Roma 6-11-2013

Giuseppe L. Rotino (CRA-ORL, Montanaso L.)

Le innovazioni di ESPLORA nel settore

orto-floricolo

giuseppeleonardo.rotino@entecra.it

Roma 6-11-2013

specie studiate

Anemone

Pisello da industria

Fagiolo

Pomodoro

Melanzana

Roma 6-11-2013

Costruzione di una mappa genetica in

Anemone coronaria mediante marcatori

SSR e SNP

CRA – FSO, Unità di Ricerca per la Floricoltura e le Specie

Ornamentali (Sanremo)

Responsabile: Andrea Allavena

Marina Laura, Cristina Borghi, Valentina Bobbio

Anemone

Roma 6-11-2013

Anemone: Obiettivi

Mappaggio molecolare di caratteri di rilevanza

economica

-Costruzione di una mappa genetica

marcatori SSR e SNP

popolazione segregante

Sequenziamento del trascrittoma dei due parentali di

mappa opportunamente scelti;

Individuazione di SNP e SSR;

Genotipizzazione della progenie F2.

Roma 6-11-2013

Anemone: Risultati raggiunti

Dal sequenziamento Illumina

Sono stati trovati 3.314 SSR, di cui 2.200 utili

per il mapping

Una quota di SSR è stata validata utilizzando 132 coppie di

primers.

9 coppie di primers hanno prodotto polimorfismi

40 risultati dubbi ed 83 bande non informative

Per 28 SSR è stata valutata una seconda coppia di primers.

Roma 6-11-2013

Gel virtuale di polimorfismi di 4 SSR evidenziati con Qiaxcel (LL e TB indicano le due varietà; le sigle i diversi SSR)

93bi LL 93bi TB 54LL 80bi LL 92bi LL 80bi TB 92bi TB 54 TB

Anemone: Risultati raggiunti

Roma 6-11-2013

Anemone: Impatto dell’attività di ricerca

La disponibilità dei primi

marcatori derivati dal trascrittoma

faciliterà l’identificazione dei geni

responsabili di caratteri utili.

Possibili ricadute sul miglioramento

della specie utilizzando la MAS

Contributo alle conoscenze

genomiche in Anemone coronaria.

Roma 6-11-2013

Selezione di linee elite e phenotyping per definire

tecniche di selezione assistita per ambienti

climaticamente contrastanti

CRA – FLC, Centro di ricerca per le Produzioni Foraggere e Lattiero-

Casearie (Lodi)

Responsabile: P. Annicchiarico

Partecipanti: B. Ferrari, M. Romani, L. Pecetti

Collaborazioni internazionali: INRA Dijon (Francia), Noble Foundation

(USA)

Pisello proteico

Roma 6-11-2013

Identificare: marcatori molecolari utili per il breeding per ambienti padani e potenziali varietà mediante costruzione, fenotipizzazione e genotipizzazione di 3 set di recombinant inbred lines (RIL)

identificare marcatori molecolari associati alla resistenza allo stress idrico mediante bulk segregant analysis

Pisello proteico: Obiettivi

Roma 6-11-2013

Pisello proteico: costruzione ed analisi delle RIL

Prodotte ~270 RIL, ~90 per ognuna di 3 popolazioni RIL interconnesse (da 3 parentali elite)

Linee F6 genotipizzate con 384 marcatori SNP (polimorfici: 117-143), fenotipizzazione dele progenie per resa e tenore proteico della granella e altri caratteri in un ambiente padano

Valutazione bio-agronomica di

270 linee a Lodi

Roma 6-11-2013

Un’applicazione preliminare della tecnica innovativa del genotype-

by-sequencing (GBS) sui 3 parentali ha fornito oltre 3000 SNP

polimorfici per incrocio (a costi molto ridotti)

Identificati QTL per resa e % proteica della granella, etc; costruita una mappa consenso (ma SNP in numero limitato)

es. Kaspa Attika

Pisello proteico:genotipizzazazione ed analisi QTL

Roma 6-11-2013

Pisello proteico: linee tolleranti a siccità da bulk segregant analysis

Selezionate 30 linee per ognuna delle 3 popolazioni biparentali

interconnesse, dopo 3 cicli di selezione massale stratificata

con stress crescente (acqua Set-Apr.: 250 175 mm) sulle

generazioni F2, F3 e F4

file di piante di bordo eliminate

Selezione stratificata in

condizioni di stress idrico

controllato

Roma 6-11-2013

Pisello proteico: Impatto e sviluppi

Associazioni tra marcatori e importanti caratteri agronomici (resa, % proteica, etc.) – da confermare in nuovi ambienti

