LA PROBLEMATICA DELL’OCRATOSSINA A NELLA FILIERA VITI-VINICOLA

A cura del Prof. Stefano Della Posta

www.agrariosereni.it

LA FILIERA VITI-VINICOLA

ALIMENTOALIMENTO FUNGFUNGHI PRODUTTORIHI PRODUTTORI

Cereali (frumentoCereali (frumento,, orzoorzo,, maismais,, segale,segale,avena), legumi, cacao, noci,avena), legumi, cacao, noci, ccaffèaffè,,bbirrairra, carni di maiale, carni di maiale

uva, uva passa, succo d’uva, mosto, uva, uva passa, succo d’uva, mosto, vinovino,,

A.A. nigernigerAspergillusAspergillus carbonariuscarbonarius,,AspergillusAspergillus ochraceusochraceusPenicilliumPenicillium verrucosumverrucosum

ALIMENTI CONTAMINATI DAALIMENTI CONTAMINATI DA OCRATOSSINA AOCRATOSSINA AEE RELRELATIVI FUNGHI PRODUTTORIATIVI FUNGHI PRODUTTORI

Aspergillus nigerAspergillus carbonarius

Aspergillus carbonarius

Aspergillus niger aggregate

Principali specie ocratossigene isolate da uva

Caratterizzata da testa conidiofora nera biseriata con conidi grandi globosi e rugosi

Comprende diverse specie e/o varietà difficili da distinguere tra di loro e caratterizzata da testaconidiofora nera-marrone e conidi molto più piccoli di A. carbonarius e di forma variabile.

Penicillium verrucosum

•Ifa conidiofora

•Colonie in piastra

NN

HHCCOOROOR22 OHOH

RR11

OO

CHCH 33

HH

OO

HH

OO

44

1010

OcratossinaOcratossina

ABC

ClHCl

HH

C2H5

R1 R2

FENIL ALANINA ISOCUMARINA

EFFETTI TOSSICIEFFETTI TOSSICI

OTA è trovata con frequenza nel sangueOTA è trovata con frequenza nel sangueumano. Viene associata alla Nefropatiaumano. Viene associata alla NefropatiaEndemica deiEndemica dei BalcaniBalcani (BEN) ed è(BEN) ed èsospettata essere causa di tumori del trattosospettata essere causa di tumori del trattourinario (UTT) e di nefriti interstizialiurinario (UTT) e di nefriti interstizialicroniche in Nord Africa.croniche in Nord Africa.

UOMOUOMO

Attività cancerogena,Attività cancerogena, nenefrotossicafrotossica,,genotogenotossicassica, mutagen, mutagenaa,, teratogeteratogenana,,fetotofetotossicassica,, immunosoppressiimmunosoppressiva.va.

ANIMALIANIMALI

CLASSIFICACLASSIFICAZZIONIONE DI ALCUNE MICOTOSSINE SULLA BASEE DI ALCUNE MICOTOSSINE SULLA BASEDEL RISCHIO CANCEROGENO PER L’UOMODEL RISCHIO CANCEROGENO PER L’UOMO (IARC, 1993)(IARC, 1993)

aadadattatattata dada:: International Agency for Research onInternational Agency for Research on CCancerancer.. Monographs on the Evaluation of CarcinogenicMonographs on the Evaluation of Carcinogenicrisk to humansrisk to humans. IARC Lyon, France, VOL. 56, 1993, 523. IARC Lyon, France, VOL. 56, 1993, 523--524524

GrupGruppopo 2B2B AflatoAflatossissinnaa MM11

OcratoOcratossinassina AAToTossinessine didi FusariumFusarium verticillioidesverticillioides

CCaancerogenencerogene per gli animaliper gli animalie possibili cancerogeni pere possibili cancerogeni perl’uomol’uomo

GrupGruppopo 11 AflatoAflatossissinne Be B11,, BB22, G, G11,, GG22CCaancerogenencerogeneper l’uomoper l’uomo

EUROPEAN FOOD SAFETYAUTHORITY

•Il gruppo di esperti scientifici è giunto alla conclusioneche l’OTA si sia dimostrata potente nefrotossina inalcune specie animali, quali roditori e suini. L’entità del danno renale dipende dalla dose e dalla duratadell’esposizione.

