LE COLTURE CELLULARI

1

2

IN VITRO:

esperimenti su colture cellulari

EX VIVO:

esperimenti su cellule

IN VIVO: esperimenti su animali da laboratorio

Co

lture

ce

llula

ri

2

Sperimentazione preclinica (10 anni)

Sperimentazione preclinica in vitro:

vantaggi e svantaggi delle colture cellulari

Sistemi semplificati e

altamente riproducibili

Consentono l’analisi di

meccanismi cellulari e

molecolari

Controllo ambientale

Economicità e rapidità di

risposta

Disponibilità

Sistemi semplificati

rispetto ad un organismo

integrato

Condizioni di esposizione

alle sostanze diverse da

quelle in vivo

Difficoltà di correlare le

concentrazioni in vitro

con quelle in vivo

Le sostanze somministrate

possono interagire con il

terreno di coltura

3

Applicazione delle colture cellulari

Studio di processi intracellulari (sintesi proteica e

meccanismi di traduzione dei segnali)

Studio di citotossicità

Studio del meccanismo di azione dei farmaci

Studio dei meccanismi di interazione cellula-cellula

Studio di anomalie genetiche (analisi del cariotipo)

Biologia molecolare (mappature, transfezioni, analisi di

mutanti, proteine ricombinanti, anticorpi monoclonali)

Studio di processi infettivi virali

Caratterizzazione di tumori

In campo industriale:

studio di effetti farmacologici e tossici di farmaci 4

5 5

Co

lture

ce

llula

ri

Colture primarie

6

Colture primarie

VANTAGGI

Mantengono le caratteristiche delle

cellule in vivo

SVANTAGGI

numero finito di divisioni (cicli)

senescenza

popolazione eterogenea

isolamento complesso

Co

lture

ce

llula

ri

7

Colture secondarie: 1. le cellule discendono da colture primarie trasformate o indotte mediante

agenti chimici, fisici o biologici

2. le cellule discendono direttamente dal tessuto di origine:

una volta consumato il terreno di coltura si deve provvedere ad una

subcoltura in nuovo recipiente con terreno fresco

VANTAGGI

Fedeltà del cariotipo

Presentano più cicli cellulari rispetto alle colture

primarie

SVANTAGGI

Possono differenziarsi in altri tipi cellulari

Co

lture

ce

llula

ri

Linee cellulari a vita finita

• Numero limitato di cicli in coltura

• Inibizione da contatto

• Forte dipendenza da siero e fattori di crescita

Linee cellulari continue (trasformate)

• Originano da mutazioni di colture primarie

• Si possono ottenere dai tumori

• Poca dipendenza da siero e fattori di crescita

Linee cellulari clonali

• Derivano da una singola cellula (omogenee)

Linee cellulari: subcoltura

8

Co

lture

ce

llula

ri

9

Trasformazione in linea cellulare continua

- trattamento con cancerogeni

- esposizione a virus

- mutazioni spontanee

Cellule trasformate Cellule immortalizzate

- perdono la capacità di regolare la crescita: crescono

continuamente e quindi hanno durata di vita infinita

- perdono alcune caratteristiche che hanno in vivo (mancata espressione di certi geni)

-richiedono meno siero per la crescita

-hanno tempo di raddoppiamento più breve

Co

lture

ce

llula

ri

10

Co

lture

ce

llula

ri

1) Coltura primaria: tempo di crescita lento

2) Linea cellulare primaria: maggiore velocità di crescita

3) Linea cellulare secondaria: tempi di crescita progressivamente

più lunghi (sino alla morte)

4) Linea cellulare stabilizzata (immortalizzata)

11 11

1. European Collection of Cell Culture

www.ecacc.org.uk

• AmericanTissueCultureCentre (USA)

www.atcc.org

• National Cell Culture Center (USA)

www.nccc.com

• German Collection of Microorganism and Cell

Culture

www.dsmz.de

• IZS Centro Substrati Cellulari

www.bs.izs.it

• IST Servizio Biotecnologie

www.biotech.ist.unige.it

Co

lture

ce

llula

ri

12 12

Co

lture

ce

llula

ri

13 13

The CHO-K1 cell line was derived as a subclone from the

parental CHO cell line initiated from a biopsy of an ovary

of an adult Chinese hamster by T. T. Puck in 1957. The

cells require proline in the medium for growth.

ATCC complete growth medium: The base medium for

this cell line is ATCC-formulated F-12K Medium,

Catalog No. 30-2004. To make the complete growth

medium, add the following components to the base

medium: fetal bovine serum to a final concentration of

10%.

Temperature: 37.0°C

Isolation date: 1957

Co

lture

ce

llula

ri

14 14

Remove and discard culture medium.

Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin-

0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum

which contains trypsin inhibitor.

