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L’ELETTROFORESI:
UNA VALUTAZIONE
QUALITATIVA
Barbara Barbieri
Laboratorio Analisi Cliniche
IRCCS Istituto Clinico HumanitasAssociazione Medici Rho
PROTEINE DEL SANGUE
Le proteine del sangue costituiscono un gruppo
eterogeneo di proteine, ognuna delle quali possiede
una funzione specifica ed è soggetta a specifiche
variazioni di concentrazione in diverse condizioni
fisiologiche e patologiche.
La misura delle concentrazione delle proteine è quindi
un valido aiuto nella diagnosi e nella gestione di
diverse condizioni fisiopatologiche.
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PROTEINE DEL SANGUE
Catene polipeptidiche di aa combinate con altre sostanze(lipoproteine, glicoproteine…)
SIERO: albumina + globulinePLASMA: albumina + globuline + fibronogeno +
fattori della coagulazione
SINTESI: - epatociti (albumina e globuline)- plasmacellule (immunoglobuline)- intestino (lipoproteine)
METABOLISMO: rapido: rinnovate giornalmente il 9%(epatiche) e 10-25% (circolanti)Associazione Medici Rho
CATABOLISMO: fegato
PERDITE: - app. gastroenterico (tutte)
- rene (selettivo)
- gh. esocrine
- app. respiratorio
FUNZIONI: - nutrizione
- mantenimento pressione oncotica
- mantenimento equilibrio acido-base
- trasporto
- enzimi
- anticorpiAssociazione Medici Rho
PROTEINE SIERICHE
ALBUMINA - 45-70% delle proteine totali del siero
- sintesi epatica
- funzione colloido-osmotica e di trasporto
GLOBULINE
Alfa e Beta – sintesi epatica
- lipoproteine, proteine della fase acuta
- IgA e IgM
Gamma - immunoglobuline (IgG, IgE e IgM)
- da plasmacelluleAssociazione Medici Rho
MIGRAZIONE ELETTROFORETICA:UNA TECNICA QUALITATIVA
Il termine elettroforesi indica un movimento, sottol’influenza di un campo elettrico, di ioni o di molecoledi diversa grandezza, provviste di carica netta edisciolte in soluzione.
Le proteine in soluzione sono facilmente ionizzabili e sidissociano in ioni R-COO- oppure ioni R-NH3+
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ELETTROFORESI SU GEL D’AGAROSIO
Le proteine vengono sottoposte all’azione di un campoelettrico in un mezzo a pH basico
La velocità di migrazione, dal catodo verso l’anodo,dipende da -carica
-massa
-forma
Albumina è la più veloce (piccola e anionica)
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Permette una ottimaleseparazione delle bandeelettroforetiche e unavalutazione visiva insenso qualitativo equantitativo (intesacome intensità dellabanda) delle varieproteine.
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ELETTROFORESI CAPILLARE ZONALE (CZE)
Applico differenza di potenziale tra le estremità di uncapillare di silice, contenente un tampone a pH basico.
Le molecole del tampone che hanno caricaprovocano un flusso elettroendosmotico (EOF)dall’anodo verso il catodo.
Le molecole del campione di siero migrano tutte verso ilcatodo per effetto dell’EOF, ma con differentevelocità, a seconda della loro vel. di migrazioneelettroforetica (dipende dalla carica).
Le molecole cariche raggiungono prima il catodo.
Le proteine si separano in diverse zone (dall’anodo alcatodo): prealbumina, albumina, α1,α2, β1, β2 e γ.
+
+
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Si ottiene un grafico, chiamato
ELETTROFEROGRAMMA, dove le varie zone di
migrazione delle proteine sono rappresentate come
picchi, di diversa altezza a base più o meno larga, che
rispecchiano la quantità proporzionale delle proteine
sieriche.
