Fabio Arena

Dip. Biotecnologie Mediche

Università di Siena

LE INFEZIONI FUNGINE

INVASIVE: “Recenti

progressi nella

diagnostica

microbiologica”

Check-Pos Pos-Gram Pos/IDM Pos-ID Pos-ATBM POS-ATB

0

1

2

3

4

5

6

Check-Pos Pos-Gram Pos-IDM Pos-ID Pos-ASTM Pos-AST

Tim

e (d

ays)

Arena et al. accepted

Sorveglianza Turn Around Time (Maggio 2015)

• 5 Laboratori italiani medio-grandi membri GLIPaC

• TAT 350 emocolture monomicrobiche, esclusi CoNS

31 Candidemie

78 H

30 H 28 H

Bassetti M. Intensive Care Med 2014 Bouza E. Int J Antimicrob Agent 2009

• High mortality rates 50-70%

• Difficulties in the diagnosis

The real challenge of candidemia

• β-D-glucan (mannan, anti-mannan) • Test molecolari PCR, PCR-ESI/MS

• T2 magnetic resonance

Test supplementari esame colturale

PCR-ESI/MS

S Strenghts W Weaknesses

O Opportunities T Threats

-No step colturale -TAT 6H

-Costo elevato -Apparecchiatura ingombrante -Studi clinici deludenti Sensibilità

-ampio pannello di germi riconosciuti

-Inibitori -basse cariche

Diagnosis: non cultural methods PCR-ESI/MS

Ecker DJ et al. Nat Rev Microbiol 2008

• More than 750 bacterial and fungal species • Time to results < 6 h (1/2 H hands-on time) • Limit of detection 16 CFU/mL

PCR-ESI/MS evaluation from positive blood culture

N. campione Standard Iridica

Concordanza Genere Specie Genere Specie

1016 Candida albicans Escherichia coli No

2037 Staphylococcus aureus Negative . Negative PCR

2049 Staphylococcus aureus Escherichia coli No

2052 Streptococcus oralis Finegoldia magna No

3011 Acinetobacter baumannii Escherichia coli No

4026 Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae No

5040 Escherichia coli Negative . Negative PCR

5050 Enterococcus faecalis Negative . Negative PCR

5063 Clostridium paraputrificium Negative . Negative PCR

6070 Enterococcus faecium Negative . Negative PCR

7010 Streptococcus pyogenes Negative . Negative PCR

8001 Listeria monocytogenes Negative . Negative PCR

8038 Pseudomonas aeruginosa Candida albicans No

Vincent et al. Crit Care Med 2015

19.1% FN

PCR-ESI/MS evaluation from positive blood culture

19 FN

43% Sensibilità

T2 Magnetic resonance

S Strenghts W Weaknesses

O Opportunities T Threats

-No step colturale -TAT <5H

-Costo elevato

- dedicato per candidemia

-limitata esperienza clinica -presenza inibitori

Neely LA et al. Sci Trasl Med 2013

T2 Magnetic resonance/nanoparticle

• 5 Candida species • Time to results < 5 h

T2 Magnetic resonance/nanoparticle

-2013-2014 -12 centers -Comparison with conventional Blood culture with clinical and spiked samples

Spiked samples sensitivity (n.250): 92.3% C. albicans/C. tropicalis 94.2% C. parapsilosis 88.1% C. krusei/ C. glabrata

Mylonakis et al. CID 2015

Limit of detection: 1 CFU/mL C. tropicalis/C. krusei 2 CFU/mL C. albicans/C. glabrata 3 CFU/mL C. parapsilosis

12% invalid results...INIBITORS

• 31 discordant cases (1.7% of the total) • 2 positive for BC only • 29 positive for T2 only

T2 Magnetic resonance/nanoparticle

Spanu T. J Clin Microbiol 2012 Stone NR. J Clin Microbiol 2013 Poritz MA. PlosOne 2011

Yeast identification from positive blood culture bottle

MALDI-TOF PNA-FISH Nested PCR microarray

Molecular diagnosis from positive blood culture

Specie Fenotipo

C. krusei resistente a fluconazolo

C. rugosa, C. norvegensis, C. lipolytica, C. valida, C. inconspicua, C. zeylanoides

ridotta sensibilità agli azoli

C. guilliermondii, C, metapsilosis, C. parapsilosis, C. fermentati

ridotta sensibilità alle echinocandine

C. lusitaniae ridotta sensibilità all’amfotericina B

A. lentulus, A. pseudofisheri e A. fumigatiaffinis

resistenti agli azoli

A. lentulus e A. fumigatiaffinis, A. terreus

resistenti all’amfotericina B

A. calidioustus resistenza intrinseca agli azoli ed a caspofungina

A. niger può manifestare resistenza acquisita agli azoli

Relevance of fungal identification

Esame colturale

S Strenghts W Weaknesses

O Opportunities T Threats

-Test di sensibilià -Costo ridotto

-TAT >48 H -bassa sensibilità

- isolato per successivi studi

-problemi intepretativi

Candida albicans n.32

Candida glabrata n.7

Candida krusei (Issatchenkia

orientalis) n.1

Candida parapsilosis

n.9

Candida tropicalis n.1

Candida species from blood culture 2015

Micafungin n. isolates MIC Range % Susceptible C. albicans 32 <=0.008 100

C. parapsilosis 8 0.5-2 100 C. glabrata 7 0.015-0.3 100

C. krusei 1 0.12 - C. tropicalis 2 0.015-0.3 -

Fluconazole n. isolates MIC Range % Susceptible C. albicans 31 <=0.12-1 100

C. parapsilosis 9 0.25-1 100 C. glabrata 3 >128 0 C. tropicalis 1 2 -

AST Candida from blood culture 2015

Eun-Jung Cho et al. J. Antimicrob. Chemother. 2015

Emergence of multiple resistance profiles involving azoles, echinocandins and amphotericin B in Candida glabrata isolates from a neutropenia patient with prolonged fungaemia.

MDR Candida glabrata

Antifungals MIC mg/L(S/I/R)

Amfotericina B 0.064 S

Anidulafungina 1 R

Caspofungina 0.75 R

Micafungina 0.5 R

Fluconazolo >256 R

- Pz. donna - 76 aa - ricoverata in istituto di

riabilitazione - portatrice CVC

- C. glabrata da sangue periferico

MDR Candida glabrata

Agosto 2016

- Saggio di sensibilità con Gradient diffusion

- Interpretazione EUCAST

Siopi et al. J. Clin. Microbiol. 2015

AST problemi interpretativi

Formazione biofilm

• Paired blood cultures • A TTP cut-off of 30 h was 100% sensitive and 51.4%

specific for catheter-related candidaemia

N. Høiby et al. CMI 2014

Conclusioni

• Candidemia pone probelmi diagnostici e terapeutici

• esame colturale, (1,3)-β-D-glucan, e test di identificazione rapida da emocoltura test consolidati (MALDI-TOF, PNA-FISH e MOLECOLARI rapidi)

• Nuovi diagnostici direttamente da sangue, T2 risonanza magnetica promettente ma poca esperienza clinica

• Resistenze in Candida glabrata

• Test di sensibilità adeguati

• Standardizzazione tecnica per rilevazione biofilm