LA CROMATOGRAFIA LIQUIDA SU COLONNA PER LA …

LA CROMATOGRAFIA LIQUIDA SU COLONNA

PER LA PURIFICAZIONE DI PROTEINE

ANNALAURA SABATUCCI

PERCHÉ PURIFICARE

UNA PROTEINA? PER STUDIARE LA STRUTTURA

PER STUDIARE LA FUNZIONE

PROTEINE ENDOGENE

Estrazione da organi, tessuti fluidi

Composizione proteica del sangue

umanoProtidogramma (elettroforesi

sieroproteica)

PROTEINE RICOMBINANTI

Ottenute in sistemi di espressione

(batteri, lieviti, colture cellulari)

cDNA inserito in un plasmide

CROMATOGRAFIA

• LA CROMATOGRAFIA È UNA

TECNICA SEPARATIVA:

Fisicamente, separa una mistura nei

suoi singoli componenti.

• MA È ANCHE UNA TECNICA

ANALITICA:

Ogni componente separato dalla

mistura può essere identificato

grazie ad una sua proprietà. Nel

caso di proteine: peso molecolare,

carica totale, gruppi funzionali,

idrofobicità, affinità…

(Cromatos= COLORE quindi, in

senso più ampio, proprietà;

Grafia= tracciato)

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

SU COLONNA

Le COLONNE sono tubi DENTRO cui èimpaccata laFASE STAZIONARIA (una resina)

la FASE MOBILE(solvente organico o acquoso)flussa attraverso la resina:

- per gravità ,oppure- spinto da una pompa.

L’ELUIZIONE è il processo con cui lamistura da separare viene trasportataattraverso la colonna dal flusso dellafase mobile.

La velocità media con cui un analita simuove attraverso la colonna èdeterminata dal tempo che esso passanella fase mobile.

PRINCIPIO DI FUNZIONAME

NTO

Matrice solida(FASE

STAZIONARIA)

Mistura da separare

Flusso della fase mobile

-la mistura da separare viene inseritanella FASE STAZIONARIA.

- La fase stazionaria compete con lecomponenti della mistura.I componenti con una forte affinità per lafase stazionaria e/o bassa affinità per lafase mobile rimarranno bloccati;I componenti molto solubili nella fasemobile e/o con bassa affinità per la fasestazionaria eluiscono più facilmente e…

AVVIENE LA SEPARAZIONE!

-LA FASE MOBILE liquida (o gassosa) vieneflussata attraverso la fase stazionaria

- La mistura viene dissolta nella fase mobilee inizia a fluire attraverso la fase stazionaria.

SISTEMI DI RIVELAZIONE

PER CAMPIONI PROTEICI

IL PIU’ USATO E’ LO

SPETTROFOTOMETRO:

•Assorbimento della luce nell’UV/vis•UV: massimo assorbimento della proteina: 280 nm, dovuto principalmente ai triptofani.•Visibile: metalloproteine

Altri sistemi usati:

SPETTROFLUORIMETRO•Fluorescenza

RADIODETECTORS•Radioattività

IL CROMATOGRAMMA

FLUSSO TEMPO VOLUME

Dal rivelatore si ottiene un CROMATOGRAMMA in cui comparirannopicchi di assorbimento alla lunghezza d’onda selezionata (o di fluorescenza o diconteggi beta…) corrispondenti alla posizione di un campione, in funzione di

- tempo di ritenzione (tR) o- volume di eluizione (V el)

In FISICA, il flusso di una data grandezza fisicarappresenta la quantità della grandezza cheattraversa nell'unità di tempo una datasuperficie.

Nel nostro caso, il flusso F è dato dal volumedi fase mobile (V) che passa attraverso lasezione della colonna nell’unità di tempo (t)

F=V/t [ml/min] =>V =F*t [ml]

Dato il flusso, possiamo

convertire una grandezza

nell’altra facilmente

SISTEMI DI CROMATOGRA

FIA LIQUIDA SU COLONNA

•HPLC (High Performance (Pressure) Liquid

Chromatography)Alte pressioni: 5800 – 7000 psi (400 – 500 atm)

Colonne strette in acciaio

Piccola capacità di carico

Alta risoluzione

•FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography):

Basse pressioni : max 3-4 MPa (435-580 psi) 30-40 atm!

