La trasformazione batterica: batteri (Streptococcus pneumoniea) avirulenti (ceppo R) sono trasformati in batteri virulenti (ceppo S) da

batteri virulenti (ceppo S) uccisi dal calore

Uccisione con il calore

Ceppo S Ceppo R

Ceppo S ucciso dal caloreCeppo S Ceppo R

DNA

Ceppo RCeppo S

trasformazione

proteinelipidipolisaccaridiRNA

Nessuna trasformazione

trasformazione

L’infezione di cellule del batterio Escheirichia coli da parte del fago T2 avviene mediante il DNA del

virus, non mediante le sue proteine

32P

35S

Solo nel DNA

Solo nelle proteine

La radioattività (e il DNA) entra

La radioattività (con le proteine) non entra

Citosina

H

H

C C

C

C

N

HN

O C

NH

Le basi azotate

- + .....

+ - .....

N C

C

NC

HC

N

N

N H

H

C C

H

Adenina

N C

C

NC

HC

N

N

O

C C

Guanina

NH

H

H+ - .......

.

- +

.........

+ -

..........

C C

C H

H

C

C

N

HNH

O

O C

Timina

H

Purine

Pirimidine

La struttura del DNA

H H

HO

H

H2C5’

O

BASE …..

C4’

C3’ C2’

C1’

H

H

PO-

O-

O

O

P

P

5’

5’

3’

3’

1’

1’

P

P

1’

1’5’

5’

3’

3’

Legami idrogeno

AT

C GLegami idrofobici

Nucleotide

Il DNA è costituito da due catene polinucleotidiche antiparallele avvolte tra loro a doppia elica

Il modello della doppia elica del DNA

Dati cristallografici: la figura ottenuta dalla diffrazione dei raggi x suggeriva che il DNA è una lunga molecola lineare, costituita a due filamenti paralleli avvolti a doppia elica

Dati chimici:

1) Le molecole puriniche sono nello stesso numero delle molecole pirimidiniche (A+G=T+C);

2) Ciascuna delle molecole puriniche ha una e una sola molecola pirimidinica in uguale numero e precisamente: A=T, G=C

Conoscenze preesistenti: il DNA è un polimero costituito da un numero molto elevato di subunità: i nucleotidi (fosfato + desossiribosio + 1 base azotata)

Originalità del modello di Crick e Watson: la complementarità di coppie di basi (una purina e una pirimidina) che con i loro legami idrogeno stabilizzano la struttura a doppia elica e che, mediante la separazione dei due filamenti polinucleotidici e l’incoprorazione di nucleotidi complementari sullo stampo dei filamenti preesistenti, garantiscono la precisione della replicazione del DNA e la correttezza della trasmissione ereditaria

Ammettendo che le basi azotate si trovino all’interno della doppia elica, solo l’affacciamento di una purina con una pirimidina garantiscono il diametro realmente riscontrato della doppia elca

Replicazione semiconservativa: l’esperimento di Meselson e Sthal

Prima generazione

Seconda generazione

Incubazione di cellule pesanti in 14N

Centrifugazione di DNA in gradiente di cloruro di cesio.

Le colture cresciute per molte generazioni in un terreno contenente 15N e 14N forniscono le posizioni di controllo per le bande di DNA “pesante “ e “leggera”.

15N

14N

controlli

Bande di DNA “pesante e “leggera”

Quando le cellule fatte crescere in 15N vengono trasferite in un terreno 14N, la prima generazione produce una banda di DNA intermedia e la seconda produce due bande, una intermedia e una leggera.

Replicazione semiconservativa

Una banda 15N14N

Due bande 15N14N e 14N14N

Solo il modello semiconservativo di replicazione di DNA spiega questi risultati

conservativa

Una banda intermedia tra 15N14N e 14N14N

dispersiva

Una banda 15N14N

Due bande 15N15N e 14N14N

Due bande 15N15N e 14N14N

15N14N

Replicazione semiconservativa del DNA nei cromosomi degli eucarioti

G1 S

BrUdR

G2 Mitosi (M1)

G1 S

BrUdR

G2 Mitosi (M2)

2n

Blocco della M1 con colchicina

4n

La forca replicativa

5’

5’

3’

3’

girasi elicasi SSB primasi RNA primer DNA polimerasi III

DNA polimerasi IDNA ligasi

frammento di Okazaki

leading strandlagging strand

Aminoacidi e proteine

C C

H

NH2

R

O

HOC C

H

NH2

O

HOR’

