Le Tecniche di P.M.A.

Università degli Studi di Messina Dipartimento di Scienze Ginecologiche Ostetriche e

Fisiopatologia della Riproduzione

Messina 05 giugno 2012

Una coppia è considerata infertile quando non è stata in grado di concepire e di procreare un bambino dopo 12/24 mesi di rapporti sessuali non protetti, mentre èsterile la coppia nella quale uno o entrambi i coniugi sono affetti da una condizione fisica permanente che non rende possibile la procreazione

Art. 7 – Legge n° 40/2004

Abate Lazzaro Spallanzani(1729 – 1791)

Sacerdote della congregazione della Beata Vergine di Modena

Docente di storia naturale all’ Università di Pavia

Nel 1765 pubblica il saggio sugli “animaletti”

Nel 1783 ottiene la nascita di tre cuccioli mediante F.A. e

diede inizio alla storia di questo metodo procreativo

Nel 1937 si fonda a Pavia il primo centro per la F.A. in campo animale a lui dedicato, che ha permesso di ricostruire il patrimonio zootecnico italiano dopo la decimazione della prima guerra mondiale.

Nel 1949 J. Hammonds sviluppa in vitro embrioni di topo oltre 8 cellule

Nel 1959 Chang porta a termine la prima nascita dopo I.V.F nel topo

Nel 1965 R. Edwards presenta i primi esperimenti su colture di ovociti umani

Robert Edwards(Nobel Medicina 2010)

Patrick Steptoe

Louise Brown

25 luglio 1978Oldham Hospital Manchester

1984

Ettore Cittadini

Domenico Geraci

Annunciano la nascita della prima bambina italiana con

tecniche di PMA

L’infertilità di coppia rappresenta un importante problema medico e sociale, interessando circa il 15 – 20 %

delle coppie in età fertile nei paesi industrializzati.

EpidemiologiaEpidemiologia

ISS 4ISS 4°° report 2009report 2009

Infertilità maschile (35,4 %)

Infertilità femminile (35,5 %)

Infertilità maschile e femminile (15 %)

Infertilità idiopatica (13,2 %)

Altro (1%)

Linee guida 2008

ISS 4ISS 4°° report 2009report 2009

ISS 4ISS 4°° report 2009report 2009

CAUSE PRE-TESTICOLARI

IPOTALAMO IPOFISARIE

CAUSE TESTICOLARI

DANNI TESTICOLARI

CAUSE POST -TESTICOLARI

EPIDIDIMARIE

PROSTATICHE

VESCICOLARI

EIACULATORIE

InfertilitInfertilit àà maschilemaschile

FSH ED LH

NORMALI / RIDOTTI

T < 1,0

IPOGONADISMO IPOGONADOTROPO

IDIOPATICO

S. DI KALLMANN

ADENOMI NON FUNZIONANTI

SELLA VUOTA

IPER-PRLFSH ED LH

NORMALI / RIDOTTI

T >1,0; PRL ELEVATA

PRL-OMI

FARMACI

LESIONI PEDUNCOLO

CAUSE PRE TESTICOLARI

IPOTALAMO IPOFISARIE

FSH ED LH

NORMALI - ELEVATI

T NORMALE

IPOGONADISMO NORMOGONADOTROPO

??

MICRODELEZIONI CROMOSOMA Y

MALDISCESA E RETRATTILITA’

VARICOCELE

C. AMBIENTALI / LAVORATIVE

OBESITA’

FARMACI

RECETTORE ANDROGENICO

CAUSE TESTICOLARI

DANNI TESTICOLARI

FSH, LH, T, PRL

NORMALI

NORMOFUNZIONE

ENDOCRINA

???

FLOGOSI

ANOMALIE STRUTTURALI

VARICOCELE

C. AMBIENTALI / LAVORATIVE

ANOMALIE SVUOTAMENTO (LESIONI MIDOLLO SPINALE)

FARMACI

RECETTORE ANDROGENICO

CAUSE POST -TESTICOLARI

EPIDIDIMARIE

PROSTATICHE

VESCICOLARI

EIACULATORIE

OLIGOSPERMIA MODERATA

> 5 MILIONI SPZ MP/ ml

Su Seme intero

In assenza di fattore femminile e/o disfunzione ovulatoria trattata

PCT - Positivo

PCT - Negativo

Trichomonas

Muco Cervicale

cristallizzazioni

atipica

Muco ostile

cristallizzazioni

terziarie e

quaternarie

Muco ideale

Assisted Reproductive TechnologyAssisted Reproductive Technology

Intrauterine Insemination (I.U.I)