Colonne molto grandi in vetro o plastica

Grande capacità di carico

Bassa risoluzioneDEDICATA

ALLA

SEPARAZIONE

DI PROTEINE

FPLCFase mobile

(tampone)

pH-metro

Spettrofotometro

UV-visibile

Pompa

HPLC

Colonna

Tubo di uscita dallo spettrofotometro al ‘waste’

Tubo di uscita dello

spettrofotometro al

raccoglitore di frazioni

Valvola di iniezione del campione

COMPONENTI DI UN SISTEMA CROMATOGRAFICO

TECNICHE IN CROMATOGRAFIA

LIQUIDAper separazione di

proteine

Tecnica cromatografica Acronimo Principio di separazione

Cromatografia liquida con modalità non interattiva

Esclusione Molecolare (Size-exclusion) o Gel filtrazione

SECGFC

Differenze in peso molecolare

Cromatografia liquida con modalità interattiva

Scambio ionico (Ion-exchange ) IEC Interazioni elettrostatiche

Fase normale (Normal-phase) NPC Interazioni polari

Fase inversa (Reversed-phase) RPC Interazioni dispersive

Interazione idrofobica (Hydrophobic interaction) HIC Interazioni dispersive

Affinità AC Interazioni biospecifiche

Affinità per metalli (Metal affinity) MAC Interazioni specifiche con metalli

immobilizzati in matrice

GEL FILTRAZIONE (GFC)

O ESCLUSIONE

MOLECOLARE (SEC – SIZE EXCLUSIONCHROMATOGRAP

HY)

Immagine in microscopia

elettronica (SEM) di una

bead di diametro 3 um.

La dimensione dei pori

determina le dimensioni

delle molecole che

possono essere separate

(la capacità della

colonna).

• Modalità non interattiva.• Setaccio molecolare: separazione in base alle dimensioni• Resina composta da sferette (beads) polimeriche porose

GFC - SEC

GEL FILTRAZIONE

(GFC) O ESCLUSIONE

MOLECOLARE (SEC)

Modalità non interattiva.Setaccio molecolare: separazione in base alle dimensioniResina composta da sferette (beads)

GEL FILTRAZIONE

(GFC) O ESCLUSIONE

MOLECOLARE (SEC)

VOLUMI DI ELUIZIONE

Vtot (VOLUME TOTALE)

Proteine molto piccole entrano in tutti i pori

delle beads e compiono un percorso molto

lungo, quindi eluiscono a tempi molto lunghi.

Tutte le proteine con dimensioni minori di un

certo valore eluiranno allo stesso tempo, t tot

corrispondente al Vtot.

RANGE DI SEPARAZIONE V el

Proteine con dimensioni intermedie entrano in

alcuni pori del gel.

Il tempo di percorrenza (e quindi il volume di

eluizione Vel) è inversamente proporzionale

alle loro dimensioni.

V0 (VOLUME MORTO)

Proteine molto grandi, con diametro maggiore

delle dimensioni dei pori, compiono un

percorso quasi lineare ed eluiscono a tempi

molto brevi. Tutte le proteine con un diametro

maggiore delle dimensioni dei pori usciranno

allo stesso tempo, t0 corrispondente al V0.

LABORATORIO 1:

SEPARAZIONE DI

CAMPIONI PROTEICI

MEDIANTE GF/SEC E

COSTRUZIONE DI UNA

RETTA DI TARATURA

CROMATOGRAMMA DEL SIERO UMANO

DETERMINAZIONE DEL PESO

MOLECOLARE

Il tempo di ritenzione TR (e il Vel) di una proteina e’ proporzionale al logaritmo del PESO MOLECOLARE (MW) della stessa (se vale l’approssimazione di una molecola GLOBULARE)

TR =a* log(MW) +b


MOLECOLARE:

RETTA DI TARATURA


La RETTA DI TARATURA IN SEC si costruisce utilizzando come

STANDARD

proteine GLOBULARI con peso molecolare noto,

riportando il log MW in funzione del tempo di ritenzione


MOLECOLARE:

PROTOCOLLO


PROTOCOLLO

Il frazionamento SEC è stato condotto

utilizzando una colonna shodex

KW804 alla temperatura di 15°C

con un flusso di 0,2 mL/min a

monitorato alla lunghezza d’onda di

280 nm.

Un volume di 200 ul di siero diluito

contenente 7,4 mg totali di proteine è

stato iniettato nella colonna.

