Laboratorio de Microbiologia - 4

8/17/2019 Laboratorio de Microbiologia - 4

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Facultad de IngenieríaEscuela Profesional Ingeniería

AgroindustrialDocente: Blga. Claudia Clavijo Koc

UNIVERSIDAD PRIVADA DE TACNA

FACULTAD DE INGENIERIA

Escuela Profesional de Ingeniería Agroindustrial

Laboratorio N°04 Aislamiento de bacterias en alimentos

Curso: Microbiología Agroindustrial

Alumno: Gladys Eliana Zegarra Mandamiento

Docente: lga! Claudia Cla"i#o $oc

Tacna – Per!"#$





A%&LAM%EN'( DEAC'E)%A& EN *N AL%MEN'(

%! MA)C( 'E()%C(

+ara aislar e identi,car una es-ecie bacteriana del medio y de otraes-ecie .ue -ueda con/undirse mor/olgicamente es necesario usarmedios de culti"os1 ya .ue nos -ermiten di/erenciar lascaracterísticas del crecimiento de las bacterias y establecer suidentidad seg2n el medio de culti"o .ue se use!Los microorganismos se encuentran en muc3os ambientes naturales

como el agua1 el suelo1 aire1 el 3ombre y otros seres "i"os1 alimentos1entre otros!aciendo -arte de los di/erentes ecosistemas! +or esto se deben usarlos medios de culti"o adecuados .ue se aseme#en al ambiente si.ueremos -osibilitar el crecimiento de la bacteria!

5! *n medio de culti"o est6 dise7ado -ara -osibilitar el desarrollo ynutricin de las bacterias -or esto cuenta con una cantidad desustancias como: carbono1 agua1 a8u/re1 /os/oro1 nitrgeno1-otasio1 sodio1 magnesio1 entre otros! 'ambi9n su crecimientode-ende de muc3os /actores entre ellos: un - -re/eriblemente

neutro1 3umedad1 oigeno1 tem-eratura1 -resin osmtica1 todoesto en condiciones adecuadas!

;! Los medios de culti"o se clasi,can de-endiendo de lascaracterísticas .ue se necesiten -ara su -timo desarrollo loscuales seg2n su consistencia -ueden ser:

• Lí%uidos& no contienen agar y /a"orecen el crecimiento

bacteriano ya .ue las bacterias -oseen una gran libertad demo"imiento y al di/undirse -or todo el medio encuentran su

com-onente nutriti"o y re.uerimiento de oigeno m6s -timocon gran /acilidad1 -or e#em-lo: las aerobias estrictas crecenen los -rimeros 50<5=mm de la su-er,cie del medio1 lasmicroaero,las5 ligeramente -or la su-er,cie del medio1 lasanaerobias estrictas en los 50<;0mm del /ondo y las/acultati"as -or todo el medio!

• Solidos& su concentracin de agar es de 5!=> a ;>1 en estos

las bacterias crecen con mayor di,cultad1 ya .ue los nutrientes

5 hace referencia a las condiciones de baja y estricta concentración de oxígeno querequieren determinados organismos para su desarrollo





-uedenagotarse /6cilmente1 se utili8an -ara "er colonias1 aislar

microorganismos1 características de crecimiento1 color1tama7o1 taonomía1 entre otros!

• se'i(solido& su concentracin de agar es de 0!=> y se utili8a

-ara estudiar el mo"imiento y algunas -ro-iedadesbio.uímicas!;

'ambi9n seg2n su a-licacin se usa:

•

&im-les: son a-ro-iados -ara la mayoría de microorganismosya .ue -osee re.uisitos nutricionales mínimos -aradesarrollarse!

• Enri.uecidos: -ermiten el crecimiento de bacterias di/íciles de

culti"ar1 -uesto .ue se a7ade ciertos com-onentes muy ricosen nutrientes!

• &electi"os: estos medios contienen com-onentes .ue in3iben

el crecimiento de algunas bacterias cuyo crecimiento nointeresa1 -ermitiendo así aislar una determinada es-ecie!

• Di/erenciales: en este se les adiciona sustancias -ara el

crecimiento de determinadas bacterias y al actuar sobre dic3as

sustancias ad.uieren un color .ue las di/erencia de otrascolonias!