•Vi sono prove sempre più numerose che la tossicità renaledell’OTA e i suoi effettigenotossici (che cioè provocanodanni al DNA, il materiale genetico delle cellule) siaprobabilmente dovuti a produzione di radicali liberinocivi per le cellule (il cosiddetto “stress ossidativocellulare”).

•Il gruppo di esperti scientifici ha elaborato perl’OTA, sulla base di tutte le informazioni disponibili, una dose settimanale tollerabile di:120 ng per chilogrammo di peso corporeo(innalzando il precedente valore stimato sui 20-60 ngper chilogrammo di peso corporeo).

LIVELLI DI OCRATOSSINA ALIVELLI DI OCRATOSSINA Ain campioni diin campioni di vino rossovino rosso

+

-NumeroNumerocampionicampioni MediaMediaIntervalloIntervallo

ConcConc. OTA (. OTA (ppbppb))

IncidenzaIncidenza

Germania, Lussemburgo, Regno Unito, Nord FranciaGermania, Lussemburgo, Regno Unito, Nord Francia

23%23% 0.020.02<0.01<0.01 -- 0.230.233030

Nord Italia, FranciaNord Italia, Francia

16%16% 0.070.07<0.01<0.01 -- 0.780.787676

CentroCentro--nord Italia, Francianord Italia, Francia

59%59% 0.140.14<0.01<0.01 -- 2.552.558383

Sud Italia, Sicilia, GreciaSud Italia, Sicilia, Grecia95%95% 1.151.15<0.01<0.01 -- 3.313.312020

OTTENEDER & MAJERUS (2000), FoodOTTENEDER & MAJERUS (2000), Food AdditivesAdditives andand ContaminantsContaminants.. Vol.Vol. 17, No. 9, 79317, No. 9, 793--798.798.

Livelli diLivelli di ocratossinaocratossina A in campioni di vino*A in campioni di vino*

MatriceMatrice

VINO BIANCOVINO BIANCO

Positivi/totalePositivi/totale

4/94/9

MediaMedia

0.2900.290

IntervalloIntervallo

VINO ROSSOVINO ROSSO 37/3837/38 1.2271.227<0.01<0.01––7.637.63

VINOVINOROSE’ROSE’ 7/87/8 0.6640.664<0.01<0.01––1.151.15

<0.01<0.01––0.970.97

Concentrazione di OTAConcentrazione di OTA ((ppbppb))

*VISCONTI, PASCALE, CENTONZE. J.*VISCONTI, PASCALE, CENTONZE. J. ChromatogrChromatogr. A, (1999) 864, 89. A, (1999) 864, 89--101.101.

Vinorosso > rosè > bianco

Uva passaalta incidenza e alti livelli dicontaminazione

Succo d’uvarosso > bianco

Influenza del tipo di vino e dellazona di produzione

OCRATOSSINA AOCRATOSSINA A

Regolamenti e linee guidaRegolamenti e linee guida

OcratossinaOcratossina AA

RegolamentoRegolamento CE n. 1525/98 del 16 luglio 1998CE n. 1525/98 del 16 luglio 1998che stabiliva i tenori massimi ammissibili diche stabiliva i tenori massimi ammissibili di

alcuni contaminanti dei prodotti alimentari;alcuni contaminanti dei prodotti alimentari;

Circolare n. 10 del 9/10/1999Circolare n. 10 del 9/10/1999 settembre 1999settembre 1999del Ministero della Sanitdel Ministero della Sanitàà;;

Decreto 7 Aprile 2000Decreto 7 Aprile 2000 -- Gazzetta UfficialeGazzetta Ufficiale n. 97n. 97