Standard proteici utilizzati: Albumina

di siero bovino (67 kDa), beta-

caseina (28 kDa), citocromo c (12

kDa) e peptidi triptici della beta

caseina (1,3 – 0,8 kDa)

FASE MOBILE: KH2PO4 50 mM, Tris

10 mM, pH 7.0 => Range di separazione della

colonna: da 10 a 1000 kDa

RICOSTRUIAMO LA RETTA DI TARATURA DAL

CROMATOGRAMMA

1) LEGGIAMO ED ANNOTIAMO IL TEMPO DI RITENZIONE DI OGNI

STANDARD SU UN FOGLIO EXCEL


1) Leggiamo il tempo di ritenzione corrispondente al picco di ogni standard

STANDARD Peso molecolare (Kda) Tempo di ritenzione (min)

Albumina di siero bovino

(BSA)

67 75

Beta caseina 28 79

Citocromo C 12 84

Prodotti proteolitici 1,3 101

NB i prodotti proteolitici escono a Ttot (Vtot) perché il loro peso è minore del

minimo nel range di separazione!

Come conosciamo questo parametro???

RICOSTRUIAMO LA RETTA DI TARATURA

DAL CROMATOGRAMMA2) CALCOLIAMO IL

LOGARITMO DEL PESO MOLECOLARE


STANDARD

Peso

molecolare

(Kda)

Tempo di

ritenzione (min)log MW

Albumina di

siero bovino

(BSA)

67 75 1,826074803

Beta caseina 28 79 1,447158031

Citocromo C 12 84 1,079181246

Prodotti

proteolitici1,3 101 0,113943352

RICOSTRUIAMO LA RETTA DI TARATURA

DAL CROMATOGRAMMA

3) COSTRUIAMO UN GRAFICO RIPORTANDO IN ASCISSE IL TR ED IN ORDINATE IL LOG MW

STANDARD

Peso

molecolare

(Kda)

Tempo di

ritenzione (min)log MW

Albumina di

siero bovino

(BSA)

67 75 1,826074803

Beta caseina 28 79 1,447158031

Citocromo C 12 84 1,079181246

Prodotti

proteolitici1,3 101 0,113943352

Curva SBAGLIATA dove

abbiamo inserito il punto

corrispondente ai prodotti

proteolitici

CURVA GIUSTA CON SOLO GLI

STANDARD CON PESI

COMPRESI NEL RANGE DI

SEPARAZIONE

y = -0,0826x + 8,004R² = 0,9948

0

0,5

1

1,5

2

74 76 78 80 82 84 86

log

MW

TR (min)

calibrazione

y = -0,0639x + 6,5292R² = 0,9893

0

0,5

1

1,5

2

74 79 84 89 94 99 104lo

g M

W

TR (min)


CROMATOGRAMMA

4) RIPORTIAMO I DATI IN FUNZIONE DEL

VOLUME DI ELUIZIONE

Volume di eluizione.

Dal protocollo abbiamo che il flusso (F) è di 0,2 mL/min

=> Vel= TR*F

STANDARD

Peso

molecolare

(Kda)

Tempo di ritenzione

(min)log MW V el (ml)

(BSA) 67 75 1,826074803 15

Beta caseina 28 79 1,447158031 15,8

Citocromo C 12 84 1,079181246 16,8

Prodotti

proteolitici1,3 101 0,113943352 20,2

Coefficiente di partizione

Kav= (Vel-V0)/(Vt-V0)

Corrisponde ad una NORMALIZZAZIONE del cromatogramma tra 0 e 1.

Infatti per campioni che escono a V=V0, Kav=0

Per campioni che escono a Vtot, Kav=1

Tutti i campioni che rientrano nel range di separazione avranno

0<Kav<1

Nella nostra retta manca un campione ad alto peso molecolare per

determinare V0…..

Ma c’e’ un picco asimmetrico a volume molto basso che è sicuramente un V0:


CROMATOGRAMMA

5) DETERMINIAMO IL COEFFICIENTE DI

PARTIZIONE


CROMATOGRAMMA

4) DETERMINIAMO IL COEFFICIENTE DI

PARTIZIONE


T0=55 min => V0=55/5= 11 ml

ESERCITAZIONE

LABORATORIO 2:

ESPRESSIONE E

PURIFICAZIONE DI UNA

PROTEINA RICOMBINANTE

HIS-TAG

LE PROTEINE RICOMBINANTI VENGONO GENERALMENTE ESPRESSE COME PROTEINE DI FUSIONE:

IL COSTRUTTO RISULTANTE SARÀ COSTITUITO DALLA SEQUENZA DELLA PROTEINA DA ESPRIMERE

+ UN TAG (ETICHETTA, MARCATORE)

I TAG servono principalmente per facilitare la

purificazione

Ma anche per

Rendere più solubili proteine di membrana

Aggiungere fluorofori per tecniche di imaging

https://youtu.be/DfzB6BtSjBY

His tag protein expression and purification (affinity Ni-chel) ANIMATION

(from Biology Animation Videos)