NH

aminoacido 1 aminoacido 2

legame peptidico

dipeptide

H2O

elica

foglietto

struttura primaria: sequenza lineare degli aminoacidi

struttura secondaria: avvolgimenti o ripregamenti

elementari della catena polipeptidica, dovuti a legami idrogeno tra aminoacidi vicini

nella sequenza lineare

struttura terziaria: struttura tridimensionale della catena polipeptidica dovuta alle

interazioni fra aminoacidi anche lontani nella sequenza lineare

C N

struttura quaternaria: composizione di più catene polipeptidiche, uguali o diverse, a formare una proteina

multimerica

omodimero

In ultima analisi le strutture secondaria, terziaria e

quaternaria sono dovute alla struttura primaria

Un gene una catena polipeptidica

Alleli diversi possono

differire per la sostituzione di

un solo aminoacido in

una catena polipeptidica

Frammentando progressivamente un polipeptide, è possibile averne un’impronta digitale (fingerprinting) attraverso lo spostamento dei frammenti in 2 diversi solventi: così è possibile identificare il frammento che differisce fra l’allele normale e quello mutato, fino a

individuare l’aminoacido cambiato

Nella catena dell’emoglobina umana, l’aminoacido in posizione 6 è l’acido glutammico nell’allele normale

dell’emoglobina A (HbA) ed è la valina nell’allele mutato dell’emoglobina S (HbS)

Colinearità tra gene e catena polipeptidica

Mediante l’analisi di cotrasduzione con il fago P1, si sono mappate diverse mutazioni in diversi siti del gene TrpA (per la sintesi

del triptofano) in Escheirichia coli

Mediante l’analisi di fingerprinting si sono localizzati, nella catena polipeptidica, le

posizioni degli aminoacidi caratteristici di ciascuna mutazione mappata N

15 22 49 175

15: Lys->STOP; 22: Phe->Leu; 49: Glu->Val,Gln,Met; 175: Tyr->Cys.La sequenza dei siti mutati nel gene è identica alla sequenza delle posizioni degli

aminoacidi sostituiti, anche se le distanze non corrispondono esattamente

Struttura dell’RNA

CC

C

C

N

HN H

O

OC

Timina

CH

HH

H

P

P

5’

5’

3’

3’

1’

1’

P

P

5’

5’

3’

3’

1’

1’

A

U

C

G

OH

desossiribosio

H

HO

H

H2C5’

O

BASE …..

C4’

C3’ C2’

C1’

H

P

O

H

O-

O-

O ribosio

H

Uracile

RNA compl. DNA

A

C

G

T

DNARNA

trascritti

Filamenti di RNA non ibridato

Ibrido RNA-DNA

Ibrido RNA-DNA

4 3 2 13 2 12 11

La Trascrizione

TGTTGACA TATAAT

-35 -1011-15 nucl

5-8 nucl

Sito di inizio

promotore terminazioneC-GG-C

C-G

C-GG-C

G-C

RNA

rRNA 80% 23S, 18S, 5S

tRNA 15% 4S

mRNA 5% vario

Tipo abbondanza coeff. sed.

anticodone

Sito di attacco dell’aminoacido

Natura molecolare delle mutazioni geniche

Sostituzione di base

A G

TC

transizione

trasversione

TAG AGTAGTAGTAG

TAGTAGTAG TAGTAG

T

T

Delezione di base

Inserzione di base

TAGTAGTAG TAGTAG

AGTAGTAGTAG

purina pirimidina

TAGTAG TAGTAG

CODICE GENETICO

Per codificare 20 aminoacidi, non bastano 4 nucleotidi e nemmeno 16 coppie di nucleotidi;

sono necessarie combinazioni di almeno 3 nucleotidi (triplette) che sono 64

TAGTAGTAG TAGTAG

1 2 3

1 32 tripletta

tripletta

Lettura per giustapposizione

Lettura per sovrapposizione

Natura del codice genetico

TA TAGTAG TAGTAG

1 2 3

1 32 tripletta

tripletta

CG

Se la lettura del codice fosse stata per sovrapposizione, una singola sostituzione di base avrebbe comportato la modificazione di tanti aminoacidi quante sono le basi che fanno parte dell’unità codificante (nell’esempio presente, supponendo un codice a triplette, gli aminoacidi modificati da una singola sostituzione di base avrebbero dovuto essere 3); invece si osserva la modificazione di un solo aminoacido; pertanto la lettura del codice è per giustapposizione.

rII+ rII

proflavina proflavina

FCO soppressore

rII+

rII+

rII+

rII

rII

+ -

rII+ rII

proflavina proflavina

rII

proflavina

rII+

2 mutazioni successive di segno opposto (inserzione + delezione), separabili per crossing over, ripristinano la corretta cornice di lettura; quindi il codice è letto senza interruzioni e le sfasature dovute alla prima mutazione si mantengono a valle di essa fino a che non sono neutralizzate dalla seconda

3 mutazioni successive dello stesso segno, separabili per crossing over (3 inserzioni o 3 delezioni) ripristinano la corretta cornice di lettura; le sfasature dovute alla prima mutazione si mantengono a valle di essa fino a che non sono neutralizzate dalla seconda e dalla terza; quindi il codice è a triplette

TAGTTAGTAG TAGAGTAGTAGTAG TAGTAGTAGTGTA TAGAG

Decifrazione del codice genetico

UUU 27/64

UUG, UGU, GUU 9/64

UGG, GUG, GGU 3/64

GGG 1/64

UUU UUUUUU

PhePhe Phe

Costruendo un mRNA in vitro costituito di un unico nucleotide (X), ci sarà una sola tripletta (XXX); effettuando la sintesi proteica in vitro, si formerà un polipeptide costituito da un unico aminoacido (Z-Z-Z-…), codificato dalla tripletta XXX

