D2 D2* D’ + D” + h

Scarica elettrica

Fotonedi luce

- lampade a scarica elettrica in vapori di mercurio (bulbo in quarzo)• spettro di emissione a righe (UV e visibile)• usi analitici particolari soprattutto nella regione dell’UV

Gli spettrofotometri hanno quindi al loro interno due diverse lampade, una per il visibile e l’altra per l’UV opportunamente intercambiate. Nei modelli più recenti

un’unica lampada allo xenon copre tutto lo spettro (~ 200 ÷ ~ 1100 nm)

Selezionatori di lunghezze d’ondaHanno la funzione di scomporre la radiazione policromatica in bande il più possibile monocromatiche. Sono di due tipi: filtri e monocromatori.

La caratteristica principale, in entrambi i casi, è l’ampiezza della banda passante:intervallo di radiazioni che emerge dal selezionatore con un’energia almeno pari al 50% di quella della radiazione nominale

Lunghezza d’onda

lunghezza d’onda nominale


FiltriUsati nei colorimetri fotoelettrici

Filtri di assorbimento:• ampiezza di banda 30 ÷ 250 nm• trasmittanza 5 ÷ 30%• uso nel visibile (vetro)

Filtri a interferenza:• ampiezza di banda 5 ÷ 20 nm• trasmittanza 50 ÷ 60%• uso nel visibile e UV• costo più elevato

MonocromatoriConsentono di selezionare con continuità le radiazioni di qualsiasi lunghezza d’onda

Monocromatore a prisma

Quando una radiazione luminosa attraversa la superficie di separazione di due mezzi trasparenti, il raggio rifratto si piega verso la normale alla superficie se il secondo mezzo

è più denso del primo. L’angolo di rifrazione r è funzione della della radiazione.

n1 : indice di rifrazione dell’arian2 : indice di rifrazione del prismai : angolo di incidenzar : angolo di rifrazione

Schema ottico di un monocromatore a prisma

fenditura diingresso

lente collimatrice

prisma

lentefocalizzatrice

fenditura diuscita

1

2

Ssorgente

50

Scomposizione spettrale operata da tre diversi tipi di monocromatori

N.B. : nel visibile, il prisma di vetro è preferibile a quello di quarzo (maggiore dispersione)!

assorbimento

400 500 600 700200 nm

prisma divetro

200 nm 300 350 400 500 700

prisma diquarzo

400200 nm 300 500 600 700

monocromatorea reticolo

Sorgenteradiante

Sorgenteradiante

Sorgenteradiante

Immagine di una fenditura di larghezza variabile su uno schermo illuminato con luce monocromatica

Fenomeno della diffrazione

Interferenza costruttiva e distruttiva di una radiazione monocromatica

intensità

tempo

Onde in concordanza di fase Onde in opposizione di fase

A

A

2A

m

Monocromatori a reticolo di diffrazioneSono di due tipi: reticoli di trasmissione e reticoli di riflessione

Reticoli di trasmissioneCostituiti da sottilissime fenditure (600 ÷ 2000/mm) incise su una superficie rivestita di alluminio. Ampiezza delle fenditure e distanza sono dello stesso ordine di grandezza delle radiazioni incidenti.

Comportamento delle radiazioniin un reticolo di trasmissione

a

m = passo del reticoloa = m sen

Le radiazioni si sommano solo se:m sen

(K = 0, 1, 2, 3…..)

http://www.youtube.com/watch?v=9UkkKM1IkKg&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=9UkkKM1IkKg&NR=1

Diffrazione di luce policromatica

Sorgenteradiante

frangia di ordine zero:luce biancaSpettro del 1° ordine

Ovviamente nello spettro del 1° ordine, come di quelli successivi, sono da includere anche le radiazioni appartenenti a regioni diverse dal visibile!

Dispersione di luce bianca attraverso un reticolo di trasmissione

Gli spettri dei vari ordini sono tutti lineari in funzione della lunghezza d’onda,cioè la dispersione è costante in tutte le zone dello spettro!

Cozzi, Protti, Ruaro

Reticoli di riflessioneCostituiti da una serie di solchi (100 ÷ 2000/mm) tracciati sopra una superficie riflettente, piana o concava.