••RegolamentoRegolamento CE n. 466/2001CE n. 466/2001 nellnell’’allegato II alallegato II alpunto 2 specifica il tenore di OTA in diversepunto 2 specifica il tenore di OTA in diversematrici alimentari;matrici alimentari;

••Direttiva 2002/26/CEDirettiva 2002/26/CE relativa ai metodi direlativa ai metodi dicampionamento e di analisi per il controllocampionamento e di analisi per il controlloufficiale del tenore diufficiale del tenore di OcratossinaOcratossina A nei prodottiA nei prodottialimentari;alimentari;

••Direttiva 2005/5/CEDirettiva 2005/5/CE modifica la Direttivamodifica la Direttiva2002/26/CE per quanto riguarda il metodo di2002/26/CE per quanto riguarda il metodo diprelievo dei campioni per il controllo ufficialeprelievo dei campioni per il controllo ufficialedelldell’’OTA.OTA.

••Regolamento CE n. 123/2005Regolamento CE n. 123/2005 modifica lmodifica l’’allegatoallegatoII del Regolamento CE n. 466/2001 indicando ilII del Regolamento CE n. 466/2001 indicando ilcontenuto di OTA in diversi alimenti fissando lacontenuto di OTA in diversi alimenti fissando laconcentrazione diconcentrazione di 22 μμg/Kgg/Kg come valore massimocome valore massimoaccettabile per iaccettabile per i vini e bevande a base di mostovini e bevande a base di mostodd’’uva.uva.

OcratossinaOcratossina AAReg.Reg. (CE) N°123/2005(CE) N°123/2005del 26 gennaio 2005del 26 gennaio 2005

•Cereali non lavorati: 5,0μμg/kg

•Derivati di cereali: 3,0μμg/kg

•Uve secche: 10,0μμg/kg

•Caffè torrefatto e mac.: 5,0μμg/kg

•Succo d’uva: 2,0μμg/kg

•Vino rosso, bianco rosè: 2,0μμg/kg

•Alimenti per bambini a base di cereali:

0,5μμg/kg

•Alimenti dietetici destinati a finimedicinali speciali: 0,5μμg/kg

OIDIOBOTRITETIGNOLA

Misure di prevenzione per l’OTA in vignetoMisure di prevenzione per l’OTA in vigneto

•A. carbonarius e A. niger si avvantaggiano di ferite odanni meccanici per la colonizzazione dell’uva.

•Il pHbasso e l’alto contenuto in zuccheri, in presenzadi temperature elevate, sono un ambiente ideale per illoro sviluppo sull’uva.

•La lotta contro la peronospora, l’oidio, la muffa grigia e la tignolache danneggiano l’uva:

(il più attivo prodotto è lo Switch: Ciprodinil + Fludioxonil, provatosu Cabernet Sauvignon e cultivar Greche ).

Switch

Ciprodinil

Fludioxonil

LUNGA PERSISTENZA;

BUONA GESTIONE DELL’EPOCA DI VENDEMMIA;

OTTIMA COMPLEMENTARIETÁ E DIFFERENTE ATTIVITÁ DELLE SOSTANZE.

Grafico: attività di SWITCH nel contenimento di OTA su varietàMontepulciano in Italia (Aziendale= difesa tradizionale conantibotritico NON efficace su Aspergillus spp, e prove con Switch: nellefasi pre-chiusura grappolo (B), invaiatura (C) e pre-raccolta (D).

•Rimozione dei residui vegetali infetti, riduzionedell’eccessivo ombreggiamento, concimazioni equilibrate evitando eccessi di azoto.

•Varietà resistenti.