Direct intraperitoneal insemination (D.I.P.I)

Fallopian tube sperm perfusion (F.S.P) or intrafallopian insemination (I.F.I)

Peritoneal oocyte sperm transfer (P.O.S.T)

In vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET)

Zygote intrafallopian transfer (Z.I.F.T),

Pro-nuclear stage tubal transfer (P.R.O.S.T),

Tubal embryo stage transfer (T.E.S.T),

Tubal embryo transfer (T.E.T), or embryo intrafallopian transfer (E.I.F.T)

Surgical embryo transfer (S.E.T) or transmyometrial embryo transfer (TM-ET)

Direct oocyte transfer (DOT)

Intravaginal culture (IVC)

In Vitro Fertilization Embryo Transfer (FIVET)

Intra cytoplasmic Sperm injection (ICSI)

In vitro oocyte maturation (IVM)

IMSI (Intracytoplasmic Morphologically selected Sperm injection)

pICSI (physiologycal Intracytoplasmic selected Sperm injection)

• IUI (Intra Uterine Insemination)

• GIFT (Gamete Intra Fallopian Transfer)

• IVF (In Vitro Fertilization)

• ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection)

Assisted Reproductive TechnologyAssisted Reproductive Technology

OLIGOSPERMIA SEVERA

≥ 2 MILIONI SPZ MP ≤ 5

≥ 4 % F.N.

Dopo Trattamento

≥ 4 % F.N.

Dopo Trattamento

6.7 →2.1% < 1 mil/ml spz

< 2 mil/ml spz

< 5 mil/ml spz12,8 →5.3%

Tecniche di preparazione del liquido seminale

Swim up da strato:

stratificazione di una aliquota di

terreno di coltura (0,3-0,5ml di

Ham’s f10) su 1 ml di liquido

seminale e incubazione per 45

minuti.

Swim up da pellet:

diluizione 1:2 di terreno di coltura-seme, miscelazione delle due frazioni e centrifugazione a 21 G per 10 minuti. Eliminazione del surnatante, aggiunta di terreno di coltura fino ad un volume max di 0,5 ml e incubazione per 45 minuti.

Tecniche di preparazione del liquido seminale

Gradiente di densità:

45 %

Incubazione inHAMS F10

90 %

seme

Pellet + lavaggio

Isolate 90% + semeCentrifugazione a 21 G

Tecniche di preparazione del liquido seminale

Le tecniche di preparazione del liquido seminale sono finalizzate al medesimo scopo: selezionare gli spermatozoi migliori per eseguire le inseminazioni.

L’efficienza di tali tecniche invece fa riferimento alla percentuale media massima di spermatozoi recuperati in seguito alla loro applicazione e dipende sia dalle caratteristiche del campione di partenza che dalla tecnica utilizzata.

È compito di un operatore esperto discriminare tra le tecniche la più appropriata atta a garantire la migliore qualità e quantità nemaspermica iniettabile

Seme pre-trattamento

AIH - Seme post trattamento

Main indications for insemination with husband’s/partner’s semen

Ejaculatory failure

Anatomical ( hypospadias )

Neurological (spinal cord injury )

Retrograde ejaculation (multiple sclerosis )

Psychological (impotence )

Cervical factor

Cervical mcus hostility , Poor cervical mucusu

Immunological

Male and female antisperm antibodies

Unexplained infertility

Gamete Intra-Fallopian Transfer(GIFT)

Un mix di ovociti e spermatozoi trattati vengono trasferiti nella tuba durante una laparoscopia

OLIGOSPERMIA SEVERA

≥ 0,5 MILIONI SPZ MP/ ml ≤ 1

≥ 4 % F.N.

Dopo Trattamento

Indications :Indications :

Tubal diseaseTubal disease

EndometriosisEndometriosis

Unexplained infertilityUnexplained infertility

Immunological infertilityImmunological infertility

Male factor Male factor

Fertilization In Vitro Embryo Transfer(FIVET)

FIVET - DEMO

FIV - piastra

OLIGOSPERMIA SEVERA

< 1 MILIONI SPZ MP Totali

≥ 4 % F.N.

