LA FISIOPATOLOGIA DEL DIFETTO EMOPOIETICOLA FISIOPATOLOGIA DEL DIFETTO EMOPOIETICONELL’ANEMIA DI FANCONINELL’ANEMIA DI FANCONI

CARLO DUFOUR

XXIII CONGRESSO AIEOPABANO, 22-24 ottobre 2006

AUTOSOMICA-RECESSIVA e X-LINKED Grande eterogeneità clinico-biologica

Ca 1200 casi descritti in letteratura. M/F ratio = 1.3/1

Frequenza Eterozigote 1:300 (USA - Europa)1:100 (Sud Africa)

ANEMIA DI FANCONIANEMIA DI FANCONI

Prevalenza 1- 5 / milione

13 Geni Identificati (A, B, C, D1, D2/BRCA1,E,F,G,J,L, M, PALB2,)

Aumentata fragilità cromosomica spontanea e indotta da alchilanti bifunzionali (DEB, MMC).

FENOTIPO CLINICOFENOTIPO CLINICO

Insufficienza Midollare Progressiva

Anomalie Somatiche

Suscettibilità ai Tumori

ANOMALIE SOMATICHEANOMALIE SOMATICHE1207 PAZIENTI

Cute 60%Bassa Statura 57%Anomalie arti superiori 48%Ipogonadismo 37%Ipogonadismo 3%Testa 27%Occhio 26%Reni 23%Ritardo di sviluppo 13%Peso nascita 2500 12%Orecchio 10%

Anomalie arti inferiori 8%Ipereflessia 7%Altre anomalie scheletro 6%Anomalie cardio-polmonari 6%Anomalie gastro-intestinali 4%Altre 5%

Anomalie assenti o non riferite 25%Solo bassa statura 1%Solo cute 3%Cute + bassa statura 4%Bassa statura e/o cute 8% -----------Normali/ quasi normali 25-41%

SUSCETTIBILITA‘ ai TUMORISUSCETTIBILITA‘ ai TUMORI

Incidenza globale > 15%. (leucemia, K cell squamose testa, collo, esofago, MDS, encefalo, Wilms, ginecolocici).

25% of casi SENZA aplasia precedente.

Il tumore può essere la sola manifestazione della AF

Femmine più colpite dei maschi per tumori solidi (anche se NON si considerano i tumori ginecologici). Gene FANCB ?

SUSCETTIBILITA‘ ai TUMORISUSCETTIBILITA‘ ai TUMORI

Problema emergente dato l‘attuale miglioramento dei risultati del TMO sull‘aplasia.

Pazienti FANCD1/BRCA2 hanno altissima incidenza di cancro.

Più di un tumore/paziente sotto i 5 anni di vita

INSUFFICIENZA MIDOLLARE PROGRESSIVAINSUFFICIENZA MIDOLLARE PROGRESSIVA

Trombocitopenia

Anemia

Neutropenia

APLASIA

5 anni 10 anni

AUMENTO MCV

HbF e A g i

eritrocitario

Possono anticipare la citopenia

Clone citogenetico in circa 30% dei pazienti Anomalie radio rischio 5.5 volte maggiore di insuff midollare

Rischio anche per malformazioni cuore, rene testa, udito

Principale causa di morbilità e mortalità

EVOLUZIONE A MDS/LAEVOLUZIONE A MDS/LA

Più spesso associata a monosomia cr 7 e iso cromosoma 1q

Non è „automatica“ l‘evoluzione di MDS a LA Le anomalie citogentiche possono fluttuare

Gain di 3q indica maggior rischio che MDS morfologica progredisca a LMA (Tonnies, Blood 2003)

La morfologia rimane un importante marcatore di evoluzione verso MDS/AL

ANEMIA DI FANCONI. PERCHE‘ANEMIA DI FANCONI. PERCHE‘

Il pathway FA è inattivato (FANCF) in varie neoplasie (ovaio,

polmone, testicolo, utero) e in LMA (FANCA). Se il pathway FA è integro (non è FA) linee cellulari di K ovarico acquisiscono resistenza al Cisplatino.Taniguchi et al Nat med, 2003;9:568-574 .

2. Modello per evoluzione leucemica

3. Modello per insufficienza midollare

1. Malattia precancerosa

EVOLUZIONE A MDS/LEUCEMIAEVOLUZIONE A MDS/LEUCEMIA

1. TNF- e infiammazione hanno azione pro-leucemogenica.

2. Questa azione avviene tramite la produzione di ossidanti che causano instabiità genomica.

3. Anti infiammatori, anti-TNF- ed anti ossidanti possono avere un ruolo anti leucemogenico.

INSUFFICIENZA MIDOLLAREINSUFFICIENZA MIDOLLARE

La cellula staminale ematopoieticapresenta una esageratarisposta apoptotica a stimoli esogeniRio. P & Bueren J. Blood 2002 Sep 15;100(6):2032-9.