I reticoli più comuni sono quelli a gradini:

In questo caso, sono i raggi riflessi a dar luogo ai fenomeni di interferenza costruttiva o

distruttiva del tutto simili a quelli ottenuti con i reticoli di trasmissione

Esempio di diffrazione osservabile guardando con luce radente un comune compact disc!

Cellette di assorbimento (cuvette)Hanno la funzione di contenere la soluzione in esame e quella del riferimento

Hanno volume variabile e spessore (cammino ottico) che può variare da pochi mm ad alcuni cm (di solito 1 cm)

Cuvette in vetro o materiale plastico (polistirene, metacrilato)

visibile

Cuvette in quarzoUV, visibile

RivelatoriSono trasduttori che convertono l’energia radiante in corrente elettrica misurabile con

un galvanometro. La corrente elettrica che si genera è direttamente proporzionaleall’intensità della radiazione luminosa.

Relazione di Einstein per l’effetto fotoelettrico:

h = E0 + ½ mv2

energiafotone

potenziale ionizzazionedel metallo

Energia cinetica

dell’elettrone

Fototubi e fotomoltiplicatoriIl loro funzionamento si basa sull’effetto fotoelettrico

Fototubi

Il catodo è ricoperto da uno strato di materiale fotoemissivo (generalmente cesio)


Involucro di vetro o quarzo sotto

vuoto

Catodo

Anodo a filamento

Fascio di fotoni

elettroni

90 V

Amplificatoree misuratore

FotomoltiplicatoriSimili ai fototubi ma molto più sensibili. Si basano sul fenomeno dell’emissione secondaria.

Producono correnti 105 ÷ 107 volte più intense di quelle di un fototubo per cui possono essereusati solo per misure di bassi valori di intensità luminosa!


Griglia

Radiazione

Catodo fotoemissivo

Dinodi D1-D9

Numerosi elettroniper ogni fotone

Numerosi elettroniper ogni elettrone

Involucrodi quarzo

Anodo

Sezione trasversale

Dinodi

CatodoAnodo

90 V

900 V

Involucrodi quarzo

Amplificatore

Lettura

Rivelatori a serie di fotodiodi (DAD)

Fotodiodo: dispositivo costituito da una giunzione tra un semiconduttore di tipo p ed uno di tipo n

Semiconduttore: materiale la cui conducibilità elettrica è intermedia tra quella di un conduttore(metallo) e quella di un isolante

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Si

Esempio: silicio cristallino

La conducibilità elettrica è legata all’eccitazione termica di un elettrone (di conduzione)che lascia una lacuna positiva anch’essa mobile come l’elettrone

Semiconduttore di tipo n: semiconduttore drogato con eccesso di elettroni di conduzione


Esempio: silicio cristallino drogato con un elemento del V gruppo (As)

Semiconduttore di tipo p: semiconduttore drogato con eccesso di lacune elettroniche

Esempio: silicio cristallino drogato con un elemento del III gruppo (Ga)


Schema di un fotodiodo al silicio

Giunzione pnContattometallico Buca

Elettrone

ConduttoreRegione p Regione n

Regione p Regione n

Polarizzazione diretta Polarizzazione inversa

Regione p Regione n

Strato dideplezione

Le condizioni di polarizzazione inversa sono quelle utilizzate nei rivelatori DAD

Schema ottico di uno spettrofotometro con rivelatore DAD

Acquisizione dello spettro in tempo reale! La sensibilità del DAD è intermedia tra quella di un fototubo e quella di un fotomoltiplicatore.


