La valutazione del materiale seminale - unite.it · /ml (180-360 x 106/ml) ... La valutazione del...
Transcript of La valutazione del materiale seminale - unite.it · /ml (180-360 x 106/ml) ... La valutazione del...
La valutazione del materiale seminale
La valutazione del materiale seminale
Due finalità
1.
Scopo diagnostico
2.
Scopo tecnologico-commerciale
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del riproduttore
Sviluppo corporeo
Stato di nutrizione e gestione
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del riproduttore
Corretta conformazione in relazione alla razza ed età
Treno posteriore ed appiombi
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del riproduttore
Ispezione e palpazione dello scrotoalterazioni di forma
alterazioni di consistenza
Valutazione del riproduttore
Circonferenza scrotale
Alla pubertà
fra 28-30 cm
Carattere ad elevata ereditabilità
Valutazione del riproduttore
Parametro legato a numerosi fattori (età…)
Correlato al peso testicolare
Proporzionale alla quantità
di spz/die
(17M die/g parenchima)
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del riproduttore
LibidoIstinto alla procreazioneTempo di reazioneConsiderato carattere genetico ereditabileLegato agli ormoni (estrogeni/testosterone)
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del riproduttore
MontaInterazione con la femminaFiuta genitali esterniSollevamento labro superiore (rif. Flehmen)ErezioneEiaculazione
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del riproduttore
Tempi di eiaculazioneBovino 3-5 secondiCavallo 1 minuto e oltreSuino diversi minutiCane diversi minutiGatto pochi secondi
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del riproduttore
MontaImpennataAncoraggio al bacinoPropulsione con spinta eiaculatoriaEiaculazione vaginale (craniale)
La valutazione del materiale seminale
Metodo di raccolta del seme
Vagina artificiale
Elettroeiaculazione
Massaggio ghiandole accessorie
La valutazione del materiale seminale
Ritmo di raccolta del seme
Addestramento da 15-18 mesi
Fino a 2 anni 1/settimana
Da 2 anni bisettimanale
Massimo a 16 raccolte/mese (con riposo)
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del materiale seminale
Valutazione macroscopica e chimica
volume (contenitore graduato o peso)coloreodorepH (6.4-6.9)
La valutazione del materiale seminale
Valutazione del materiale seminale
Valutazione microscopica
concentrazionemotilitàmorfologiaintegrità
di membrana
La valutazione del materiale seminale
Concentrazione
camere contaglobuli
(Burker, Thoma…)
conteggio spz
in ambienti a volume predefinito
La valutazione del materiale seminale
Concentrazione
Considerato il gold
standard
Limite legato alla preparazione del campione
Tempo necessario
La valutazione del materiale seminale
La valutazione del materiale seminale
Camera di Burkern°
x h x dil
x conv
Concentrazione
Spettrofotometro
Contatori elettronici (Coulter
Counter)
CASA
La valutazione del materiale seminale
Concentrazione
Bovino: 1.250 x 106/ml (600-2.800 x 106/ml)Cavallo: 240 x 106/ml (180-360 x 106/ml)Cane: numero totale di spermatozoi più
indicativo
La valutazione del materiale seminale
Motilità
soggettiva
oggettivaCASASQA
La valutazione del materiale seminale
Motilità
Soggettiva
motilità
di massa (0-100%)
qualità
del movimento (da 0 a 5)
La valutazione del materiale seminale
Motilità
Oggettiva
Analizzatori computerizzati (CASA)
La valutazione del materiale seminale
Motilità
CASA, componenti:
Microscopio a contrasto di fase neg.Telecamera ad alta frequenzaElaboratore
La valutazione del materiale seminale
CASA
PRINCIPI GENERALI
Individuazione della testaRiscontro della testa nei successivi fotogrammi (Tracking)Ricostruzione della traiettoriaCalcolo dei parametri numerici
La valutazione del materiale seminale
Parametri cinetici degli spermatozoi–Velocità sul percorso medio(VAP)–Velocità lineare (VSL)–Velocità curvilinea (VCL)–Ampiezza del movimento laterale della testa (ALH)–Frequenza di attraversamento della traiettoria (BCF)–Indice di rettilineità (STR)–Linearità (LIN)–Ovalizzazione della testa (ELONG)–Superficie media della testa (SIZE)–Coefficiente di Wobble (WOB)–Danza (DANCE)–Danza media (MeDANCE)
Valori generali
Valori traccia per traccia
Parametri cinetici degli spermatozoi
Sottopopolazioni
Electroejaculated
semen Epididymal
semen
Cluster 1(mean± sd)
Cluster 2(mean± sd)
Cluster 3(mean± sd)
Cluster 1(mean± sd)
Cluster 2(mean± sd)
Cluster 3(mean± sd)
% population 12.46 68.26 19.28 14.47 63.72 21.80
VAP (μm/s) 53.56±47.11a 135.34±69.04b 71.09±76.11c 10.51±6.54d 108.58±57.98e 76.33±56.49de
VSL (μm/s) 14.58±13.82a 111.96±65.96b 59.38±71.66c 7.49±5.65d 91.19±55.84e 50.05±53.95f
VCL (μm/s) 132.58±70.42a 202.41±81.97b 110.79±96.28c 24.58±15.96d 192.35±88.34e 158.36±88.4de
ALH (μm) 7.20±3.29a 6.66±2.79b 3.75±2.89c 1.25±0.87d 6.76±2.7b 6.94±3.48b
BCF (Hz) 49.06±14.91a 43.73±12.77b 28.09±24.21c 28.03±25.32d 44.9±14.04e 38.83±22.6f
