Lab. Chimica Analitica II _HPLC Applicabile a: amminoacidi proteine acidi nucleici idrocarburi...

Lab. Chimica Analitica II _ HPLC

Applicabile a:

amminoacidi

proteine

acidi nucleici

idrocarburi

carboidrati

prodotti farmaceutici

pesticidi

antibiotici

steroidi


Effetto della dimensione delle particelle e del flusso sull’altezza H del piatto teoricoDimensioni colonna: 30 x 2.4 mmSoluto: N,N-dietil-n-aminoazobenzeneFase mobile: esano, CH2Cl2, isopropanolo

Effetto della dimensione del campione sull’altezza H del piatto teorico


Requisiti:

Pressioni fino a 430 atm

Uscita priva di pulsazioni

vflusso da 0.1 a 10 ml/min

componenti resistenti alla corrosione

controllo di flusso ad alta riproducibilità

Tipi di pompe utilizzati:

alternative a pistone o diaframma

a siringa o a spostamento

pneumatiche o a pressione costante


Problematiche::

• Accuratezza e precisione dipendenti dalla siringa

• Difficilmente applicabili ad automazione


Caratteristiche del rivelatore ideale: Sensibilità adeguata

Buona stabilità e riproducibilità

Risposta lineare in un ampio intervallo

Tempo di risposta breve

Elevata affidabilità e facilità d’uso

Fattore di risposta uniforme o sensibilità specifica

Metodo di rivelazione non distruttivo

Volume interno minimo per ridurre l’allargamento di banda

Tipi di rivelatori:

proprietà di massa: indice di rifrazione, costante dielettrica, densità

proprietà del soluto: assorbanza UV-Vis, fluorescenza, corrente di diffusione


Cella di flusso a Z:

• V = 1 – 10 l

• l = 2 – 10 mm

• pmax = 40 atm

• noti anche come rivelatori a lunghezza d’onda fissa

• utilizzano una lampada Hg a bassa pressione

• basso livello di rumore (2 x 10-5 AU)

• non sensibile a variazioni di temperatura, flusso, composizione della fase mobile

• Lungo tempo di vita della lampada (> 1 anno)

• fissa: 254, 250, 313, 334, 365 nm


• spettrofotometro a scansione con reticoli a diffrazione

• possibilità di registrare un cromatogramma a fissa o a diverse per ogni picco

• possibilità di utilizzo di rivelatori diode array

possibilità di ottenere diagrammi 3D

Spettri di assorbimento dell’eluito di una miscela di tre steroidi, acquisiti ad intervalli di 5 secondi


• rivelatori a tre filtri a cuneo semicircolari 4000 – 690 cm-1

• rivelatori FT-IR

• l = 0.2 – 1 mm, V = 1.5 – 10 l

• utilizzano rivelatori fotoelettrici a 90° rispetto al raggio d’eccitazione

• Sorgente a Hg o Xe, filtri o monocromatori a reticolo per isolare la radiazione

• elevata sensibilità

• possibilità di incrementare la fluorescenza mediante trattamento preliminare dei campioni (es. 5-dimetilaminonaftalen-1-solfonil cloruro = cloruro di dansile)

• Possono avere limiti di linearità inferiori ai rivelatori di assorbanza (0.1 AU)


• Possono rivelare la maggior parte dei soluti, purché RI del soluto sia diverso da quello della fase mobile

• Sensibili alla temperatura, non al flusso

• Sensibilità inferiore agli altri rivelatori

• Non applicabili all’eluizione in gradiente

• Utili su scala preparativa


• Basati su: amperometria, coulombometria, voltammetria, conduttimetria

• Elettrodo in Pt, Au, grafite vetrosa o pasta di grafite

• V = 1 – 5 l

• Applicabile alla determinazione di disolfuri e tioli


•Rivelatori a spettrometria di massa

•Rivelatori NMR


Cromatogramma di eluizione LSC


Reazioni di silanizzazione per la produzione di fasi legate

Possibili gruppi funzionali sulla superficie della silice


Effetto della lunghezza di catena sulle prestazioni di una colonna di silossano in fase inversa riempita con particelle di 5 m.

MeOH: H2O = 50%, 1ml/min

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