• Enri.uecimiento: son medios lí.uidos .ue /a"orecen la

multi-licacin de bacterias cuando la muestra obtenida es-obre!

?! De acuerdo con su a-licacin los com-onentes usuales de losmedios de culti"o son:

• Etracto de carne: constituye una /uente de carbono1

nitrgeno1 sales org6nicas y otros nutrientes!• +e-tonas: son -roteínas degradadas1 ricas en nitrgeno y

carbono!• Cloruro de sodio: im-ortante -ara -ro-orcionar un adecuado

e.uilibrio osmtico!• 'am-ones estabili8adores del -: necesarios -ara contrarrestar

las "ariaciones del - debido a los -roductos del metabolismobacteriano!

4! Nutrientes -ara medios de enri.uecimiento:

• Etracto de le"adura: rico en "itaminas del com-le#o 1

-roteínas y 6cidos nucleicos!





• Etracto de

glbulos ro#os: suministra los /actores @ 3eminaB y

di/os/o-iridin adenin<nucleotido o coen8ima %B im-rescindibles-ara el crecimiento bacteriano de algunos microorganismos!

• %n/usin de 3ígado o cora8n y cerebro: son in/usiones ricas en

amino6cidos a8u/rados .ue reducen el -otencial de idoreduccin!

=! Agentes reductores:

&e adicionan tioglicolato sdico1 cisteína1 6cido ascrbico a los mediosde culti"o -ara -romo"er la anaerobiosis!

! Agentes selecti"os:

• Colorantes: el cristal "ioleta1 a8ul de metileno1 el "erde

brillante y otras sustancias usadas -or su e/ecto toico sobre

las Gram -ositi"as!• Cloruro sdico a altas concentraciones!

• ilis o &ales biliares

• Antibiticos

• Ciclo3eimida o actidiona: se a7ade -ara im-edir el

crecimiento de 3ongos ambientales en los medios de culti"o!aB A8ucares:

&e -uede adicionar -ara ,nes nutriti"os o -ara in"estigar laacti"idad metablica!

bB %ndicadores de -:Es esencial -ara detectar "ariaciones en la acide8 o alcalinidad

del medio causadas -or el metabolismo bacteriano!

! Los medios de culti"o usados en el laboratorio /ueron:

• Agar nutriti"o: est6 com-uesto de etracto de carne1 -e-tona1 ClNa1

agar y agua destilada! &e usa como medio de culti"o general -ara lamayor -arte de los microorganismos y como base -ara la -re-aracinde medios selecti"os y enri.uecidos!

• Agar sangre: com-uesto -or etracto de carne1 -e-tona1 ClNa1

sangre1 agra y agua destilada! Lle"a como base el agar nutriti"o y se

le adiciona sangre des,brinada en una -orcin del =<50>1-rinci-almente sangre de cone#o1 carnero y caballo ya .ue o/recen





buenas reacciones3emolíticas! No se usa sangre 3umana -rocedente de banco -uesto

.ue contiene citrato .ue -uede in3ibir el crecimiento de algunosmicroorganismos y glucosa .ue /alsea las reacciones de 3emolisis1a-arte de anticuer-os y agentes antimicrobianos!A.uí crecen la mayoría de bacterias -atgenas y algunas le"aduras!Este medio es adecuado -ara el culti"o y aislamiento demicroorganismos eigentes1 tambi9n -ara estudiar la acti"idad3emolica!

La 3emolisis -uede ser de ? ti-os: F 3emolisis: clari/icacin-arcial de la sangre en una colonia1 .ue -roduce un cambio de colorgris "erdoso o -ardusco en el medio H 3emolisis: 8ona declari,cacin com-leta de la sangre alrededor de las colonias debido

una lisis com-leta de eritrocitos .ue -roduce una eliminacin de lasangre del medio deba#o de las colonias y a su alrededor I 3emolisis:sin lisis o cambio de color en los eritrocitos!

• Agar MacConJey: est6 com-uesto -or -e-tona1 lactosa1 ClNa1 sales

biliares1 cristal "ioleta1 ro#o neutro1 agar y agua destilada! Los mediosusados -ara el aislamiento selecti"o de enterobacterias secaracteri8an -or contener lactosa y un indicador de cambio de - .uedetecta la acti"idad /ermentadora sobre este a82car! Adem6s estosmedios de culti"os lle"an sustancias in3ibidoras de

Gram -ositi"os! Las sales biliares y el cristal "ioleta act2an comoin3ibidores! El indicador "ira a ro#o ladrillo en medio acido! Lasbacterias .ue /ermentan la lactosa -roducen colonias de color ro#o.ue -ueden estar rodeadas de una 8ona o-aca debida a la-reci-itacin de sales biliares las no /ermentadoras dan coloniasincoloras m6s o menos trans-arentes!