Dopo Trattamento

Indications for intracytoplasmic sperm injection

Ejaculated sperm• Oligozoospermia• Asthenozoospermia• Teratozoospermia• Antisperm antibodies• Repeated fertilization failure after conventional IVF-ET• Ejaculatory disordes (retrograde ejaculation)

Epididymal spermCongenital bilateral absence of the vas deferens• Failed vasoepididymostomy• Failed vasovasostomy• Obstruction of both ejaculatory ducts

Testicular sperm• All indications for epididymal sperm• Failure of epididymal sperm recovery because of fibrosis• Azoospermia because of testicular failure

(maturation arrest, germ - cell aplasia )• Necrozoospermia

TE.S.A. - Testicular Sperm Aspiration

M.E.S.E. - Microsurgical Epididimal Sperm Aspiration

P.E.S.A. - Percutaneous Epididimal Sperm Aspiration

TE.S.E. - Testicular Sperm Extration

TE.S.E

Cattura spermatozoo

ICSI

PZD-SUZI-ICSI

I.M.S.II.M.S.I

Osservazione ad alto ingrandimento: 6.300 X/13.000X dei vacuoli nucleari degli spermatozoi

p.I.C.S.Ip.I.C.S.I

In natura poco prima dell’ovulazione le cellule del cumulo subiscono un’espansione dovuta alla secrezione di una matrice amorfa contenenti alti livelli di acido ialuronico,

un glicosamminoglicano non solforato con proprietà adesive

Gli spermatozoi maturi, con corretto assetto cromosomico e basse % di frammentazione esprimono recettori di legame all’acido ialuronico (HA)

pICSI

Biopsia PB

Valutazione Trattamento

(FIVET – ICSI)

Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 0Day 0Recupero ovocitario

Preincubazione

Produzione seme

PreincubazionePreincubazionePreincubazione

Insemination mediumInsemination medium

No GlucosioNo GlucosioFosfatiFosfatiAA non essenzialiAA non essenzialiGlutamminaGlutammina

Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 1Day 1

Osservazione avvenuta fecondazione 16-18 h dalla ICSI / FIVET

1 PN1 PN 2 PN2 PN 3 PN3 PN

EMBRIONE A 4 CELLULE

Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 2Day 2

Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 3Day 3

EMBRIONE A 8 CELLULE

Cleavage MediumCleavage Medium

GlucosioGlucosioAA essenzialiAA essenzialiAA non essenzialiAA non essenzialiPiruvato Piruvato vitaminevitamineEDTAEDTA

BLASTOCISTI

Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 5Day 5--77

Embryo Transfer EcoguidatoEmbryo Transfer Ecoguidato

La tecnica del congelamento ha lo scopo di creare un gradiente di concentrazione che consente all’acqua di uscire dalla cellula e al

crioprotettore di entrare, anche se più lentamente.

I fattori che devono essere tenuti presenti sono:

• Contenuto intracellulare di acqua

• Permeabilità della membrana• Rapporto superficie/volume

della cellula

Gli ovociti hanno un basso rapporto superficie/volume e una quantitàrelativamente alta di acqua intracellulare, necessitano perciò di un raffreddamento più lento rispetto agli embrioni.

Curva di raffreddamento

-60-50-40

-30-20-10

0

102030

Tempo (min)

Tem

pera

tura

(°C

)

CrioconservazioneCrioconservazione

Embrioni 2pnEmbrioni 2pn--8C8C Ovociti MIIOvociti MIIDisidratazioneDisidratazione 1010’’ RT in 1,5 M PrOHRT in 1,5 M PrOH 1010’’ RT in 1,5 M PrOHRT in 1,5 M PrOH

Soluzione Congel.Soluzione Congel. 1,5 M PrOH + 0,1M Sacc.1,5 M PrOH + 0,1M Sacc. 1,5 M PrOH + 1,5 M PrOH + 0,3M0,3M SaccSacc

Curva Curva

CongelamentoCongelamentoRT to RT to ––77°°C a 2C a 2°°C/minC/min RT to RT to ––77°°C a 2C a 2°°C/minC/min

Stop per SeedingStop per Seeding ((--77°°C) per 8C) per 8’’ ((--77°°C) per 8C) per 8’’

Curva CongelamentoCurva Congelamento ((--77°°C) to (C) to (--3030°°C) a C) a

0,30,3°°C/minC/min((--77°°C) to (C) to (--3030°°C) a C) a

0,30,3°°C/minC/min

((--3030°°C) to (C) to (--8080°°C) a C) a

1010°°C/minC/min((--3030°°C) to (C) to (--8080°°C) a C) a

1010°°C/minC/min

Immersione in LNImmersione in LN22 Immersione in LNImmersione in LN22

Testart et al 1986Testart et al 1986

Protocollo di Congelamento lento

CrioconservazioneCrioconservazione

Embrioni 2pnEmbrioni 2pn--8C8C Ovociti MIIOvociti MIIIdratazioneIdratazione 1 M PrOH + 0,2M Sacc. 51 M PrOH + 0,2M Sacc. 5’’

RTRT1 M PrOH + 1 M PrOH + 0,3M0,3M Sacc. Sacc.