Sviluppo di nuovi genotipi (~360, tra cui potenziali varietà)

Nuova tecnica di genotipizzazione (genotype-by-sequencing)

Completamento e sviluppo in nuovi progetti delle seguenti attività:

• Arimnet REFORMA: genotipizzazione genotype-by-sequencing;

identificazione di linee, marcatori utili (bulk segregant analysis) e marker-

assisted selection per la tolleranza a forte stress idrico

• CoreOrganic COBRA, e PNSB: identificazione di linee e marker-assisted

selection per resa e % proteica in Nord e Centro Italia

Roma 6-11-2013

Fagiolo

Mapping della resistenza ai nematodi

galligeni in fagiolo

CRA-CIN, Centro di

Ricerca per le Colture

Industriali, Bologna

Resp. Andrea Carboni

Carla Busatto

Bruno Parisi

Coll. UNIVPM

Ancona

Laura Nanni

Eleonora Biagetti

Roma 6-11-2013

Fagiolo: scopo del lavoro / attività

Ricerca di materiali resistenti / fenotipizzazione nell’ambito della collezione di Phaseolus disponibile a CRA-CIN e UNIVPM (> 1000 accessioni).

Sviluppo di materiali / genetica e breeding sviluppo di progenie segreganti e RILs da incroci Resistenti x Sensibile in varie tipologie

Validazione del marcatore molecolare SCAR associato alla

resistenza a Meloidogyne incognita razza 1 utilizzando la collezione di germoplasma disponibile

Costruzione di una mappa di linkage utilizzando marcatori SSR e SCAR

Struttura popolazione ed analisi biogeografica (origine

resistenza) utilizzando una core-collection, marcatori SNPs

Roma 6-11-2013

Fagiolo: Risultati

Genotipizzazione e fenotipizzazione collezione Analizzati 1094 genotipi con marcatore SCAR (associato a resistenza a M. incognita razza 1):

27 accessioni selvatiche e 4 domesticate presentano il frammento associato

alla resistenza (27 sequenze identiche, 4 con una delezione di 15 bp).

La fenotipizzazione ha identificato 3 accessioni domesticate resistenti: 2 nuove

linee italiane (Pali 1 e Pali 2) e una varietà resistente (Kabanima).

Mappa di linkage 3 progenie F4 di 200 individui

314 marcatori SSR sono stati testati sui parentali di origine: 89 SSR polimorfici 38 marcatori SCAR associati alle principali fitopatie in fagiolo sono stati testati.

14 SCAR mappati. Identificate due regioni ricombinanti nei cromosomi 3 e 11 utili

per futuro mappaggio fine.

Roma 6-11-2013

Struttura genetica ed analisi biogeografica

Una collezione di 190 accessioni è stata analizzata con 296 SNPs. E’ in corso la

revisione finale dell’analisi di associazione.

27 selvatici su 662 risultano positivi al marcatore SCAR ma solo 1 è risultato

resistente a Meloidogyne incognita razza 1. Questo dato ha permesso di

identificare come proveniente dal Guatemala l’origine della resistenza.

Breeding MAS per sviluppare materiali con resistenza multipla dei

materiali migliori ora in F4 e F5 (piramidyng mai descritto

prima) da oltre 4000 incroci resistenti x varietà commerciali

Fagiolo: Risultati

Roma 6-11-2013

1. Nuove fonti di resistenza (sia rampicanti che di tipo snap).

2. Sviluppo di materiali innovativi: breeding lines avanzate (F4 e F5)

multiresistenti a M. incognita e M. javanica .

3. Validazione marcatore SCAR associato alla resistenza a M. incognita razza 1.

4. Mapping: individuazione di due regioni sui cromosomi 3 e 11, oggetto di

futura ricerca.