AUMENTI o DIMINUZIONI in ALTEZZA o del
NUMERO di picchi sono da mettere in relazione
all’aumento/diminuzione fisiologica o patologica delle
proteine che lo compongono.Associazione Medici Rho
TRACCIATO ELETTOFORETICO NORMALE
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Valori normali frazioni proteine sieriche (adulti)
% del tot g/dL
Albumina 45-70% 4.2
Alfa 1 2-5% 0.2
Alfa 2 8-14% 0.8
Beta 10-15% 0.9
Gamma 11-22% 1.2Associazione Medici Rho
VARIAZIONI FISIOLOGICHE
Alla nascita: conc < 5 g/dL, poche globuline
Assunzione di colostro: aumento delle proteine, che tra i6- 12 mesi raggiungono valori normali
Anziano: aumento delle globuline (IgG e prot. faseacuta)
diminuzione dell’albumina
Gravidanza: diminuzione globuline e proteine totali
Lattazione: diminuzione albumina e proteine totaliAssociazione Medici Rho
VARIAZIONI PATOLOGICHE
Discrasia proteica: anomalie qualitative
(proteine con struttura anormale)
Disproteinemie: anomalie qualitative o quantitative
IPERPROTEINEMIE:
1. non selettive (emoconcentrazione): tutte lefrazioni
2. Selettive: alcune frazioni
a. Infiammazione (infezioni virali, batteriche,necrosi, neoplasie)
b. Infiammazioni o Neoplasie dei Linfociti BAssociazione Medici Rho
Infiammazione
Stimola sintesi di Globuline (da epatociti)
e di Ig (da plasmacellule)
1. Proteine di fase acuta positive (entro poche ore)
regione α: - α1-antitripsina
- α2-macroglobulina
- aptoglobina
regione β: - proteina C reattiva
- Transferrina
- β-lipoproteine Associazione Medici Rho
2. Proteine di fase acuta negative (dopo 1settimana)
albumina e transferrina
3. Proteine della fase cronica (dopo 1-3settimane)
IgG e C3 complemento
Gammapatia policlonale
Infiammazione
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Infiammazione o Neoplasia dei Linfociti B
Causano Gammopatie ( zona β e γ), che possono essere:
1. Policlonali
molte classi: picco con base ampia in γ o β
Dovute a stimolo antigenico cronico (patologieinfettive o epatiche)
2. Monoclonali
1 sola classe di Ig: picco con base stretta in γ o β
Dovute a neoplasie delle plasmacellule, disordinilinfoproliferativi (linfociti B) o patologie nonneoplastiche (Leishmaniosi)
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IPOPROTEINEMIE
1. Emodiluizione
2. Aumentata perdita dallo spazio vascolare
3. Diminuita sintesi e/o aumentato catabolismoproteico
4. Mancato trasferimento degli Ab materni
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PREALBUMINA o TRANSTIRETINA
E’ la frazione più veloce. Chiamata così perché migradavanti all’albumina. E’ visibile come tenue banda sultracciato. La sua individuazione costituisce uncontrollo tecnico di buona separazioneelettroforetica. La sintesi avviene principalmente nelfegato e in parte anche nella retina ed in altri tessuti.E’ il vettore sia per la tiroxina che per la proteinalegante il retinolo.
La concentrazione sierica diminuisce molto nei casi dideficit nutrizionali proteici, nelle lesioni delle celluleepatiche, nel diabete. E’ una proteina negativa dellafase acuta.Associazione Medici Rho
ALBUMINA
Il dosaggio dell’albumina è un ottimo indice dellafunzionalità epatica.
E’ una proteina di trasporto (bassa specificità edaffinità ed amplissima capacità -farmaci, bilirubina,acidi grassi, metalli ed ormoni-).
La concentrazione plasmatica dell’albumina diminuiscenei processi infiammatori.
Nella corsa elettroforetica, la frazione albuminicaappare come singola banda.
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PREALBUMINASindrome nefrosica(perdita TGB)
Epatopatie,
infiammazioni
infezioni, neoplasie,
malnutrizione
ALBUMINA
Ridotta sintesi
Perdite (nefropatie)
Aument. permeabilitàcapillare (infiammaz)
Aumentata mobilità
(Bisalbuminemia –transitoria)
Itteri, penicellina,pancreatiti, sindromenefrosica
Doppia banda
(Alloalbuminemia –ereditaria)
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ANALBUMINEMIA
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BISALBUMINEMIA
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ALLOALBUMINEMIA
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α1-ANTITRIPSINA
Glicoproteina. Sintetizzata nel fegato come formaimmatura (propeptide), contenente una sequenzasegnale che viene rimossa prima dell’emissione incircolo, dove costituisce la maggiore componente delleproteasi circolanti. E’ sintetizzata dagli epatociti, daimacrofagi ma anche in altri tessuti (rene, pancreas,stomaco, intestino, milza, surrene). Agisce comeinibitore della tripsina pancreatica, chimotripsina,trombina, proteina C attivata, fattori XI e XIII.
Inibisce l’elastasi prodotta dai neutrofili durante iprocessi infiammatori acuti (riduzione demolizione deltessuto), soprattutto a livello polmonare.Associazione Medici Rho
2-MACROGLOBULINA
Glicoproteina. Sintetizzata dal fegato. Inibitore diproteasi, ma aspecifico. Agisce solamente nel sangue enon nei tessuti a causa delle sue grosse dimensioni.Modulatore dell’attività delle citochine. Aumentafisiologicamente nel 3° trimestre della gravidanza,nell’infanzia e nell’età avanzata. Aumenti patologici sihanno nell’infiammazione acuta, nelle epatopatie, neldiabete.