Add 2.0 to 3.0 ml of Trypsin-EDTA solution to flask and

observe cells under an inverted microscope until cell layer

is dispersed (usually within 5 to 15 minutes).

Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting

or shaking the flask while waiting for the cells to detach.

Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to

facilitate dispersal.

Add 6.0 to 8.0 ml of complete growth medium and

aspirate cells by gently pipetting.

Add appropriate aliquots of the cell suspension to new

culture vessels.

Incubate cultures at 37°C.

Co

lture

ce

llula

ri

1952: George Gey stabilizzò in coltura la prima linea

cellulare tumorale: Carcinoma della cervice uterina

Linea cellulare HeLa derivata da donna di 31 anni,

Henrietta Lack

Il terreno di coltura era fatto di

sangue di pollo, sali speciali e

placente.

15

Co

lture

ce

llula

ri

Non tutte le cellule si dividono

Alcune cellule muoiono

Consumo di sostanze nutritive

Accumulo di cataboliti tossici nel terreno

Limitazione di spazio (piastra/fiasca)

Crescita di una linea cellulare in coltura

16

Co

lture

ce

llula

ri

DEVONO ESSERE DILUITE CON TERRENO FRESCO IN

NUOVE PIASTRE/FIASCHE ALTRIMENTI MUOIONO

LA DENSITA’ RAGGIUNTA A PLATEAU DALLE

CELLULE TRASFORMATE E’ PIU’ ALTA DI QUELLA

DELLE CELLULE NORMALI

17

Co

lture

ce

llula

ri

18

CAMERA DI BURKER

COME E DOVE SI LAVORA CON LE

LINEE CELLULARI:

EQUIPAGGIAMENTO ESSENZIALE

19

CAPPA A FLUSSO LAMINARE

INCUBATORE

CENTRIFUGA

MICROSCOPIO INVERTITO

MATERIALE per COLTURE CELLULARI

TERRENI DI COLTURA

EQUIPAGGIAMENTO PER CRIOCONSERVAZIONE

20

Co

lture

ce

llula

ri

•FORNISCE UN LUOGO DI LAVORO

PULITO PER LE COLTURE CELLULARI;

•UNA PROTEZIONE DAGLI AEROSOL

PER L'OPERATORE.

LA PROTEZIONE È ASSICURATA

DALL’USO DI FILTRI DI HEPA (ARIA

POLVERIZZATA DI ALTA EFFICIENZA).

RAGGI UV ACCESI PRIMA E DOPO IL

LAVORO PER STERILIZZARE LA

SUPERFICIE

LA CAPPA A FLUSSO LAMINARE

IL LIVELLO DI CONTENIMENTO DEL FILTRO (QUINDI DI

PROTEZIONE) VARIA A SECONDA DEL CODICE DI CATEGORIA

DELLA CAPPA.

21

Co

lture

ce

llula

ri

L’INCUBATORE

AMBIENTE RIGOROSAMENTE CONTROLLATO PER LO

SVILUPPO DELLE COLTURE CELLULARI.

TEMPERATURA (37°C)

UMIDITA’ (95%)

LIVELLI DI CO2 (5-10%).

PER EVITARE CONTAMINAZIONI DELL’AMBIENTE

INTERNO:

•INCUBATORI RIVESTITI DI RAME (ATTIVITÀ

ANTIMICROBICA DEL RAME);

•LIQUIDI SPECIFICI DI TRATTAMENTO NELLA VASCA

DELL’ACQUA

OCCORRE UNA PULIZIA REGOLARE

22

Co

lture

ce

llula

ri

PER LORO STESSA NATURA LE

CENTRIFUGHE PRODUCONO GLI

AEROSOL PER CUI È NECESSARIO

MINIMIZZARE QUESTO RISCHIO PER

L’OPERATORE.

COPERCHIO SIGILLATO CON PARTE

TRASPARENTE IN MODO DA POTERE

OSSERVARE LO STATO DEL CARICO

SENZA APRIRE IL COPERCHIO.

EQUILIBRARE LE PROVETTE CON

ATTENZIONE.

LE CELLULE SI CENTRIFUGANO A

1000-1300 RPM PER 5 MINUTI.

PER TOGLIERE RESIDUI CELLULARI A

VELOCITÀ + BASSA (800 RPM).

LA CENTRIFUGA

23

Co

lture

ce

llula

ri

•La luce proviene dall’alto e

l’obiettivo è posizionato in

basso.

•Consente di osservare cellule

poste in una piastra, cosa

impossibile con un normale

microscopio ottico a causa

dello spessore del contenitore.

LE COLTURE CELLULARI VENGONO

VISUALIZZATE

CON MICROSCOPIO OTTICO INVERTITO:

24

Co

lture

ce

llula

ri

Sistemi di illuminazione del campione:

a trasmissione (o a campo chiaro): LUCE DIRETTA

a diffusione (o a campo scuro): CONTRASTO DI FASE

CONTRASTO DI FASE

LUCE DIRETTA

25

Co

lture

ce

llula

ri

MATERIALE PER COLTURE CELLULARI

•Vetro (riutilizzabile); viene di volta in volta lavato e

sterilizzato.