Aube M & Careau M; Stem Cells; 2002;20 (5):438-47.

Habi O, & Carreau M, Stem Cells 2005, Jul 14; ahead of print)

Quali stimoli esogeni?

Dove è il problema?

Come agiscono?

STIMOLI ESOGENI 1STIMOLI ESOGENI 1

Citochine MielosoppressiveCitochine Mielosoppressive

1. TNF- è aumentato nel siero dei patienti FA Shultz JC, Am J Hematol, 1993;42:196-201. Rosselli F, 1994; 83:-1225.

2.IFN- and TNF- sono „over-expressi“ nelle MNCs midollari

stimolate dei pazienti FADufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059 .

INTRACYTOPLASMIC EXPRESSION OF TNF-, IFN-, MIP-1 MIP-1 , FASL, FASL IN MARROW

MNCs OF FA PATIENTS

TNF - +CD3+% TNF - + 9.57(8.68) 7 0-21 0.00(0.00) 0 0-0 0.006CD3+ MRFI TNF - + 3.71(3.09) 2 1-8 1.00(0.00) 1 1-1 0.006 CD3- % TNF - + 6.29(6.57) 4 0-19 0.50(0.53) 0.5 0-1 0.016 CD3- MRFI TNF - + 1.86(0.90) 2 1-3 1.06(0.18) 1 1-1.5 0.045 IFN - CD3+% - IFN 8.57(7.91) 9 0-20 0.25(0.71) 0 0-2 0.013 CD3+MRFI - IFN 2.29(1.25) 2 1- 4 1.12(0.35) 1 1-2 0.021 CD3-% - IFN 5.57(7.07) 3 0-20 0.37(0.7) 0 0-2 0.014 CD3-MRFI - IFN 2.00(2.65) 1 1-8 1.00(0.00) 1 1-1 CD3+% FASL 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 CD3+% FASL 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 CD3-%FASL 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 CD3-%FASL 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 CD3+ MIPA1- CD3+ MIPA1- 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 CD3-%MIPA1- CD3-%MIPA1- 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0 0.00(0.00) 0 0-0

Mean (SD) Median Min-Max Mean (SD) Median Min- Mix PFA Patients Controls

Dufour C et al, Blood 2003

STIMOLI ESOGENI 2STIMOLI ESOGENI 2

Citochine MielosopressiveCitochine Mielosopressive

4. TNF- è dannoso per le cellule eritropoietiche primariein vitroDufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059

3. IFN-, TNF-, MIP 1- , FAS L nei topi FANCC fanno morire i progenitori ematopoietici per eccesso di apoptosi.Rathbun RK, Blood 1997,90:974-985, Whitney MA, Blood 1996;88:49-58, Haneline L, Blood,1998;91:4092-4098, Otsuki T, J Cell Physiol, 1999;179:79-86

BLOCCO DI TNF- IN VITRO. EFFETTO SULLA CRESCITA ERITROIDE di PAZIENTI FA

Patients Controls

BFU-e BFU-e

B

Patients Controls

CFU-eCFU-e

AP 0.043

P 0.043

Dufour et al , Blood 03

STIMOLI ESOGENI 3STIMOLI ESOGENI 3

Citochine MielosopressiveCitochine Mielosopressive

4. TNF- è dannoso per le cellule eritropoietiche in vitroDufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059

3. IFN-, TNF-, MIP 1- nei topi FANCC fanno morire i progenitori ematopoietici per eccesso di apoptosi.

Rathbun RK, Blood 1997,90:974-985, Whitney MA, Blood 1996;88:49-58, Haneline L, Blood,1998;91:4092-4098, Otsuki T, J Cell Physiol, 1999;179:79-86

5. TRAIL induce apoptosi in line cellulari linfobastoidi FANCA

APOPTOSI (Tunel)

FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAAmedium medium + Trail+ Trail

Microscopic images of TUNEL positive nuclei: apoptotic cells with fragmented DNA are stained bright green, non-apoptotic cells are stained blue with DAPI (magnification 20X).

Apoptosis was evaluated at single cell level by TUNEL in situ technique. The TUNEL reaction preferentially labels DNA strand breaks generated during apoptosis. This allows discrimination of apoptosis from necrosis.