Costruendo un mRNA in vitro costituito di una miscela di nucleotidi (X e Y) in proporzioni note (p e q), ci sarà una miscela di triplette in proporzioni prevedibili (p3 XXX; p2q XXY, XYX, YXX; pq2 XYY, YXY, YYX; q3 YYY); effettuando la sintesi proteica in vitro, si formerà un polipeptide costituito da una miscela di aminoacidi nelle stesse proporzioni delle triplette che li codificano

U:G = 3:1 Phe 27/64

Val 12/64

Leu, Cys 9/64

Gly 4/64

Trp 3/64

Usando mini mRNA (1 sola tripletta), capaci di determinare il legame tra il tRNA complementare e il suo aminoacido consentendone l’identificazione, e mRNA costituiti da copolimeri ripetitivi della stessa tripletta (XYW)n, si è completamente decifrato il codice genetico

I codoni

UUU PheUUC PheUUA LeuUUG Leu

UCU SerUCC SerUCA SerUCG Ser

UAU TyrUAC TyrUAA STOPUAG STOP

UGU Cys UGC CysUGA STOPUGG Trp

CUU LeuCUC LeuCUA LeuCUG Leu

CCU ProCCC ProCCA ProCCG Pro

CAU HisCAC HisCAA GlnCAG Gln

CGU ArgCGC ArgCGA ArgCGG Arg

AUU IleAUC IleAUA IleAUG Met

ACU ThrACC ThrACA ThrACG Thr

AAU AsnAAC AsnAAA LysAAG Lys

AGU SerAGC SerAGA ArgAGG Arg

GUU ValGUC ValGUA ValGUG Val

GCU AlaGCC AlaGCA AlaGCG Ala

GAU AspGAC AspGAA GluGAG Glu

GGU GlyGGC GlyGGA GlyGGG Gly

I codoni sono le triplette di basi di mRNA che codificano per specifici aminoacidi; sono complementari e antiparallele sia alle corrispondenti triplette sul DNA del gene trascritto, sia a quelle degli anticodoni, presenti sul tRNA corrispondente; la prima base è all’estremità 5’, l’ultima all’estremità 3’

Il codice genetico non è ambiguo: ogni codone codifica per un solo aminoacido

Il codice genetico è degenerato: molti aminoacidi sono codificati da più di un codone

Il codice genetico è universale: quasi tutti i viventi condividono lo stesso codice genetico

Anticodoni e tRNA

Ogni specie di tRNA ha un anticodone specifico e lega un solo aminoacido

DEGENERAZIONE DEL CODICE

1) Alcuni aminoacidi si legano a più di un tRNA

2) Alcune basi all’estremità 5’ dell’anticodone (corrispondenti all’ultima base, in 3’, del codone) presentano un appaiamento non stringente (vacillamento) che riconosce più di una base in 3’ del codone; quindi alcuni tRNA riconoscono più di un codone

G U, C

C G

A U

U A, G

I U, C, A

al 5’ dell’anticodone al 3’ del codone

CODONI NON SENSO

UAA, UAG, UGA

1) Usati come mini mRNA non legano alcun

aminoacil-tRNA

2) Prodotti in seguito a una singola sostituzione di base a partire da triplette molto simili, producono, in corrispondenza della loro posizione, un’interruzione della catena polipeptidica (mutazioni non senso)

3) Le mutazioni non senso possono essere neutralizzate da mutazioni soppressori esterne al gene: si tratta di mutazioni nell’anticodone di un tRNA (p.es. GUA -> UUA, anticodone di UAA)

I codoni non senso sono detti di terminazione perché interrompono la sintesi di una catena polipeptidica

Sintesi proteica e traduzione

50 S

30 S

23 S

16 S

5 S

Il sito di inizio della traduzione nell’mRNA è una tripletta AUG, GUG preceduta di poco da sequenze complementari all’rRNA 16 S; tale tripletta codifica per N-formil-metionina (in E. coli)

Sito ASito P

aa2aa3aa1aa1aa2aa1

il tRNA con l’anticodone complementare al codone esposto nel sito A vi si lega, essendo già associato al proprio aminoacido (aminoacil-tRNA)

Sul sito P è presente un tRNA entrato in precedente, cui è legato il nascente polipeptide (peptidil-tRNA);il polipeptide si stacca dal tRNA sul sito P e si lega all’aminoacido legato al tRNA sul sito A

Il tRNA libero sul sito P si allontana, il codone e il peptidil-tRNA sul sito A si spostano sul sito P

Quando sul sito A giunge un codone di terminazione, al posto di un tRNA vi si lega un Fattore di Rilascio che impedisce l’allungamento del poipeptide e conclude il processo

AAAA

Negli eucarioti l’RNA prima di entrare nel citoplasma subisce una maturazione: al 5’ viene aggiunta una 7-metilguanosina, al 3’ una catena di poli-A

Non tutto l’mRNA viene tradotto: una parte, corrispondente agli introni dei geni, viene staccato e rimosso; l’altra parte, corrispondente agli esoni dei geni, viene saldata e tradotta