•Plastica monouso; disponibile in commercio imballato

monouso e sterile

L'uso di materiale in plastica monouso è da preferirsi

per praticità, sicurezza e qualità.

26

Co

lture

ce

llula

ri

27 27

terreni

reagenti

siero

pH

temperatura

umidita’ relativa

O2 e CO2

Co

lture

ce

llula

ri

Fabbisogni nutrizionali/fisici

punti critici:

I terreni piu’ usati sono:

MEM (Minimum Essential Medium),

DMEM (Dulbecco’s Modified MEM),

RPMI (Roswell Park Memorial Institute).

I terreni variano tra loro per composizione salina e

diverso contenuto di elementi nutritivi.

Per linee cellulari piu’ esigenti esistono terreni piu’

ricchi di metaboliti e vitamine:

ISCOVE (con transferrina, lecitina e albumina)

HAM-F12

28

Co

lture

ce

llula

ri

29 29

Co

lture

ce

llula

ri

Composizione standard del terreno di coltura

30

Come si fa a capire il pH del terreno:

•Quando il pH e’ intorno a 7.3 (valore fisiologico) il

colore del terreno e’ rosso-arancio.

A pH acido (6.8-7.0) il colore vira al giallo: con il

proliferare delle cellule il pH del terreno si acidifica

per la produzione di C02 da parte del metabolismo

cellulare: il terreno va cambiato.

A pH basico (> 7.5 - 7.6) il colore vira al rosso-viola:

tale colorazione indica che le cellule non sono

metabolicante attive. 30

Co

lture

ce

llula

ri

SIERO FETALE BOVINO (FBS)

Il siero di vitello fetale contiene:

•i fattori di crescita;

•i fattori adesivi;

altre sostanze indispensabili per il metabolismo

cellulare:

•albumina, veicolanti lipidi e vitamine liposolubili.

•colesterolo, acidi grassi, glucocorticoidi

•transferrina

•Cu, Zn, Co, Mo, Se, Va: cofattori enzimatici

31

Co

lture

ce

llula

ri

L’USO DEL SIERO E’

CONTROVERSO

Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità;

Introduce fattori di crescita ed ormoni;

Veicola lipidi, ferro e molecole organiche;

Favorisce interazione fra cellule e substrato;

Contiene inibitori della tripsina;

Possibile tossicità degli anticorpi;

Variabilità da lotto a lotto;

Inibitori metabolici;

Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari;

32

Co

lture

ce

llula

ri

COME SI MANTENGONO LE

LINEE CELLULARI:

33

34

Come mantenere una linea cellulare:

la criopreservazione

Conservate in azoto liquido a -196 °C

Le cellule vitali possono essere recuperate

in qualsisi momento Co

lture

ce

llula

ri

35

Metodica per la crioconservazione

1. Raccogliere le cellule in fase logaritmica

2. Determinare il numero delle cellule

3. Centrifugare la sospensione cellulare

4. Risospendere delle cellule nel medium di

congelamento (20% FBS e 10% DMSO)

5. Dividere in criovials

6. Dare inizio al processo di congelamento

Co

lture

ce

llula

ri

36

Vantaggi

Ridotto rischio di contaminazione

microbica e di cross contaminazione

Si possono utilizzare linee cellulari a ben

precisi passaggi

Riduzione di costi e tempi

Co

lture

ce

llula

ri

37

Procedura di scongelamento

1. Scongelare la vial nel bagnetto a 37°C

2. Pulire l’esterno con alcool assoluto

3. Aprire la vial sotto cappa e trasferire il contenuto in

una falcon sterile contenente 3-5 ml di mezzo

completo

4. Centrifugare 5 min a circa 1000g/min per eliminare

il DMSO

5. Aspirare il sovranatante

6. Risospendere il pellet cellulare in terreno fresco

7. Seminare in nuove piastre

Co

lture

ce

llula

ri

38

CONTAMINAZIONI

DI COLTURE CELLULARI

con

tam

inaz

ion

i

39

Batteri

Funghi (Muffe)

Lieviti (Candida)

Micoplasmi

Virus

PRINCIPALI TIPI DI CONTAMINAZIONI

IN COLTURE CELLULARI:

con

tam

inaz

ion

i

40

Batteri (bacilli) ingrandimento 320x

I batteri appaiono come pulviscolo

negli spazi tra le cellule

con

tam

inaz

ion

i

41

Gli antibiotici il più comunemente usati sono:

Penicillina/Streptomicina (usati insieme)

Gentamicina (spesso usata con kanamicina)

Kanamicina (spesso usata con gentamicina)

Ampicillina

Questi antibiotici risultano efficaci sia contro i batteri

gram-positivi che i batteri gram-negativi.