55’’RTRT

0,5 M PrOH + 0,2M Sacc. 0,5 M PrOH + 0,2M Sacc.

55’’RTRT0,5 M PrOH + 0,5 M PrOH + 0,3M0,3M Sacc Sacc

55’’RTRT

0,2M Sacc. 50,2M Sacc. 5’’ RTRT 0,3 M0,3 M Sacc. Sacc. 1010’’ RTRT

PBS 10PBS 10’’ RTRT PBS 10PBS 10’’ RTRT

Terreno di Terreno di

colturacolturaCleavageCleavage FertFert

Testart et al 1986Testart et al 1986

Protocollo di Scongelamento

Vitrificazione ovocitiVitrificazione ovociti

Disidratazione 2/3 minuti Sol ADisidratazione 2/3 minuti Sol BDisidratazione 2/3 minuti Sol C

Tuffo in N2 liquido

Crioconservazione SemeCrioconservazione Seme

2 volumi seme + 1 volume crioprotettore30 minuti a -20°C10 minuti sui vapori di N2 liquidoTuffo in N2 liquido

ComplicanzeComplicanze

Perforazione intestinalePerforazione di vasi

Eventi rari

Evento + frequente

Iperstimolazione ovarica severa – immagine R.M.

Iperstimolazione ovarica moderata

Iperstimolazione ovarica lieve (COH)

Follicolo cistico: 10 cm

ComplicanzeComplicanze

Prevenzione

Primaria: cercare di evitare la patologia

Identificazione di pazienti a rischio di OHSS : PCOS, giovane Identificazione di pazienti a rischio di OHSS : PCOS, giovane etetàà, basso peso, , basso peso,

precedenti OHSS, elevato precedenti OHSS, elevato numero di follicoli antrali;numero di follicoli antrali;

Iniziare la stimolazione con dosaggio basso di gonadotropineIniziare la stimolazione con dosaggio basso di gonadotropine

Monitoraggio ecografico e di E2 ravvicinato (numero follicMonitoraggio ecografico e di E2 ravvicinato (numero follicoli > 20/30 ed E2 > oli > 20/30 ed E2 >

2.500/6.000 pg/ml rappresenta un dato prognostico di OHSS)2.500/6.000 pg/ml rappresenta un dato prognostico di OHSS)

Prevenzione

Secondaria: prima della somministrazione di hCG

Sospensione del ciclo;Sospensione del ciclo;

Coasting: prolungamento dellCoasting: prolungamento dell’’intervallo tra lintervallo tra l’’ultima dose di ultima dose di FSH e la FSH e la

somministrazione di hCG (1somministrazione di hCG (1--4 gg)4 gg)

Induzione del picco endogeno di LH con GnRH agonista ad Induzione del picco endogeno di LH con GnRH agonista ad emivita piemivita piùù

breve (< 5 h) rispetto allbreve (< 5 h) rispetto all’’hCG (>24h) hCG (>24h) in prot. con antagonistain prot. con antagonista

Somministrazione di basse dosi di hCG (5000 U.I.)Somministrazione di basse dosi di hCG (5000 U.I.)

PrevenzioneSecondaria: dopo la somministrazione di hCG

Aspirazione di tutti i follicoli e asportazione di grosse quanAspirazione di tutti i follicoli e asportazione di grosse quantittitàà di di

cellule della granulosa;cellule della granulosa;

Crioconservazione degli embrioni: riduce lCrioconservazione degli embrioni: riduce l’’evenienza di forme evenienza di forme severe severe

della sindrome dopo impianto delldella sindrome dopo impianto dell’’embrione;embrione;

Trattamento

L’approccio terapeutico è empirico, basato soprattutto sul trattamento dei segni

e sintomi

Forme lievi e moderate:

Riposo assoluto;

Abbondante introduzioni di liquidi e soluzioni saline

TrattamentoForme severe: ematocrito > 45 %

Ospedalizzazione: emocromo, elettroliti, funzionali tà epatica e renale,

coagulazione, protidemia, albuminemia

Plasma expanders

Diuretici solo se si è ottenuta emodiluizione

Eparina

Dialisi

Eventuale paracentesi transvaginale/transaddominale

Cabergolina: internalizza i recettori del VEGF, da somministrare a

partire dal giorno dell’hCG

Trattamento

Soares, S. R. et al. Hum Reprod Update 2008 0:dmn008v1-13; doi: 10.1093/humupd/dmn008

Cabergolina e ↓ permeabilità vascolare in ratti iperstimolati