La Proteomica nelle

Malattie Renali

Cattedra e Clinica Nefrologica Ospedale Clinicizzato

SS. Annunziata, Chieti

Mario Bonomini

Università degli Studi

“G. d’Annunzio”

Chieti - Pescara

La proteomica è la Scienza Omica che studia il proteoma (insieme di

PROTEine espresse dal genOMA). Essa comprende una serie di tecniche

che permettono identificazione, quantificazione e caratterizzazione di un

set globale di proteine e peptidi presenti in un campione biologico.

La proteomica è la Scienza Omica che studia il proteoma (insieme di

PROTEine espresse dal genOMA). Essa comprende una serie di tecniche

che permettono identificazione, quantificazione e caratterizzazione di un

set globale di proteine e peptidi presenti in un campione biologico.

PROTEOMICA

L’approccio proteomico alla identificazione delle proteine non richiede

ipotesi a priori circa quali proteine possano essere presenti e permette la

simultanea analisi di tutte le proteine presenti anche in miscele

complesse.

L’approccio proteomico alla identificazione delle proteine non richiede

ipotesi a priori circa quali proteine possano essere presenti e permette la

simultanea analisi di tutte le proteine presenti anche in miscele

complesse.

L’analisi proteomica consente anche di evidenziare singole isoforme

proteiche e modificazioni proteiche post-traslazionali.

L’analisi proteomica consente anche di evidenziare singole isoforme

proteiche e modificazioni proteiche post-traslazionali.

• Proteomic technologies are being used with increasing frequency in the renal community.

• Proteomic studies are most directed at finding markers of disease progression, diagnosis, or responsiveness to therapy.

Ambiti di applicazione della Proteomica in Nefrologia

• Fisio(pato)logia renale• Nefropatie glomerulari• CKD• AKI• Nefrolitiasi• Uropatia ostruttiva• Trapianto renale• Emodialisi• Dialisi peritoneale• Tossicità uremica• Tossicità farmacologica

PROTEOMICA TISSUTALE

L’analisi proteomica del tessuto renale può

essere impiegata per identificare quali proteine

sono presenti, per confrontare l’abbondanza

proteica tra zone tissutali o condizioni, e per

analizzare modificazioni post-traslazionali.

L’analisi proteomica del tessuto renale può

essere impiegata per identificare quali proteine

sono presenti, per confrontare l’abbondanza

proteica tra zone tissutali o condizioni, e per

analizzare modificazioni post-traslazionali.

http://www.hkupp.org

DatabaseKidney  Glomerulus   2DGE-LC-Based Proteomics   2DGE-Based Proteomics  Proximal Tubule  Distal Tubule  Collecting Duct    Rat IMCD    Rat IMCD Phosphoprotein  Others   Transcriptomics & Proteomics

NEJM 2009

2011

2013

PROTEOMICA URINARIA

3.0 10.0non linear pH10.03.0 non linear pH

Mappa urina soggetto normale

Cortesia G. Candiano, Ospedale Gaslini, Genova

Naturally Occurring Human Urinary Peptides for Use in Diagnosis of Chronic Kidney Disease

Studio mediante elettroforesi capillare+spettrometria di massa di campioni urine di 230 pazienti con CKD e 379 soggetti sani

Identificazione di 273 potenziali biomarcatori associati a CKD e creazione di un modello di classificazione basato su tali markers (frammenti di collagene, proteine ematiche, proteine rene-specifiche)

Successiva validazione “in cieco” del modello in 110 pazienti affetti da CKD

Dimostrata superiorità del modello vs. creatininemia

Good et al, Molecular & Cellular Proteomics, 2010

Peptide patterns distinguishing patients with CKD

from Healthy Controls

Source proteins and peptide distribution of CKD biomarkers

www.humanproteinpedia.org; accession number HuPA_00670

Urinary Proteomics in Diabetes and CKD

“A panel including 65 urinary biomarkers correctly identified diabetic nephropathy from diabetes without compromized renal function (97% sensitivity and specificity), and patients who were microalbuminuric at sampling and progressed toward overt diabetic nephropathy over 3 years.

….Many of the biomarkers were fragments of collagen type I, and quantities were reduced in patients with diabetes or diabetic nephropathy.

….Analysis of the urinary proteome may allow early detection of diabetic nephropathy and may provide prognostic information.”

Rossing et al, JASN 2008

RILEVANZA FISIOPATOLOGICA DEI BIOMARCATORI URINARI PROTEOMICI DI CKD

I frammenti del collagene urinari, riflettendo il fisiologico turnover della matrice extracellulare, non sono semplici prodotti di degradazione; essi possono essere indicativi di processi fisiopatologici e fornire informazioni malattia-specifiche in un singolo test diagnostico

CKD

↓ degradazione matrice extracellulare

↑ fibre collagene insolubili

↑ matrice extracellulare e alterazioni strutturali

perdita di funzione e fibrosi

RILEVANZA FISIOPATOLOGICA DEI BIOMARCATORI URINARI PROTEOMICI DI CKD

Alterazioni della matrice extracellulare riflesse attraverso il proteoma urinario, possono rappresentare uno stadio precoce nel processo patologico della CKD e antagonizzare il patologico accumulo di matrice extracellulare può rappresentare un nuovo valido approccio terapeutico.