E’ sconsigliato aggiungere a colture contaminate cocktail

di molti antibiotici perché usati insieme possono

provocare un effetto tossico cumulativo sulle cellule.

con

tam

inaz

ion

i

42

Lievito (candida) ingrandimento 100x

con

tam

inaz

ion

i

LIEVITI:

43

Fungo (muffa) ingrandimento 100x

con

tam

inaz

ion

i FUNGHI:

44

I due agenti antimicotici più comunemente usati sono:

anfotericina B (Fungizone). Il Fungizone è in genere molto

tossico nei sistemi di coltura cellulare e dovrebbe essere

usato solo all’effettiva occorrenza (0.2 µg/ml e 2 µ/ml).

mycostatina (Nystatin). Non si tratta di una soluzione ma

di una sospensione colloidale per cui deve essere

mescolata completamente prima di essere aggiunta ai

terreni di coltura (100 U/ml e 250 U/ml)

Nota importante: gli antibiotici ordinariamente usati quali

penicillina/streptomicina, gentamicina e kanamicina non

sono efficaci contro i funghi o le muffe.

con

tam

inaz

ion

i

45

con

tam

inaz

ion

i MICOPLASMA:

< 1 µm

46

Come combattere il micoplasma

Gentamicina e kanamicina marginalmente

efficaci contro i micoplasmi.

Si preferisce: TIAMULIN

MINOCICLINA

VANCOMICINA

Il modo migliore rimane comunque

l’eliminazione della coltura inquinata!!!

con

tam

inaz

ion

i

COLTURE CELLULARI:

MODALITA’ DI COMPORTAMENTO

1) il laboratorio di colture cellulari deve essere ad uso

esclusivo delle colture

2) usare cappe a flusso laminare sterile, verticale.

3) sostituire periodicamente prefiltri e filtri della cappa.

4) il piano di lavoro deve essere pulito prima di iniziare a

lavorare e dopo aver finito di lavorare con alcool

denaturato.

5) quando gli operatori SONO ASSENTI accendere gli

UV germicidi nel piano di lavoro e nella stanza.

6) tutto il materiale utilizzato, vetro o plastica, soluzioni,

deve essere rigorosamente sterili 47

Co

lture

ce

llula

ri

7) Indossare i guanti.

8) usare un pipettattore elettrico.

9) colture inquinate vanno isolate, incubate con un

disinfettante e quindi autoclavate;

10) sterilizzazione del materiale delle soluzioni:

a secco (2h, 180 °C);

in autoclave (120 °C, 30’);

per filtrazione, con eventuale sistema di

aspirazione.

48

Co

lture

ce

llula

ri

49

VALUTAZIONE DELL’ ASSORBIMENTO INTESTINALE

50

Linee cellulari di ratto derivate da intestino tenue fetale o neonatale Caco-2

MODELLI CELLULARI PER LO STUDIO

DELL’ ASSORBIMENTO INTESTINALE

Origine Adenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in

monostrato

Crescita cellule epiteliali in monostrato

Differenziamento 14-21 dopo la confluenza

morfologia Cellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola

apicale

Parametri elettrici Resistenza elettrica elevata

Enzimi digestivi Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell’intestino tenue

Trasporto attivo Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni….

Trasporto ionico di

membrana

Na+,K+ ATPasi, H+,K+ ATPasi, scambiatore Na+,H+,

cotrasportatore Na+,K+, Cl-, canali apicali per Cl-

Trasportatori non ionici di

membrana P-glicoproteina, MRPs, LRP

Recettori Vitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio

(GLUT1,3,5 e SGLT1)

CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2

Origine Adenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in

monostrato

Crescita cellule epiteliali in monostrato

Differenziamento 14-21 dopo la confluenza

morfologia Cellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola

apicale

Parametri elettrici Resistenza elettrica elevata

Enzimi digestivi Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell’intestino tenue

Trasporto attivo Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni….

Trasporto ionico di

membrana

Na+,K+ ATPasi, H+,K+ ATPasi, scambiatore Na+,H+,

cotrasportatore Na+,K+, Cl-, canali apicali per Cl-

Trasportatori non ionici di

membrana P-glicoproteina, MRPs, LRP

Recettori Vitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio

(GLUT1,3,5 e SGLT1)

CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2

STUDI METABOLICI IN VITRO

FRAZIONE EPATICA S9 (supernatante a 9000 giri )

MICROSOMI

EPATOCITI

in sospensione

in coltura

parent compound concentration (before incubation)

% parent compound disappearance

1 −

parent compound concentration (after incubation)

= X 100

inibizione induzione

Screening per valutare l’epatotossicità