STR (%) 29.05±13.49a 78.47±17.69b 72.64±21.55c 69.87±24.3d 77.60±19.16e 52.35±29.75d
LIN (%) 10.13±4.85a 51.21±21b 43.08±25.03c 38.06±26.3d 43.25±18.12e 27.02±22.63d
AREA (μm2) 61.46±23.14a 61.24±18.03a 79.87±23.07b 77.31±29.68d 63.68±19.4e 86.98± 21.04d
ELONG (%) 4.85±3.8a 6.13±4.42b 2.64±2c 2.24±2.02d 6.05±2.91b 2.41±2.56d
WOB (%) 36.82±12.86a 63.25±17.51b 55.82±20.7c 50.87±22.82d 53.80±14.71e 45.25±17.41d
DANCE (μm2/s) 1118.11±1126.1a 1476.36±1031.3b 622.32±845.0c 39.39±37.61d 1456.00±1044.5b 1304.78±1274.6d
MeDANCE
(%) 0.92±0.93a 0.16±0.1b 0.11±0.09c 0.06±0.07d 0.19±0.12e 0.63±0.96f
Morfologia
Valutazione della forma degli spermatozoi
• colorazione (Diff-Quik, o altre)
• metodo di Hankock
La valutazione del materiale seminale
Morfologia
classificazione alla porzione interessata
1. a. della testa2. a. del tratto intermedio3. a. della coda
La valutazione del materiale seminale
Morfologia
classificazione in base alla sedea. primariea. secondariea. terziarie
La valutazione del materiale seminale
Vitalità
Colorazione classica (eosina/nigrosina)
Colorazioni in fluorescenza
CFDA; SYBR-14
PI; Hoechst
33258;etidio
omodimero;
La valutazione del materiale seminale
Ulteriori test
Integrità
dell’acrosoma
(FITC-PSA/PNA)
Potenziale dei mitocondri (Rodamina
123, Mito Tracker, JC-1)
Stato di capacitazione
(CTC, Merocianina
540)
Frammentazione del DNA (acridina orange)
La valutazione del materiale seminale
I test di laboratorio sono accurati nella valutazione delle caratteristiche del materiale seminale?
Procedura essenziale per oggettivizzazione e comparazione
Parametri usuali non predittivi della fertilità
Spesso non identificano soggetti subfertili
Mancanza di correlazione fra test classici e recenti rispetto
Fertilizzazione in-vivo
Fertilizzazione in-vitro
Mancanza di correlazione evidenziata in numerose specie
La valutazione del materiale seminale
Differenti condizioni ambientali
Microclima epididimaleEiaculazioneAmbiente vaginale/uterinoLegame con regioni della giunzione U.T.CapacitazioneInterazione con zona e oocita
La valutazione del materiale seminale
Fattori di variabilità
individuale a livello cellulare
Regolazione del volume cellulare
Legame con l’epitelio oviduttale
Capacità
di fertilizzare (capacitazione)
La valutazione del materiale seminale
Regolazione del volume cellulare
In condizioni di iperosmosi
o ipoosmosi
Capacità
di perdere o acquisire liquidi
Capacità
acquisita a livello epididimale
La valutazione del materiale seminale
Regolazione del volume cellulare
Fisiologicamenteeiaculazione (da iperosmosi
a isosmosi)
Tecnologicamentecrioconservazione
shock ipertonico al congelamentoshock ipotonico allo scongelamento
La valutazione del materiale seminale
Regolazione del volume cellulare
Meccanismo che prevede la perdita di elettroliti
Effetto legato alla fosforilazione/defosforilazione
delle
protein
kinasi
Adattamento del citoscheletro
La valutazione del materiale seminale
Test per valutare la regolazione del volume
Hypoosmotic
swelling
test
per valutare la funzionalità
della membrana
ambiente ipotonico determina curvatura/arricciamento degli spz
La valutazione del materiale seminale
Test per valutare la regolazione del volume
Hypoosmotic
swelling
test –
limiti
soggettivo
non individua gli spz
che esplodono
La valutazione del materiale seminale
Test per valutare la regolazione del volume
Osmotic
challange
Impiego di un contatore elettronico
Volume cellulare determinato come resistenza elettrica al passaggio degli spz
in un capillare
La valutazione del materiale seminale
Test per valutare la regolazione del volume
Osmotic
challange
Determina il ∆
volumetrico comeVipertonico
Visotonico
La valutazione del materiale seminale
Interazione con l’ovidutto
Spesso deposizione relativamente lontana dall’ovulazione
epitelio sequestra gli spermatozoi
adesione e rilascio controllato
significato di stabilizzazione e aumento sopravvivenza
La valutazione del materiale seminale
Interazione con l’ovidutto
Spesso deposizione relativamente lontana dall’ovulazione
epitelio sequestra gli spermatozoi
adesione e rilascio controllato
significato di stabilizzazione e aumento sopravvivenza
La valutazione del materiale seminale
Interazione con l’ovidutto
Individuato il legame carboidrato-recettore
Importante la normale architettura dello spermatozoo
Non ancora sviluppato un test in-vitro
La valutazione del materiale seminale
Capacitazione
Cascata di modificazioni metaboliche e strutturali
Rendono lo spermatozoo in grado di fertilizzare
Difficoltà
nello studio in-vivo
La valutazione del materiale seminale
Capacitazione
Condizioni ambientali tipiche:
elevata concentrazione di bicarbonato
elevata concentrazione di CO2
influenza di fattori ovulatori
La valutazione del materiale seminale
Capacitazione
–
Valutazione
Clortetraciclina
(calcio)
Merocianina
540
Annessina
V
La valutazione del materiale seminale