Mullen et al, Curr Opin Nephrol Hypertens 2011

22 pazienti nefropatici con diabete tipo 2

Irbesartan 300 mg/die (n=11) Placebo (n=11)

Basal Basal2 years 2 years

Mischak H and Rossing P, Nephrol Dial Transplant 2010

STUDI CLINICI IN CORSO CON STRATIFICAZIONE DEI PAZIENTI IN BASE AD ANALISI DI PROTEOMICA URINARIA

ICU TRAINING SET• 30 pazienti ricoverati in ICU con FR normale, con raccolta

longitudinale di campioni urinari

• 16/30 successivo sviluppo di AKI (↑ creatininemia)

• Caratterizzazione e confronto del pattern peptidico urinario (elettroforesi capillare+spettrometria di massa) dei pazienti con AKI vs pazienti che hanno mantenuto FR normale

• Sensibilità 92%, specificità 90%

Kidney International (2010) 78, 1252–1262

Validazione risultati ICU training set

ICU VALIDATION SET• Studio di coorte di fase II, prospettico, in cieco

• 20 pazienti in ICU

• Il pattern peptidico urinario ha correttamente identificato 8/9 pazienti che hanno sviluppato AKI

ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELLTRANSPLANTATION VALIDATION SET

• 31 pazienti con trapianto (quale differente eziologia di AKI)

• In 13 sviluppo di AKI (sensibilità pattern peptidico urinario 94%, specificità 82)

Mass (Da) CE time (min) Protein Remarks

1439.66 29.82 a-1 antitrypsin

912.54 20.06

2080.99 20.20 Albumin

2356.16 19.52

2427.19 19.58

2540.28 19.68

2639.35 19.78

1081.66 20.73 b-2 Microglobulin

1399.59 28.53

2603.30 20.07

2716.38 20.19

1654.79 23.13 Collagen 1 a(I)

1737.78 31.00

1250.55 27.93

3359.57 31.90

2942.30 22.23

2007.94 22.10 Collagen 1 a(III)

1825.78 19.41 Fibrinogen a chain

1882.80 20.14

2559.18 19.41

Caratteristiche dei polipeptidi urinari inclusi nel pattern di marcatori AKI

RegulationRegulation

RegulationRegulation

DownDown

UpUp

Efficacia diagnostica precoce del pattern AKI urinario

sviluppo di un modello di identificazione di rigetto acuto,

basato su 14 biomarcatori urinari

validazione in cieco del modello: corretta diagnosi in 16/18

casi di rigetto subclinico e in 10/10 casi di rigetto clinico (gradi

Banff Ia/Ib)

Il modello è attualmente impiegato in uno studio multicentrico di fase III in corso in Germania

Diagnosis of subclinical and clinical acute T-cell-mediated rejection in renal transplant patients by urinary proteome analysis

Metzger et al, Proteomics Clin Appl 2011

Limitazioni ad un diffuso impiego clinico della Proteomica in Nefrologia

• Carenza di protocolli condivisi su raccolta e analisi campione biologico

• Studi di ridotte dimensioni campionarie

• Costi

• Necessità di personale tecnico specializzato

Iniziative volte a favorire l’applicabilità clinica della Proteomica in Nefrologia

• Standardizzazione metodi di raccolta e preparazione del campione biologico

• Disponibilità di ampi e aggiornati database

Database di Proteomica Urinaria Umana

Siwy et al, Proteomics Clin Appl 2011

Iniziative volte a favorire l’applicabilità clinica della Proteomica in Nefrologia

• Standardizzazione metodi di raccolta e preparazione del campione biologico

• Disponibilità di ampi e aggiornati database

• Studi multicentrici di validazione

• Studi con più adeguati disegni e dimensioni

• Attività collaborative nazionali e internazionali

Gruppo di Studio SINScienze Omiche

SOCIETÀ ITALIANA DI PROTEOMICA

It-HPP MithocondriaInitiative by the Italian Proteomics Association on a Mitochondria Integrated Biology Program, on Chronic Not Transmissible Diseases. Approved by the Human Proteome Project Consortium (September 2012)

International partnerISNAFF (www.isnaff.org) for Canada and USA,IFCC, cQQP commission, EU JPND,

Other National Societies SIN (ItPA GC, June 13th, 2012)SIRNA (Rome, Nov 2012)

In Nefrologia vi è stringente necessità di migliori markers diagnostici e terapeutici.

La Proteomica ha dimostrato in ambito nefrologico capacità di identificazione di nuovi set di biomarcatori, indicativi di progressione, diagnosi o risposta al trattamento.

La traducibilità clinica degli studi di Proteomica, iniziale e promettente (pur se a lento ritmo di crescita), presenta alcune limitazioni che ne hanno precluso un’ampia diffusione.

Le migliorate tecnologie e le attività in corso lasciano ragionevolmente ritenere un prossimo uso della Proteomica nella pratica clinica, più diffuso ed efficace.

CONCLUSIONI