5. Incontri con azienda straniera per futura collaborazione.

Fagiolo: impatto dell’attività di ricerca

Roma 6-11-2013

A. Barone

V. Ruggieri

A. Sacco

M.M. Rigano

G. Mennella

G. Francese

A. D’Alessandro

M. Parisi

M. Milone

T. Cardi

Sviluppo di marcatori molecolari

per approcci di association

mapping in pomodoro finalizzati

allo studio del contenuto di acido

ascorbico e fenilpropanoidi nel

frutto

Caratterizzazione di una

popolazione di pomodoro per

approcci di "association

mapping" finalizzati allo studio

del contenuto di carotenoidi ed

altri metaboliti secondari nel

frutto

Dipartimento di Agraria

Università degli Studi di Napoli

Federico II

CRA-ORT, Cemtro di Ricerca

per l’Orticoltura Pontecagnano

Pomodoro

Roma 6-11-2013

Pomodoro: obiettivi

Caratterizzare una popolazione di

ecotipi/varietà di pomodoro per caratteristiche

qualitative e nutrizionali della bacca

Cercare alleli favorevoli per il miglioramento

genetico di tali caratteristiche

Roma 6-11-2013

Pomodoro: Materiali e Metodi

Collezione di 80 genotipi di pomodoro, che include

ecotipi italiani, landraces sudamericane, e alcune

cultivar.

La maggior parte dei genotipi sono da consumo fresco

e da serbo, alcuni anche da industria.

Tutti i genotipi sono stati caratterizzati a livello

fenotipico (analisi biochimiche) in una prova di campo

per due anni consecutivi

La genotipizzazione è stata effettuata con marcatori

molecolari di tipo SNP utilizzando una piattaforma

Illumina disponibile per il pomodoro, che consente di

analizzare contemporaneamente oltre 7000 SNP.

Roma 6-11-2013

Carattere Media± SD Min Max Ereditabilità

Acido ascorbico(mg/100gFW) 33.66 ± 0.228 9.71 76.97 0.54

Trans-licopene (mg/100gFW) 85.50 ± 1.978 0.00 309.69 0.61

15-cis licopene (mg/100gFW) 0.14 ± 0.004 0.00 0.92 0.89

13-cis licopene (mg/100gFW) 1.69 ± 0.041 0.00 8.13 0.70

9-cis licopene (mg/100gFW) 1.57 ± 0.037 0.00 7.00 0.66

β-carotene (mg/100gFW) 2.26 ± 0.092 0.03 37.11 0.40

Solidi solubili(brix°) 6.60 ± 0.033 3.70 10.30 0.87

pH 4.35 ± 0.005 3.86 5.35 0.64

Acidità (ac.citrico /100ml succo) 0.47 ± 0.003 0.13 0.92 0.99

Peso secco(g/100g) 8.55 ± 0.067 5.00 15.00 0.98

Peso fresco FW(g) 71.82 ± 3.025 3.50 377.5 0.94

Pomodoro: Analisi fenotipiche

Roma 6-11-2013

Pomodoro: Analisi Genotipica

SolCAP Tomato SNP assay (7720 SNPs)

Su140 marcatori risultati

associati

ai caratteri, 5 sono

altamente associati a

trans-licopene, b-

carotene ed acidità

titolabile

ANALISI DI ASSOCIAZIONE

Per i geni associati sono

stati identificati gli

alleli favorevoli che

potranno

essere trasferiti in varietà

coltivate mediante

programmi di

selezione assistita

Trait GLM MLM GLM+k3 MLM+k3

Ascorbic acid 134 0 13 0

Trans-lycopene 6 1 1 1

15-cis lycopene 0 0 0 0

13-cis lycopene 3 0 0 0

9-cis lycopene 1 0 1 0

β-carotene 3 2 2 2

Soluble solids 63 0 9 0

pH 0 0 9 0

Tritatable acidity 39 2 38 2

Dry weight 141 0 62 0

Fruit weight 0 0 0 0

Acido ascorbico

Trans-licopene

13-cis licopene

b-carotene

pH

Peso secco

15-cis licopene

9-cis licopene

Solidi solubili

Acidità titolabile

Peso fresco

Carattere

Roma 6-11-2013

0

10

20

30

40

50

60

70

80

[MB]

