Biopsia Liquida

Cosa si intende per biopsia liquida

Applicazioni della biopsia liquida

Biopsia liquida e NSCLC

Tecniche di analisi del dna tumorale circolante Real-time PCR e Digital PCR

Sara Baglivo Laboratorio di Biologia Molecolare

S.C. ONCOLOGIA MEDICA Azienda Ospedaliera Perugia

Determinazione del profilo molecolare dei tumori

La caratterizzazione molecolare del tumore è utile nella classificazione del tumore, nella diagnosi differenziale, per valutare la prognosi, nell’individuare predisposizioni al cancro e per predire la risposta al trattamento

•In più del 25% dei pazienti il campione tumorale alla diagnosi non è disponibile

“Biopsia liquida” come surrogato della “biopsia solida” ?

Biopsia liquida PRELIEVO DI BIOMARCATORI TUMORALI DA FLUIDI BIOLOGI

SANGUE, URINE, SALIVA...

Acidi nucleici circolanti: Dna/Rna ctDNA (DNA tumorale circolante)

CTCs (cellule tumorali circolanti)

Esosomi

Dna/Rna (mRna/microRna)

Meccanismi di rilascio passivo dei cfNA nel circolo sanguigno

• Molecole di DNA (cfDNA) o di RNA (cfRNA) vengono rilasciate in circolo sia in condizioni fisiologiche sia in condizioni patologiche •cfDNA Mandel e Metais 1940 •La scoperta della cellule tumorali circolanti (CTCs) risale al 1869 •Gli esosomi, contenenti sia proteine che acidi nucleici tra cui varie classi di RNA (ed in particolare microRNA) sono stati isolati per la prima volta da un paziente con tumore nel 1979

Crowley et al. Nat Rev Clin Oncol 2013

CTC vs ctDNA

Pantel & Alix-Panabieres CCR 2013

Le CTCs potrebbero rappresentare un vero e proprio surrogato del tessuto tumorale su cui poter eseguire la determinazione del profilo molecolare del tumore Il loro utilizzo rimane ancora limitato -difficoltà di individuare metodi standardizzati per il loro isolamento e arricchimento data l’elevata eterogeneità delle CTCs stesse -ridotta quantità in circolo, corrispondente < 10 cellule in 1 ml di sangue

Dna tumorale circolante (ctDNA)

•Frammenti di Dna da 180 bp a 200 bp rilascio passivo da processi apoptotici e necrotici

•Il profilo molecolare del tumore può essere studiato analizzando il Dna tumorale circolante ctDNA è rilevabile nella maggior parte dei tumori •Il DNA tumorale circolante può essere distinto dal DNA libero circolante (cfDna) Stesse aberrazioni genetiche ed epigenetiche tumore-specifiche

•Correlazione tra livelli di ctDNA e stadio della malattia Valore medio per tumori in stadio avanzato 17 ng di ctDna/ml di plasma

•I livelli di ctDNA spesso rappresentano solo una piccola percentuale del dna libero circolante Intervallo 0.01% -- 90% Newman Nat Med 2014

Metodo Sensibilità (% di DNA mutato)

Tecniche di screening

Sequenziamento diretto (Sanger)

10-15%

Pirosequenziamento 5-10%

High resolution melting analysis 5%

Tecniche a bersaglio molecolare

ARMS Real-Time PCR 1 -5%

Strip hybridization 1%

PNA/LNA Clamp 0.1%-1%

ME PCR/Sequencing 0.1%-1%

Digital PCR 0.01%

BEAMing 0.01%-0.001%

- Rilevazione del ctDNA nel sangue necessita di tecnologie ad elevata sensibilità

Potenziali applicazioni della biopsia liquida

CtDNA come marker ideale per la genotipizzazione del tumore e il monitoraggio del profilo molecolare della malattia Metodo non invasivo Semplice Rapido e conveniente Rappresentativo del tumore Elevata sensibilità

dato qualitativo e quantitativo che deriva dall’analisi del ctDNA entrambi informativi

Bettegowda Sci Transl Med 2014

Diagnosi, prognosi , rischio di recidiva e progressione di malattia, identificazione dei meccanismi di resistenza e dei target terapeutici, comprensione dei meccanismi di sviluppo delle metastasi

Diaz L A , and Bardelli A JCO 2014;32:579-586

Individuazione delle mutazioni tumore-specifiche nel sangue dei pazienti per monitorare la risposta alla terapia e la ricaduta di malattia

Applicazioni cliniche della biopsia liquida

• CTC come fattore prognostico (FDA)

Mammella

Colon

Prostata

• ctDNA come fattore predittivo di risposta al trattamento di I linea EGFR-TKI

NSCLC

Tecnologia CellSearch® CTC Test purificazione immunomagnetica delle cellule CD45-, EpCAM+, and cytokeratins 8, 18+, and/or 19+

ctDNA e determinazione di EGFR nel tumore al polmone NSCLC

Confronto tra l’analisi delle alterazioni genetiche di EGFR su ctDNA e determinazione su campione solido