APOPTOSI indotta da TRAIL

FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA

40

80

120

160

200

240

40

80

120

160

200

240

+ p 0.023

4h 16h

FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA

Cell lines were cultured in the presence or absence of 100 ng/ml Superkiller TRAIL and apoptosis was measured at 4, 16hours in culture by staining cells with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated annexin V.Flow cytometric results are expressed as median, maximum and minimum levels of percent increment Annexin V+ cells from seven experiments.

% in

crem

ent A

nnex

inV

+ c

ells

* p 0.023

*+

STIMOLI ESOGENI 4STIMOLI ESOGENI 4

Agenti OssidantiAgenti Ossidanti

6. L‘alternanza di IPOSSIA-RIOSSIGENAZIONE dà morte

prematura nelle cellule ematopoietiche midollari FANCC (-/-)„segnalando“ via p53 e up-regulando p 21 (Zhang X, Blood Jul 1;106 (1):75-85) 2005).

7.H2O2 induce morte nelle cellule FANCC-/- (Bagby and Alter, Semin

Hematol,2006, 4,5 147-156).

COME AGISCE COME AGISCE TNF-TNF-

1. Nei progenitori ematopoietici dei topi FANCC e FANCA, TNF- induce apoptosi via ROS

Vishehsaraei KM et al Blood on line Aug 18, 2005

L’antiossidante Se Met corregge l’apoptosi nei progenitoriematopoietici dei topi FANCA (-/-) esposti a TNF-.

COME AGISCE COME AGISCE TNF-TNF-

1. Nei progenitori ematopoietici dei topi FANCC e FANCA, TNF- induce apoptosis via ROS

2. Questo effetto è ASK1 e p38 dipendente

Dopo esposizione a TNF- i progenitori ematopoietici di topi FANCC(-/-); ASK1(-/-) crescono a livello WT

ASK-1(Apoptosis Signal Regulating Kinase 1)E’una kinasi ad azione pro-apoptotica.NO ASK = NO APOPTOSI

FANCC(-/-); ASK1(-/-)

WT

p38 è una protein kinasi “downstreamed” rispetto ad ASK-1 nella cascata apoptotica attivata dai ROS.

Vishehsaraei KM et al Blood on line Aug 18, 2005

Inibizione di p38 corregge l’apoptosi dei progenitoriematopoietici FANCA(-/-) a livello WT.

FANCAWT

COME AGISCONO COME AGISCONO TNF-TNF- ee IFN - IFN -

4.L‘ effetto negativo di TNF- e IFN- sui progenitori ematopoietici del topo FANCC è mediato da NO

Hadjur S., Blood 2003 May 15;101 (10):3877-84

L’esposizione a dosi crescentidi IFN- riduce il numero medio di colonie maggiormente in FANCC(-/-) che in WT

Il Blocco della produzione di NO riporta la crescta dei progenitori FANCC (-/-) a livello di WT dopo esposizione a IFN-

FANCC

WT

FANCC

WT

Le citochine mielosoppressive (TNF-,IFN-) e gli agenti ossidanti (H2O2) agiscono attraverso differenti mediatori intracellulari (ROS, NO, ASK-1, p38,STATs, PKR/Hsp70).

Tutti comunque conducono la cellula ematopoietica all’apoptosi.

SOMMARIOSOMMARIO

SOMMARIOSOMMARIO

INSUFFICIENZA INSUFFICIENZA MIDOLLAREMIDOLLARE

TNF-IFN-H2O2

APOPTOSI

ASK 1P38NOPKRHsp70STATs

CELLULA EMOPOIETICA FANCONI

IMPLICAZIONI CLINICHEIMPLICAZIONI CLINICHE

STUDIO PILOTA MULTICENTRICO CON

ANTI-TNF-α IN PAZIENTI CON:

 

1.   FANCONI ANEMIAFANCONI ANEMIA con INSUFFICIENZA MIDOLLARE SENZA DONATORE COMPATIBILE DI MIDOLLO OSSEO

2.   ANEMIA APLASTICA ACQUISITA RESISTENTE

ALL’IMMUNOSOPPRSSIONE E

SENZA DONATORE COMPATIBILE DI MIDOLLO OSSEO

Coordinatore

Carlo Dufour

Unità di Ematologia. ISTITUTO G.GASLINI,

 Largo G.Gaslini 5. 16147 Genova.

tel ++ 39 010 5636694

Fax ++39 010 5636714; e-mail: carlodufour@ospedale-gaslini.ge.itApprovazione Comitato di Etica, Ist. Gaslini. 2 dic 2004

TNF-

importante nell’apoptosi delle celluleemopoietiche FA