APTOGLOBINA
Glicoproteina. Lega l’emoglobina libera. Ogni molecoladi aptoglobina lega due molecole di ossiemoglobina . Lasua concentrazione aumenta dalla nascita fino all’etàadulta. Diminuisce per iperconsumo in tutti i casi diemolisi intravascolare e per difetto di sintesi incondizione di riduzione del numero di epatociti. Puòdiminuire anche in seguito a sport prolungati, checomportano distruzione di eritrociti. E’ una proteinadella fase acuta.
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α1-ANTITRIPSINA polimorfismoVarianti genetiche
(Eterozigosi)
Infiammazione acuta;
Estrogeni
Deficit genetico
α2-MACROGLOBULINA
Nei bambini;
Proteinuria selettiva
Iperconsumo dafibrinolisi
APTOGLOBINAInfiammazioni acute
(nefrosi)
Emolisi intravascol.,eritropoiesi ineffic.,splenomegalia
ZONA α
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DIMINUZIONE DI α1-ANTITRIPSINA
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ETEROZIGOSI DI α1-ANTITRIPSINA
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INFIAMMAZIONE ACUTA
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TRANSFERRINA (in β1)
Glicoproteina. Lega e trasporta in modo reversibile loione ferrico. Costituisce la maggiore proteinaplasmatica legante il ferro (nel plasma 200-400mg/dl). La sua concentrazione presenta variazionicircadiane e infradiane. Aumenta nelle sideropenie ediminuisce negli accumuli di ferro.
Le sue funzioni principali sono:
- trasporto di ferro assorbito dall’intestino alle celluleche lo richiedono
- fattore protettivo contro cellule batteriche eneoplastiche in quanto compete con esse per l’utilizzodi ferro.Associazione Medici Rho
C3 COMPLEMENTO (in β2)
Proteina della fase acuta che aumenta moltolentamente e richiede 2-10 giorni per raggiungere ilmassimo livello dopo un’infiammazione.
E’ la proteina del complemento presente in più alteconcentrazioni. Svolge un ruolo importante nellereazioni proteolitiche nelle vie di attivazione delcomplemento. Unica proteina del complementoidentificabile tramite elettroforesi.
β2 -MICROGLOBULINA:
Costituisce la catena leggera degli antigeni delcomplesso maggiore di istocompatibilità (MHC) e sitrova sulla superficie di tutte le cellule che esprimono
questo antigene.Associazione Medici Rho
TRANSFERRINADeficit di Fe,
Indotta da estrogeni
Perdite (nefropatie),
Malnutrizione,
Infiammazione
β-LIPOPROTEINE Dislipidemie
C3 COMPLEMENTOInfiammazionecronica,
Ostruzione biliare
Difetto di sintesi,
Iperconsumo (Lupus)
IgAInfiammazione delle
mucose, Cirrosi,
Artrite reumatoide
ZONA β
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AUMENTO DELLE TRANSFERRINA DOVUTOAD ANEMIA
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PONTE BETA-GAMMA
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COMPONENTE MONOCLONALE IN ZONA BETA
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ZONA
E’ costituita dalle diverse classi delle immunoglobuline.A causa della loro eterogeneità, le Ig si estendonodalla regione a quella e talvolta occupano anche lazona .
Le Ig sono l’espressione dell’attività secretoria didiversi cloni plasmacellulari.
In ordine di frequenza nel siero le Ig che troviamosono: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.
L’aumento policlonale di una classe di Ig si manifestacome un incremento diffuso in zona -
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GAMMAPATIE MONOCLONALI
La proliferazione di un singolo clone plasmacellulare
porta alla produzione di un’unica classe di Ig, dettamonoclonale.
La presenza di Ig patologiche si mette in evidenzaall’elettroforesi del siero come una banda netta chenella maggior parte dei casi si trova in zona , da qui ilnome di gammapatia monoclonale alla malattia e dicomponente monoclonale della proteina (CM).
Il termine CM si riferisce quindi a qualunque bandaimmunoglobulinica che sia costituita da un solo tipo dicatena pesante e da un solo tipo di catena leggera.
La frequenza è 1-2% nella popolazione al di sopra dei25 anni ed aumenta al 3-7% negli ultrasettantenni.
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Immunoglobuline
MONOCLONALE(Maligne, es. mieloma)
OLIGOCLONALE(Infezioni virali)
POLICLONALE(Infiammazioni croniche;
Lupus,Cirrosi,Collagenopatie)
Immunodeficienza
Ipogammaglobulinemia(linfoma)
Agammaglobulinemia(legata al sesso)
ZONA γ
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IPOGAMMAGLOBULINEMIA
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IPERGAMMAGLOBULIMENIA
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COMPONENTE MONOCLONALE INIPOGAMMAGLOBULINEMIA
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PROFILO BICLONALE
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PROFILO OLIGOCLONALE
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PROFILO POLICLONALE
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