Sorgente

Otturatore

Specchio

Cella

Specchio

Reticolo di diffrazione

Fenditura

Serie difotodiodi

Schema ottico di spettrofotometro a raggio singolo

Sorgente hMonocromatore

Schermo

Cuvetta diriferimento

Cuvetta delcampione

Rivelatore

Amplificatore

Lettore

I0

Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nello spazio


Sorgente

Monocromatore

Schermo


I

I0

Cuvetta delcampione

Rivelatore 1

Rivelatore2

Amplificatoredifferenziale

Lettore

Beamsplitter

Specchio

h

Schema ottico di spettrofotometro a doppio raggio nel tempo


Sorgente

hMonocromatore


Cuvetta delcampione

Specchio

Trasparente

Specchioa settori

Motore

Vista frontale

Specchio

Cuneoottico

Specchioa settori Rivelatore

Amplificatore

Lettore

I

I0

Titolazioni spettrofotometricheSi misura l’assorbanza di una soluzione ad una lunghezza d’onda opportuna dopo l’aggiunta di incrementi noti di titolante.

A A A

V V V

A + B C

A = C = 0B > 0

B = C = 0A > 0 A = B = 0

C > 00

Celletta per titolazioni spettrofotometriche

agitatore foro perburetta

finestre diquarzo

A

V

0

A A

V V

A = 0B > C > 0

C = 0A > B > 0

A = 0C > B > 0

Per ridurre l’effetto della diluizione, si impiegano soluzioni concentrate di titolante osi correggono i dati sperimentali:

Assorbanza corretta = Assorbanza osservata Volume totale Volume iniziale

Analisi quantitativa in assorbimento

La spettrofotometria di assorbimento nel visibile e nell’UV è una delle tecniche di piùampio utilizzo nell’analisi quantitativa strumentale.

Caratteristiche salienti:

• Ampia applicabilità

• Alta sensibilità (fino a 10-7 M)

• Selettività da moderata ad alta

• Buona accuratezza

• Facilità e convenienza

Saggi immunologici: si basano sull’uso di anticorpi specifici per l’analita (proteina)

SAGGIO IMMUNO-ENZIMATICO ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

L’enzima può trasformare, ad es., un reagente incolore in prodotto colorato (dosaggio colorimetrico) oppure un reagente non fluorescente in prodotto fluorescente (dosaggio fluorimetrico).La quantità di prodotto colorato o fluorescente ottenuto è proporzionale alla concentrazione di analita.

Esempio di applicazione della spettrofotometria in campo biologico

FLUORIMETRIAFLUORIMETRIAE’ un metodo di analisi basato sul fenomeno della fluorescenza.E’ un metodo di analisi basato sul fenomeno della fluorescenza.

Fluorescenza: processo nel quale gli atomi o le molecole, eccitate mediante assorbimento di radiazioni elettromagnetiche, rilassano allo stato fondamentale cedendo l’eccesso di

energia come fotoni.

L’emissione di radiazioni fluorescenti avviene a lunghezze

d’onda maggiori (frequenza

ed energia minori) rispetto alle radiazioni assorbite (spostamento

o shift di Stokes)


La fluorescenza è possibile solo in presenza di cromofori con particolare distribuzione dei livelli energetici (fluorofori). Le transizioni elettroniche coinvolte sono sempre le stesse:

* n *

Molti composti fluorescenti contengono anelli aromatici specie se condensati. La fluorescenza è inoltreparticolarmente favorita in molecole rigide. Ad esempio:

H

H

HH

Trans-stilbene(fluorescente)

Cis-stilbene(non fluorescente)

O

O

O

OHHO

O

O

OHHO

Fluoresceina(fluorescente)

Fenolftaleina(non fluorescente)

La fosforescenza è un fenomeno simile alla fluorescenza. Per capirne la differenza occorreprendere in considerazione gli stati di singoletto e tripletto:

Nello stato fondamentale le molecole sono generalmente nello stato di singoletto (spin elettronici appaiati). Nello stato eccitato possono assumere invece

sia lo stato di singoletto che di tripletto (coppia di spin elettronici spaiati).