Decreto 7 Aprile 2000Decreto 7 Aprile 2000 -- Gazzetta UfficialeGazzetta Ufficiale n. 97n. 97

“Linee guida nella produzione vitivinicola “Linee guida nella produzione vitivinicola per la prevenzione della potenzialeper la prevenzione della potenzialecontaminazione da micotossine”contaminazione da micotossine”

Fasi del ciclo produttivo esaminate dal decretoFasi del ciclo produttivo esaminate dal decreto

gestione dell’agrogestione dell’agro--ecosistema vignetoecosistema vigneto

vinificazionevinificazione

raccolta, trasporto e stoccaggioraccolta, trasporto e stoccaggio

uva essiccatauva essiccata

RACCOLTA, TRASPORTO E STOCCAGGIORACCOLTA, TRASPORTO E STOCCAGGIORACCOLTA, TRASPORTO E STOCCAGGIO

Condizioni di raccolta:Condizioni di raccolta: maturazionematurazione, sanità,, sanità,condizioni climatiche.condizioni climatiche.

Raccolta:Raccolta: allontanamento dei grappoli marci, seallontanamento dei grappoli marci, sepossibile evitare la raccolta meccanica.possibile evitare la raccolta meccanica.

Trasporto:Trasporto: rapido e in appositi contenitori onderapido e in appositi contenitori ondeevitare pressature.evitare pressature.

Processo di vinificazione:Processo di vinificazione: da avviare entro le 24da avviare entro le 24ore.ore.

Decreto 7 Aprile 2000Decreto 7 Aprile 2000 -- Gazzetta UfficialeGazzetta Ufficiale n. 97n. 97

VINIFICAZIONEVINIFICAZIONEVINIFICAZIONE

Linee guida del decreto in accordo con ilLinee guida del decreto in accordo con ilprotocollo HACCP soprattutto per l’igiene protocollo HACCP soprattutto per l’igiene ambientaleambientale

Recipienti in legnoRecipienti in legno

pieni di vino opieni di vino otrattati con SOtrattati con SO22

certificazione da assenzacertificazione da assenzadi micotossinedi micotossine

Favorire inizio rapido della fermentazioneFavorire inizio rapido della fermentazione(Influenza del tipo della fermentazione)(Influenza del tipo della fermentazione)

CCP IN VINIFICAZIONE

PIGIATURA;

MACERAZIONE;

FERMENTAZIONE ALCOLICA: riduzione a carico deilieviti (diversi ceppi di Saccharomyces cerevisiae;

FERMENTAZIONE MALOLATTICA: riduzione a carico deiceppi malolattici come Lactobacillus plantarum eOenococcus oeni ;

TRATTAMENTI CON BENTONITE, GELATINE ECARBONE ENOLOGICO.

Vendemmia 2001

Mosto M fineAF fine MLF

fine

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

OTA

ug/L

M = Macerazione

AF = fermentazione alcolica

MLF = fermentazione malolattica

Variazione del contenunto in OTA durante la vinificazione

METODI ANALITICI DIDETERMINAZIONE DEL FUNGO E

DELL’OCRATOSSINA A

METODI MOLECOLARI: PCR E PCR REAL TIME.

METODI RAPIDI: es. OCRACARD

METODI TRADIZIONALI: HPLC, TLC.

METODI IMMUNO-ENZIMATICI: ELISA.

FTIR:(Fourier Trasformation Infra Red).

ANALISI OTA*•Estrazione con colonna IAC (immunoaffinità)•Identificazione e dosaggio mediante RP-HPLCcon rivelatore a fluorescenza

*in A. Leitner, P. Zöllner, A. Paolillo, J. Stroka, A. Papadopoulou-Bouraoui, S. Jaborek, E. Anklamb, W. Lindner,Anal. Chim. Acta (2002) 453, 33-41.

CROMATOGRAMMA STANDARD OTA

• COLONNA SUPELCO 250mm x2,6mm (C18)

• FASE MOBILE:CH3CN/H20/CH3COOH49,5/49,5/1 v/v/v.

• FLUSSO: 1 mL/min;

• FLUORESCENZA: eccitazione 333nm, emissione 460 nm.

Grazie per lacortese

attenzione!

OCRACARD

Diluire 6 mL di vino precedentemente preparato in

6 mL di PBS.

CROMATOGRAFIALa cromatografia fu ideata dal botanicoMichail Semenovich Tswett nel 1901,che attraverso esperimenticromatografici, scoprì che la cosiddetta'clorofilla cristallizzabile' era in realtà lamiscela di due composti diversi (quelliche ora noi conosciamo come clorofillaa e b .