90

CHR1

solcap_snp_sl_54697

Methylthioribose kinase

BHLH transcriptor factor

Unknown

PBSP plant based secretory protein

UDP_glucosyltransferase 1

Unknown

Tritatable acidity_ta1_1

Tritatable acidity_ta1_2

CHR2

10

20

30

40

50

0

[MB]

solcap_snp_sl_17161

Zing finger protein

General vescicular transporter factor p115

Novel protein containing PHD-finger domain

Unknown

Unknown

Unknown

GATA transcription factor 9

Tutti i marcatori associati sono stati mappati sui 12

cromosomi del pomodoro dove sono stati identificati anche i

potenziali geni candidati utili per il trasferimento

mirato mediante schemi di breeding di precisione

Pomodoro: SNPs mapping

Roma 6-11-2013

Mappaggio di QTL di interesse

agronomico e sviluppo di una collezione

di germoplasma in melanzana

DiSAFA, UniTO

Sergio Lanteri

Ezio Portis

Lorenzo Barchi

Fabio Cericola

Alberto Aquadro

CRA-ORL, Unità di Ricerca

per l’Orticoltura, Montanaso L.

Giuseppe L. Rotino

Laura Toppino

Tea Sala

Fabio Cericola

M. Grazia Tacconi

Nazzareno Acciarri (CRA-ORA)

Tommaso Ciriaci

Laura Pulcini

Giuseppe Mennella (CRA-ORT)

Antonietta D’Alessandro

Gianluca Francese

Roberto Lo Scalzo (CRA-IAA)

Giampiero Valè (CRA-GPG)

Melanzana

Roma 6-11-2013

Melanzana: Obiettivi

Costruzione di una mappa molecolare

Analisi QTL – identificazione di associazione

fra marcatori molecolari e caratteri agronomici

(fenotipizzazione della progenie F2 in due

ambienti)

Ampliamento e caratterizzazione molecolare e

fenotipica della collezione varietale

Association mapping analysis e confronto con

family based QTL mapping (validazione QTL)

Roma 6-11-2013

Sviluppo di una mappa in melanzana (S. melongena) 305 E40 X 67-3

305 E40 (IL da S. aethiopicum)

Origine: [Sa+Dourga]

Parentale ricorrente: Talina

Precocità: + precoce

Resistenza: + Rfo-Sa1; +++ Verticillium

Colore Frutto: viola nero

Forma frutto: allungata

Colore fusto: verde

Habitus: eretto

Note: stabilizzata per

coltura di antere

67-3

Origine: Purpura x Cin

Parentale ricorrente: -

Precocità: - precoce

Resistenza: - Rfo-Sa1; + Verticillium

Colore Frutto: lilla scuro

Forma frutto: tonda

Colore fusto: antocianico

Habitus: prostrato

Note: breeding line stabilizzata per 8

selfing

HF1

X

156 individui F2

Melanzana: costruzione mappa

Roma 6-11-2013

Chromosome Length

(in cM)

Number of

markers

Average density

(cM)

Gaps

(>10 cM)

Gaps

(>15 cM)

RAD tag

SNP HRM SSR CAPs RFLP COSII

E01 129.2 29 4.61 2 1 25 3 1

E02 115.3 66 2.02 2 1 55 3 3 1 4

E03 136.5 37 4.01 1 1 30 4 1 2

E04 119.5 30 4.27 2 2 22 1 3 4

E05 101.4 32 3.76 1 1 27 3 1 1

E06 152.1 37 4.35 2 1 29 2 3 3

E07 80.2 25 3.64 2 0 19 3 3

E08 91.4 38 2.69 2 0 32 1 3 1 1

E09 124.2 39 3.65 2 0 34 2 1 2

E10 129.1 35 4.45 1 3 30 2 1 2

E11 84.3 22 4.68 2 1 16 2 1 3

E12 126.6 25 7.03 3 2 20 3 2

Average 115.8 34.6 3.82

Total 1389.7 415 339 2 33 3 11 27

Principali caratteristiche della mappa molecolare (Barchi et al, 2012 – PloS ONE)

Ultima versione della mappa:

419 marcatori molecolari (339 SNP, 3 HRM, 27 COS, 3 CAPS, 36 SSR e 11 RFLP)

Lunghezza totale della mappa =1401,5 cM,

lunghezza media cromosomi =116,8 cM (range : 80,2 -136.5 cM),

numero di marcatori per cromosoma da 22 (E11) a 67 (E2); media: 34,8

distanza media tra i marcatori: 3,3 cM (range 1,9-5,3 cM).