26 settembre 2014 approvazione Agenzia Europea per i medicinali (EMA) ctDna nel NSCLC in stadio localmente avanzato o metastatico (IIIB/IV) come substrato per l’analisi

dello stato mutazionale di EGFR per la selezione dei pazienti candidabili al trattamento di prima linea con Gefitinib nei casi in cui non siano disponibili il tessuto o il campione citologico

EGFR Mut+ Campione

istologico/citologico

Trattamento malattia avanzata

con EGFR TKI

Determinazione del profilo molecolare del tumore alla progressione Re-biopsia non mandatoria ma utile per scelte terapeutiche successive

Determinazione dello stato mutazionale di EGFR nell’ NSCLC “mandatoria” alla diagnosi

EGFR T790M+

ctDNA e determinazione di EGFR nel tumore al polmone NSCLC

“Biopsia liquida” come surrogato della “biopsia solida”

Analisi delle mutazioni di EGFR nel plasma

Prelievo di sangue e preparazione del plasma Estrazione del DNA dal plasma con kit QIAamp Circulating Nucleic Acid e QIAvac 24 Plus Determinazione tramite real-time delle mutazioni di EGFR sul Dna circolante estratto

Prelievo e preparazione di plasma 2 campioni di sangue, da 5 ml ciascuno BD VACUTAINER® PPT™ K2Edta 9.0 mg a TA Invertire delicatamente per almeno 15 volte Centrifugazione 15 minuti a 1.100 RCF entro max 30 min dal prelievo Trasferire del plasma in un singolo tubo falcon da 15 ml

Seconda centrifugazione 10 minuti a 1.500 RCF senza freno

Recuperare il plasma e scartare il pellet piccolo sul fondo della provetta. Aliquotare il plasma in volumi di 2000 μl in eppendorf da congelamento

Congelamento a -80 °C

Estrazione del DNA dal plasma con kit specifico QIAamp Circulating Nucleic Acid e QIAvac 24 Plus

La procedura dell’estrazione del DNA circolante viene effettuata utilizzando le colonne QIAamp Mini con silice, un collettore ed una pompa che genera il vuoto 24 campioni in meno di 2 ore 2 ml di plasma per ciascun campione (fino a 5 ml)

Comprende 4 fasi Lisi Legame Lavaggio Eluizione 20 ul- 150 ul

Determinazione delle mutazioni di EGFR su plasma tramite real – time PCR con Therascreen EGFR Plasma RGQ PCR tecnologie ARMS e Scorpions 5 ul per ciascun campione eluito

Mutazioni rilevate: 21 • L858R • 19 delezioni nell’esone 19 • T790M

Real time PCR Therascreen dato qualitativo 1% di sensibilità

Digital PCR

dato qualitativo e quantitativo ed estremamente sensibile

0.01% di sensibilità

•Quantificazione assoluta PCR End-point •Quantità minima di DNA (2ng) •Fino a 24 campioni per seduta analitica •Sensibilità 0.01% •Sonde Taqman

Digital PCR QuantStudio™ 3D Digital PCR System

• Digital PCR funziona per partizionamento di un campione di DNA o cDNA (1-2 molecole) in singoli pozzetti di dimensione nell'ordine dei micrometri (20.000 pozzetti)

• In ogni cella/pozzetto viene fatta avvenire la reazione di PCR con sonde taqman fluorescenti e solo alla

fine della reazione si va a misurare la fluorescenza ottenuta (PCR end-point)

• L'utilizzo di un chip nanofluidico fornisce un meccanismo comodo e semplice per eseguire migliaia di reazioni PCR in parallelo

• Ogni pozzetto è analizzato singolarmente per rilevare la presenza (positivo) o assenza (negativo) di un segnale di fluorescenza endpoint. Quando nessuna sequenza bersaglio è presente, nessun segnale si accumula.

• i risultati vengono sottoposti ad un calcolo di distribuzione statistica (distribuzione di Poisson), la frazione di reazioni negative viene utilizzato per generare il conteggio assoluto del numero di molecole bersaglio nel campione, senza la necessità di controlli endogeni, si risale al numero di molecole di DNA target espresso in copie/uL

Digital PCR

Si valuta la presenza su ctDna delle

-mutazioni attivanti di EGFR Del19 e L858R -mutazioni di resistenza T790M

•Marcatura mutazione fluoroforo FAM Marcatura wild type fluoroforo VIC

Digital PCR

-Campione di ctDna mut per L858R/DEL19/T790M

-Campione di cfDna wt

Digital PCR

NGS Next Generation

Sequencing

Biopsia Liquida

Real Time PCR (inclusa Digital PCR)

Maggiore profondità di analisi e di sensibilità Identificazione mutazioni note e non note

Svantaggi della Digital PCR Permette di identificare solo mutazioni specifiche Costi Kit non standardizzati