LE TECNICHE CROMATOGRAFICHEincludono diverse metodologie analiticheche permettono la separazione dimiscele.

(1872-1919)

ESPERIMENTO DI TSWETT

Tswett procedette ponendo una piccolaquantità di estratto alla sommità di unacolonna di vetro contenente polvere dicarbonato di calcio (fase stazionaria), elavando successivamente il campionefacendo percolare attraverso la colonnadell'etere di petrolio (fase mobile). A manoa mano che l'etere di petrolio fluivatrascinando con sé il campione, questi siseparava in bande di diverso colore (da quiil nome "cromatografia"), ciascuna dellequali procedeva verso il fondo dellacolonna con diversa velocità.

PRINCIPI GENERALI DELLASEPARAZIONE CROMATOGRAFICA:

I metodi cromatografici sfruttano la diversaaffinità delle molecole e degli ioni nei confronti didue fasi diverse:

FASE MOBILE: H2O, CH3CN, CH3OH, CH3COOH ecc.

FASE STAZIONARIA: SILICE, COLONNE C18 ecc.

Nella cromatografia più una sostanza è affine conla fase stazionaria, più a lungo viene trattenuta ecosì il suo scorrimento viene rallentato rispetto aquello delle sostanze meno affini a tale fase.

In ogni istante del processo cromatografico, sistabilisce una certa competizione tra le due fasi.Durante l’eluizione la sostanza si distribuiscedinamicamente in ogni punto della colonna, dalla fasestazionaria a quella mobile e viceversa.

Il tempo di eluizione in un sistema cromatograficodipende dal tempo che ogni sostanza trascorre nellafase stazionaria, mentre il tempo trascorso nella fasemobile è lo stesso per tutti i componenti della miscela

TECNICHE CROMATOGRAFICHE

• Le diverse TECNICHE CROMATOGRAFICHE vengono descritte in base almeccanismo principale di separazione che interviene in ciascuna di esse.

• ADSORBIMENTO: la fase stazionaria è un solido in polvere; sullasuperficie dei granuli si trovano dei siti attivi che possonostabilire dei legami deboli con le molecole della miscela daseparare.Per questo fenomeno si può parlare di cromatografia diadsorbimento: più precisamente, se la fase mobile è un gas, si hala cromatografia gas-solido (GSC); se è un liquido, si ha lacromatografia liquido-solido (LSC).

• RIPARTIZIONE: la fase stazionaria è un liquido, che impregna unsolido granulare inerte, in cui le sostanze da separare sisolubilizzano. Durante l’eluizione le molecole si ripartisconodinamicamente tra le due fasi che devono essere fra loroimmiscibili, secondo la diversa solubilità di ciascuna di esse.Questo meccanismo di ripartizione viene sfruttato sia nellacromatografia gas-liquido (GLC) sia nella cromatografialiquido-liquido (LLC).

•SCAMBIO IONICO: la fase stazionaria è costituita damacromolecole con siti attivi ionizzati (in pratica una resina ascambio ionico), i cui controioni possono essere scambiati con altri,aventi carica dello stesso segno, eluiti con la fase mobile. Suquesto meccanismo si basa la cromatografia a scambio ionico(IEC).

•ESCLUSIONE: la fase stazionaria è un solido poroso o, piùcomunemente, un gel con pori le cui dimensioni variano secondo lacomposizione chimica e il modo in cui viene preparato. Lemolecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei poridel gel e vi rimangono per un certo tempo; le molecole troppograndi, però, vengono escluse dai pori e perciò escono dallacolonna in tempi molto brevi. Su questo meccanismo si basa lacromatografia di esclusione (SEC).

HPLCHigh Pressure Liquid Cromatography

1. Fasi mobili;

2. Pompe;

3. Iniettore;

4. Colonna;

5. Rivelatore;

6. PC per gestire idati;

7. Cromatogrammacon i risultati.

FOTO HPLC