• Agar EM Eosina a8ul de metilenoB: com-uesto -or -e-tona1 /os/ato

di-ot6sico1 lactosa1 eosina a8ul de metileno1 agar y agua destilada! &uuso es -r6cticamente el mismo del agar MacConJey! El a8ul demetileno act2a como indicador e in3ibidor al mismo tiem-o! Las

colonias /ermentadoras de lactosa -resentan un tono "ioleta m6s omenos intenso! +or e#em-lo Esc3eric3ia Coli origina colonias muyoscuras1 /recuentemente con brillo "erde met6lico .ue /acilita sudeteccin en aguas contaminadas con materias /ecales!

• Agar AM& Manitol salB: es un medio de culti"o altamente selecti"o1

-ues tiene una alta concentracin de cloruro de sodio .ue im-ide elcrecimiento de la mayoría de las bacterias1 sin embargo tolera losesta,lococos! Adem6s el culti"o contiene manitol como 2nicocarbo3idrato y ro#o /enol como indicador del -1 cuyo 6mbito de"ira#e esta entre - K14 ro#oB y - 1K amarilloB!Cuando 3ay -roduccin de 6cido a causa de la /ermentacin demanitol1 las colonias a-arecen rodeadas de un 3alo amarillo el medio-ermanecer6 sin cambio de color o acentuara a ro#o medio si las





bacterias no /ermentanel manitol!

• Caldo nutriti"o: es un medio lí.uido com-uesto -or una in/usin decarne1 ClNa1 -e-tona1 etracto de le"adura y tambi9n /os/atodisdico! Es usado como base -ara otros caldos .ue -uedan contenerm6s nutrientes!

%%! (E'%(&

• Conocer di/erente ti-os de siembra: Diseminacin1 agotamiento e

incor-oracin de microrganismos!• )eali8ar la -re-aracin de -lacas +etri con Agar nutriti"o!

• )eali8ar el aislamiento de bacterias de dos muestras: mayonesa y.ueso!

%%%! MA'E)%ALE& )EAC'%(&

5! E*%+(&

• %ncubadora

• Cocinilla

• Micro-i-eta

;! MA'E)%ALE&

• Es-6tula

• +lacas +etri

•

+untas de micro-i-eta• Agua destilada

• Algodn

• Asa de Jalle

• o#as de cuaderno

?! MA'E)%AL %(L(G%C(

Medios de culti"o:• Agar nutriti"o

%! ME'(D(L(G%A DE ')AA(





5! &iembra de culti"o-or agotamiento.uesoB:

aB Licuar el agar nutriti"o1 "erter a-roimadamente ;0ml-or -laca y de#ar solidi,car! &e debe mantener unatem-eratura constante!

bB +oner cierta cantidad adecuada del agar nutriti"o en las-lacas +etri y es-erar a .ue se solidi,.ue!

cB Olamear la es-6tula -ara esterili8ar y no alterar el-roceso de culti"o! *sar un matra8 con agua destilada!Diseminar el .ueso en un -oco de agua destilada!

dB 'omar una asada de muestra y sembrar en el medio deculti"o -or agotamiento sembrar la muestra -or

cuadrante!eB %ncubar a ?=°C -or ;4 3oras!/B (bser"ar el acumulamiento bacteriano!

;! &iembra de culti"o -or incor-oracin:

aB Licuar el medio de culti"o en una cocinilla de#ar .ue en mediode culti"o tenga una tem-eratura de 4=< =0 °C!

bB Diluir el alimento a-roimadamente 5P500!

cB A7adir 5 ml en una -laca +etri y agregar ;0 mla-roimadamente del medio de culti"o agar nutriti"oB!dB omogenei8ar la muestra reali8ando mo"imientos de derec3a a

i8.uierda de arriba 3acia aba#o y en diagonal!eB De#ar solidi,car e incubar a ?=°C -or ;4 3oras!/B (bser"ar el crecimiento bacteriano!