Melanzana: costruzione mappa

Roma 6-11-2013

circa 40 caratteri morfologici, agronomici, biologici e biochimici in 2

località: sono stati trovati major QTLs per quasi tutti i caratteri, distribuiti in tutti i

cromosomi tranne Ch 9

Ch1 Ch2 Ch3 Ch4

Ch5 Ch6 Ch7 Ch8

Ch9 Ch10 Ch11 Ch12

Melanzana: analisi QTLs

Roma 6-11-2013

• Costituzione della collezione di

germoplasma (~250 accesioni)

• pre-screening e identificazione di

una core population (191 accessioni)

• Fenotipizzazione e genotipizzazione

(SNPs, SSR) core population

• Analisi struttura della popolazione

• Valutazione del decadimento del LD

• Analisi QTL (associazione caratteri-marcatori)

Melanzana: Association Mapping

Roma 6-11-2013

0.24 0.32

0.48 0.56 0.64 0.72 0.8

0.88 0.96

Sim

ilarity

A

M_195

AM

_196

AM

_213

AM

_222

AM

_021

AM

_062

AM

_057

AM

_063

AM

_288

AM

_064

AM

_026

AM

_134

AM

_139

AM

_127

AM

_141

AM

_144

AM

_151

AM

_153

AM

_233

AM

_236

AM

_253

AM

_059

AM

_028

AM

_029

AM

_031

AM

_230

AM

_030

AM

_025

AM

_249

AM

_137

AM

_138

AM

_175

AM

_265

AM

_284

AM

_069

AM

_070

AM

_072

AM

_073

AM

_170

AM

_160

AM

_224

AM

_056

AM

_060

AM

_124

AM

_212

AM

_216

AM

_238

AM

_231

AM

_015

AM

_264

AM

_228

AM

_074

AM

_218

AM

_058

AM

_241

AM

_126

AM

_221

AM

_024

AM

_038

AM

_135

AM

_142

AM

_143

AM

_067

AM

_193

AM

_129

AM

_146

AM

_147

AM

_157

AM

_128

AM

_251

AM

_243

AM

_156

AM

_158

AM

_271

AM

_273

AM

_274

AM

_200

AM

_013

AM

_234

AM

_194

AM

_203

AM

_240

AM

_055

AM

_076

AM

_103

AM

_204

AM

_010

AM

_071

AM

_163

AM

_173

AM

_174

AM

_148

AM

_199

AM

_205

AM

_201

AM

_114

AM

_086

AM

_034

AM

_169

AM

_293

AM

_121

AM

_140

AM

_149

AM

_252

AM

_018

AM

_208

AM

_053

AM

_215

AM

_098

AM

_099

AM

_100

AM

_102

AM

_159

AM

_206

AM

_279

AM

_207

AM

_275

AM

_290

AM

_289

AM

_278

AM

_202

AM

_036

AM

_168

AM

_285

AM

_155

AM

_014

AM

_152

AM

_266

AM

_136

AM

_150

AM

_016

AM

_162

AM

_171

AM

_037

AM

_052

AM

_046

AM

_235

AM

_176

AM

_011

AM

_051

AM

_054

AM

_106

AM

_269

AM

_268

AM

_001

AM

_198

AM

_167

AM

_214

L’approccio di “Association

mapping” utilizzando una collezione di 191

accessioni ha permesso di:

stimare il Linkage

Disequilibrium (circa3,4 cM);

confrontare i QTLs con quelli

da “bi-parental mapping” (46%

confermati);

scoprire nuovi QTL (54%).

Melanzana: Association Mapping

Roma 6-11-2013

oltre 110 QTL sono stati finora identificati e mappati su 11 cromosomi

utilizzabili per la MAS.

QTL con maggiore effetto:

Produzione precoce e totale di frutti sui cr. 2 e 11

Resistenza a Fusarium sul cr. 2

Dimensione del frutto sul cr. 2

Lunghezza e forma del frutto sul cr. 3 e 11

Presenza dell’anello verde sotto l’epidermide del frutto sul cr. 8

Colore del frutto sul cr. 5

Spinosità del calice del frutto sul cr. 7

Lunghezza del peduncolo del frutto sul cr. 4

N sacche seminali del frutto e n fiori/infiorescenza sul cr. 12

Consistenza del frutto sul cr. 5

Resistenza a Verticillium

Glicoalcaloidi

Antocianine (Nasunina e D3R)

Melanzana: Impatto dell’attività di ricerca

L’imminente disponibilità del genoma

di riferimento di S. melongena

(parentale 67-3) renderà ancora più

efficiente e precisa l’attività di

breeding basata su strumenti

molecolari (es. CNV, geni privati).