Fluorescenza

singoletto eccitato singoletto fondamentale Transizione probabile e rapida (< 10-5 sec)

Fosforescenza

tripletto eccitato singoletto fondamentale Transizione poco probabile e più lenta (> 10-3 sec)


Analisi fluorimetrica

Spettri di eccitazione:

Eccitazione a variabile

Misurazione intensità di fluorescenzaa fissa (di solito max)

In teoria, spettri di assorbimento e di eccitazione dovrebbero coincidere

Spettri di emissione:

Eccitazione a fissa (di solito max)

Misurazione intensità di fluorescenzaa variabile

In genere, spettri di emissione e di eccitazione appaiono come immagini speculari l’uno dell’altro


Esempio: spettro di eccitazione (a) e spettro di emissione (b) dell’antracene in etanolo

antracene

statofondamentale

statoeccitato

statofondamentale

statoeccitato

Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza

E’ possibile dimostrare che:

If = S F I0 (1 – 10 –abc)

If = intensità radiazione fluorescente

I0 = intensità radiazione di eccitazione

a = coefficiente di estinzione alla di eccitazione

b = spessore della soluzione (cammino ottico)

c = concentrazione della soluzione

S = costante di proporzionalità (≤ 1) legata all’efficienza quantica del campione (rapportotra fotoni emessi e fotoni assorbiti)

F = costante di proporzionalità (≤ 1) legata alla resa strumentale (rapporto tra fotoni misurati e fotoni emessi)

Fattori che determinano la non linearità tra If e concentrazione:

• diminuzione di I0 nell’attraversamento della soluzione

• differente assorbimento della stessa radiazione fluorescente in funzione del cammino ottico percorso

Solo per soluzioni molto diluite si ha con buona approssimazione:

If = SFI0 abc If = K c

If = S F I0 (1 – 10 –abc)

concentrazione

SFI0If


Autospegnimento (self-quenching)Una molecola di analita assorbe energia da un’altra molecola di analita eccitata con trasferimento di energia non radiante che alla fine viene dissipata sotto forma di calore. Aumenta con la concentrazione.

AutoassorbimentoSi verifica quando la di emissione si sovrappone ad una banda di assorbimento. Aumenta anch’essacon la concentrazione.

Nell’analisi quantitativa occorre assicurarsi dell’assenza di quenching!

Processi di spegnimento (quenching)

Processi nei quali l’emissione da parte di una molecola eccitata diminuisce in intensità a causa deltrasferimento di energia ad un’altra molecola (spegnitore o quencher). Lo spegnitore eccitato può quindidissipare la sua energia attraverso altri processi.

Un esempio tipico di quencher è rappresentato da O2 :

M* + O2 M + O2*molecola allostato eccitato tripletto

fondamentale

singolettoeccitato

molecola allostato fondamentale

Fluorimetri e spettrofluorimetriLa differenza sta nel selezionatore di radiazioni elettromagnetiche: filtri per i fluorimetri,reticoli di diffrazione per gli spettrofluorimetri.

Sorgenti radiantiDevono produrre radiazioni di elevata energia (l’intensità di fluorescenza, come già visto, è funzione dell’intensità di eccitazione) concentrata nell’UV: lampade a vapori di Hg o lampade allo xenon.

Selezionatori di Sono normalmente due (filtri o reticoli), uno per il lato di eccitazione e l’altro per quellodi emissione.

RivelatoriE’ indispensabile l’impiego di fotomoltiplicatori a causa dei bassi livelli di energia tipici dell’emissione fluorescente.

L’emissione fluorescente è prelevata di solito a 90° rispetto al raggio incidente. Vantaggi:• rivelazione della sola radiazione di fluorescenza (e non eventualmente di quella di eccitazione)• maggiore intensità di fluorescenza emessa dai primi strati della soluzione del campione

Schema ottico di uno spettrofluorimetro


Applicazioni della fluorimetriaPur se di uso meno esteso rispetto alla spettrofotometria, la fluorimetria può essere applicata a numerosi composti sia organici che inorganici. Per questi ultimi si ricorre ad agenti complessanti come ad esempio:


Vantaggi dell’analisi fluorimetrica:

• selettività potenzialmente superiore alla spettrofotometria

• sensibilità superiore alla spettrofotometria ottenuta aumentando la potenza I0 delle radiazioni di eccitazione (limite di rivelabilità 10-8 - 10-9 M)

If = S F I0 (1 – 10 –abc) mentre A = abc = - log T = - log I0/I

Lenergia associata ad ogni radiazione è definita dalla legge di Planck: E = h E = h Campo magnetico...

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