?! &iembre -or diseminacin

aB Diluir el alimento a-roimadamente 5P500!bB En una -laca +etri con agar nutriti"o solidi,cado agregar 015 ml

o 5ml de la disolucin de alimento!cB Diseminar la muestra con una asa de drigalsJy esteril!dB %ncubar en ?= °C -or ;4 3oras!





Ilustración # $lacas $etri con ediode cultivo "a solidi%cadas $re$aradas $ara la sie&ra de &acterias





Ilustración ' inserción de uestra de aliento en una $laca Petri

Ilustración ( incu&acion de las $lacas $etri "a se&rada las &acterias





! )E&*L'AD(&

Ilustración ) uestra de las $lacas $etri des$u*s de la incu&ación

Ilustración + $laca $etri utili,ada coo testigo $ara veri%car el &uen desarrollo de la $ractica





Ilustración - uestra %nal del cultivo de ueso " a"onesa con notorio creciiento&acteriano en el del ueso





Ilustración / cultivo "a encu&ano $or #( 0oras

%! %L%(G)AO%A

• García Gusta"oB

• García Martos +B3tt-:PPbooJs!google!com!coPbooJsQidR4NK.$cJr**CS-gR+A=TSl-gR+A=TSd.RagarUnutriti"oSsourceRblSotsRM8-()nto3SsigR)/#=+a+n(K8C54atA0)t JS3lRes45TSsaR@SeiR/%+5*-Oe?gsA&.u%GgAVS"edR0CDKAEV'g$W"Rone-ageS.Ragar>;0nutriti"oS/Rt rue

• Elmer X1 $oneman1&te-3en Allen $oneman! Diagnostico

MicrobiologicoP Microbiological diagnosis: 'eto y Atlasen color ed Y%nternet Medica +anamericana ;00

Dis-onible en: 3tt-:PPbooJs!google!com!coPbooJsQidR#yue$roKKCS-gR+ASd.R3emolisisS3





lResSsaR@SeiRJN"?*-aAG.rOsA&;goDSredir[escRyW"Rone-ageS.R3emoli sisS/R/alse

%%! D%&C*&%(N DE L(& )E&*L'AD(&

• En el día ,nal de la determinacin y obser"acin de las bacterias

incubadas en cada muestra traba#ada en el laboratorio se -udoobser"ar colonias de bacterias en el caso del .ueso lo .ue nos indic.ue la muestra de .ueso tenia gran cantidad de bacterias1 -or elcontrario en el caso de la mayonesa solo se -udo "isuali8ar

-e.ue7as a-ariciones de bacterias esto nos indica .ue la mayonesautili8ada como muestra estaba bien -re-arada y conser"ada encondiciones adecuadas! La otra muestra utili8ada como testigo del-roceso de siembra nos indic .ue el traba#o reali8ado -ara lasiembra se reali8 correctamente -ues no mostraba bacteriasadicionales a las .ue las muestras de alimento generaban! Lo .uenos indic .ue las bacterias o -e.ue7as colonias de bacteriasobser"adas en las muestras si -ertenecían a los alimentos!

%%%! C(NCL*&%(NE&

• En el desarrollo de la -r6ctica se -odo conocer los di/erentes ti-os

de culti"o y la /orma en la .ue se reali8a cada uno de ellos -ara

-oder desarrollar correctamente la siembra de bacterias!

• &e -re-ar nuestro medio de culti"o en este caso el agar nutriti"o

-ara -oder -osteriormente reali8ar el culti"o de bacterias!

• &e traba# con dos muestras de comida.ueso1 mayonesaB1 con esto

se determin las condiciones en las .ue se encontraba cada uno deestos -roductos !

%@! )EC(MENDAC%(NE&





• Lim-iar correctamente el 6rea donde se reali8ara el laboratorio! +ues

en este laboratorio cabe resaltar la im-ortancia de traba#ar en unambiente esterili8ado!

• eri,car .ue los materiales a utili8ar est9n correctamente lim-ios!

• *tili8ar la indumentaria adecuada -ara e"itar accidentes o -ueda

inter/erir en el desarrollo del laboratorio!• +oner atencin y seguir las indicaciones del docente encargado del

laboratorio!• *tili8ar correctamente la incubadora!

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