Le PROTEINE sono i biopolimeri maggiormente presenti all’interno delle

cellule, dal momento che costituiscono dal 40 al 70% del peso a secco.

Svolgono funzioni biologiche di fondamentale importanza e possono

essere divise in 7 gruppi principali:

• proteine strutturali (collagene, cheratine);

• proteine catalitiche (enzimi);

• proteine di trasporto (emoglobina, mioglobina, albumina);

• proteine regolatorie (ormoni);

• proteine di protezione (anticorpi, trombina);

• proteine contrattili (actina, miosina, troponina, tropomiosina)

• proteine di riserva (ovoalbumina, caseina)

La cinetica enzimatica• Può fornire informazioni sul meccanismo di

azione di un enzima• Fornisce informazioni sul ruolo di un enzima in

condiz. cellulari e sulle risposte a variazioni diconcentrazioni di metaboliti

• Fornisce informazioni su come un enzima èregolato

• Consente di caratterizzare inibitori (ad es., diinteresse farmacologico)

• E’ utile nel dosaggio di attività enzimatiche qualiindici diagnostici

• E’ utile nel discriminare diverse formeenzimatiche sia fisiologiche (isoenzimi) siaanomale

• È utile nella messa a punto di dosaggi enzimaticidi substrati

Velocità di reazione ed attività enzimatica

• Velocità di reazione: quantità di substrato trasformato nel

tempo

v = d [S] / dT = d [P] / dT

Inibizione enzimatica

• Reversibile

– Competitiva

– Non competitiva

– Acompetitiva

• Irreversibile

– Si legano all’enzima con legami stabili (covalenti)

– Non possono essere rimossi con mezzi semplici

– Cinetica analoga all’inibizione non competitiva

– Sono utilizzati: nello studio dei siti catalitici

come farmaci (anti-metaboliti)

come anti-parassitari

Parametri cinetici

• Km

• kcat Numero di turn-over: Massimo numero di molecole di substrato

convertite nella unità di tempo da una molecola (sito) di enzima

• Vmax

• kcat/Km (costante efficienza o di specificità) Dà una idea della efficienza

relativa con cui vengono trasformati substrati diversi (specificità) Dà una idea

della efficienza catalitica dell’enzima (enzimi “perfettamente” evoluti hanno

costanti che si approssimano alla diffusione)

• Inibizione (Ki)

Dosaggi enzimatici

• Valutazioni cinetiche

• Valutazioni cliniche

• Dosaggio di metaboliti

• Valutazioni merceologiche (alimentari)

Dosaggi enzimatici in Biochimica Clinica

• Enzimi plasmatici a scopo diagnostico

• carenze/difetti enzimatici responsabili di alterazioni

metaboliche e patologie correlate

Gli enzimi si possono trovare:

• Liberi nelle cellule di diversi tessuti ed organi

• Confinati in particolari strutture all’interno delle cellule

stesse

• In un determinato tessuto od organo specifico.

Localizzazione Enzimatica

Quando le strutture cellulari vengono danneggiate gli

enzimi cellulari si liberano e si riversano nel circolo

sanguigno.

In questo modo, un aumento della loro concentrazione

nel campione può rappresentare un indice abbastanza

preciso di un danno cellulare.

Enzimi plasmatici da dosare:

• enzimi attivi nel plasma (fattori della

coagulazione)

• enzimi attivi in fluidi extra-cellulari (ad

esempio, enzimi digestivi)

• enzimi del metabolismo cellulare

– ubiquitari

– organo (tessuto)-specifici

Inibitori come farmaci: i sulfamidici

Inibitori come farmaci: inibitori delle HIV proteasi

• Il virus HIV utilizza aspartato proteasi per scindere poliproteine

• Le proteasi tagliano legami particolari (Phe-Pro; Tyr-Pro)

• occorrono inibitori ad alta specificità

Meccanismi responsabili di un aumento degli

enzimi nel plasma

1)necrosi o danno cellulare indotto da fattori tossici o da ischemia, in cui

gli enzimi normalmente contenuti nel citoplasma fuoriescono dalle

cellule per citolisi

2)variazione della quantità di tessuto: aumentato turnover cellulare che

si realizza normalmente durante l'accrescimento, la rigenerazione

cellulare o anche in corso di neoplasie

3)alterata sintesi: induzione enzimatica in cui aumenta la sintesi proteica

dell'enzima

4)ostruzione dei dotti escretori per cui enzimi normalmente presenti

nelle secrezioni esocrine si riversano nel plasma

5)variazione nella permeabilità cellulare

6)alterazione nella velocità di inattivazione/ degradazione

7)altri fattori che influenzano l’attività (inibitori, carenza di cofattori...)

Inibitori enzimatici come agenti terapeutici

Inibitore Enzima Applicazione

AZT Trascrittasi inversa HIV

Ritonavir, saquinavir Proteasi HIV HIV

Sulfonammidi Diidrofolato sintasi Infezioni batteriche

Trimetoprim,

methotrexate

Diidrofolato reduttasi Infezioni batteriche

Allopurinolo Xantina ossidasi Gotta

Statine HMG CoA reduttasi Sintesi colesterolo

Aspirina Cicloossigenasi Sintesi prostaglandine