SCHEMA E PROTOCOLLO

DEF. PLASMIDE:

Molecola di DNA circolare a

doppio filamento, presente

nel citoplasma dei batteri e

capace di replicarsi

indipendentemente dal

cromosoma; i plasmidi

contengono le informazioni

genetiche per alcune

caratteristiche specifiche,

come la resistenza dei

batteri agli antibiotici, e

trovano largo impiego nella

biologia molecolare per

riprodurre indefinitamente

frammenti di DNA e per

inserire in un batterio uno o

più geni estranei

1) cDNA codificante per la proteina da purificare viene inserito in un plasmide

Caratteristiche del plasmide1) Sito di Origine della replicazione

ColE1 is a plasmid found in

bacteria. Its name derives from the

fact that it carries a gene for

colicin E1 (the cea gene). It also

codes for immunity from this

product with the imm gene. In

addition, the plasmid has a series

of mobility (mob) genes. Its size

and the presence of a single EcoRI

recognition site caused it to be

considered as a vector candidate

Caratteristiche del plasmide 2) Gene di resistenza all’ampicillina

Caratteristiche del plasmide3) Sito di clonaggio multiplo con siti di

restrizione

Sito di riconoscimento per

l’enzima PvuII:

CAG^CTG

L’enzima di

restrizione taglia il

DNA del plasmide.

Il cDNA della

proteina da

purificare può

essere inserito nel

sito di taglio

Zoom della regione 5’

upstream del cDNA

inserito.

La nostra proteina ha un

TAG di 6 istidine

LA RNA polimerasi inizia

la trascrizione!

RNA polmerasi

TRADUZIONE: I ribosomi si

legano al sito di legame ed

iniziano la traduzione

dell’RNA in proteina fino ad

arrivare al codone di stop

ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DELL’ENZIMA FAAH

Dott. Chiara Di Pancrazio, PhD THESIS

Quando le cellule

trasformate con il nostro

plasmide vengono indotte

ad esprimere la proteina

taggata, questa sarà molto

abbondante nelle cellule

costituendo fino al 30% del

totale delle proteine

cellulari.

Con molte di queste cellule in coltura

è possibile produrre una gran

quantità della proteina taggata!

A questo punto bisogna

raccogliere le cellule,

romperle ed aprirle e

preparare un estratto

cellulare crudo

ad esempio mediante lisi

meccanica.

ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DELL’ENZIMA FAAH

Dott. Chiara Di Pancrazio, PhD THESIS

1) Estrazione dei batteri dal terreno di coltura e raccolta mediante

centrifugazione (PELLET BATTERICO)

SONICATORE A PUNTA (ROTTURA DELLE PARETI CELLULARI

MEDIANTE ONDE SONORE per cavitazione)

2) LISI MECCANICA

Abbiamo ora un estratto crudo.

DOMANDE:

1) Quale tecnica possiamo utilizzare

per determinare la concentrazione

di proteine totali nel nostro estratto?

2) Quale tecnica possiamo utilizzare

per rilevare la presenza nell’estratto

cellulare della nostra proteina?

SEPARAZIONE PER MAC (IN FPLC PER GRANDI QUANTITÀ!)

Le proteine che non possiedono il TAG non

si attaccano il Nickel e vengono eluite

dalla colonna. Insieme alla fase mobile.

Le proteine ricombinanti His-

taggate rimangono attaccate

alle beads per affinità al

Nickel.

Alla fine della corsa, tutta la

proteina di interesse (almeno il

90%) risulta legata alle beads

all’interno della colonna.

Ora dobbiamo fare un ulteriore

passaggio per far eluire anche

la nostra proteina: una seconda

corsa cromatografica

cambiando le condizioni.

ELUIZIONE:

• Fase mobile a pH basso:

protonazione delle istidine che

perdono affinità per il nickel

=> gradiente di pH

OPPURE

• Fase mobile contenente

IMIDAZOLO che compete con

le istidine per il legame al

metallo

=> gradiente in concentrazione di

imidazolo)

Ad un determinato valore di

pH o una determinata

concentrazione di imidazolo,

uscirà la nostra proteina di

interesse purificata

ALTRI LINK INTERESSANTI

https://youtu.be/y0ffJBFQswk

HIS-TAG PROTEIN PURIFICATION

https://youtu.be/PVvpEKeOzEM

PROTEIN PURIFICATION CREATIVE BIOMART (tutte le cromatografie)

THE END

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