IRMI Ruolo  del  CNR  

Milano,  4  Luglio  2013  

A"vità  in  cui  è  impegnato  il  CNR  

•  OR  CNR  -­‐  GENOMNIA  1    U=lizzo  di  tecniche  di  sequenziamento  massivo  degli  acidi  nucleici  (Next  Genera=on  Sequencing,  NGS)  per  il  controllo  qualità  e  sicurezza  nell’uso  terapeu=co  di  cellule  staminali  

•  OR  CNR  2  Implementazione  di  sistemi  HTS  per  l’iden=ficazione  di  nuove  molecole  regolatrici  della  proliferazione  e  del  differenziamento  delle  cellule  staminali.  

•  OR  CNR  -­‐  GENOMNIA  3  Implementazione  di  biomatrici  in  grado  di  controllare  il  differenziamento  di  cellule  staminali  verso  feno=po  muscolare  striato,  modulando  l'ambiente  cellulare  ed  extracellulare,  e  s=molare  l'angiogenesi  

 

OR  CNR  –  GENOMNIA  1  

•  Tecniche  di  sequenziamento  massivo  degli  acidi  nucleici  per  affrontare  in  modo  innova=vo  i  problemi  connessi  al  controllo  di  qualità  e  alla  sicurezza  nell’uso  terapeu=co  delle  cellule  staminali  •  RI  1.1  (mesi  1-­‐24)  Analisi  dei  bio-­‐contaminan=  in  batch  di  cellule  staminali  u=lizzando  tecniche  di  RNA-­‐seq  

•  RI  1.2    (mesi  1-­‐24)  Generazione  di  insiemi  di  marcatori  di  espressione  genica  (signatures)  per  caraVerizzare  i  diversi  =pi  di  cellule  staminali  

•  RI  1.3    (mesi  1-­‐24)  Analisi  della  stabilità  genomica  delle  cellule  durante  la  fase  di  espansione  in  cultura    

•  SS  1.4    (mesi  24-­‐36)  Validazione  dei  risulta=  oVenu=  aVraverso  le  analisi  bioinforma=che  su  nuove  culture  sperimentali  

OR  CNR  2  •  Iden=ficazione  e  caraVerizzazione  di  nuove  molecole  che  regolano  la  proliferazione  e/o  il  differenziamento  delle  cellule  staminali  tramite  la  piaVaforma  robo=ca  Cell-­‐Maker  e  la  microscopia  a  fluorescenza  automa=zzata  

•  Screening  basato  su  feno=po  cellulare  •  RI  2.1  (mesi  1-­‐6)  Costruzioni  di  linee  di  cellule  staminali  ingegnerizzate  per  lo  studio  

della  proliiferazione  e/o  differenziamento  •  RI  2.2  (mesi  7-­‐12)  Screening  in  automazione  di  librerie  di  compos=  

farmacologicamente  a]vi  sulle  linee  precedentemente  definite  •  SS  2.3    (mesi  13-­‐36)  Validazione  dell’a]vità  dei  compos=  iden=fica=  su  cellule  

staminali  umane    

•  Screening  basato  su  fluorescenza  automa=zzata  •  RI  2.4    (mesi  1-­‐6)  Analisi  del  differenziamento  miogenico  di  mesangioblas=  murini  •  RI  2.5  (mesi  7-­‐12)  Iden=ficazione  di  molecole  in  grado  di  modulare  le  capacità  

differenzia=ve  miogeniche    •  RI  2.6  (mesi  13-­‐24)  Analisi  mul=parametrica  dei  profili  di  a]vazione  di  proteine  

regolatrici  nei  processi  differenzia=vi  dei  mesangioblas=  •  SS  2.7  (mesi  24-­‐36)  Validazione  degli  effe]  delle  molecole  sull’a]vazione  dei  vari  

pathway  monitora=  mediante  analisi  mul=parametrica  

OR  CNR  e  GENOMNIA  3  •  Implementazione  di  biomatrici  in  grado  di  controllare  il  differenziamento  di  cellule  staminali  e  cellule  iPS  verso  feno=po  muscolare  striato,  modulando  l'ambiente  cellulare  ed  extracellulare,  e  s=molare  l'angiogenesi  •  Generazione  e  caraVerizzazione  di  iPS  umane  da  fibroblas=  e  precursori  miogenici  pericitari  per  la  formazione  di  muscolo  ar=ficiale,  in  modo  da  confrontare  le  due  diverse  sorgen=  cellulari  per  la  loro  capacità  differenzia=va  in  senso  muscolo-­‐scheletrico  

•  Generazione  di  tessuto  ar=ficiale  muscolare  derivato  da  precursori  miogenici  umani  differenzia=  da  iPS  sfruVando  le  capacità  muscolo  indu]ve  e  di  scaffolding  di  biomateriali.  Sarà  studiato  il  ruolo  della  matrice  extracellulare  (ECM)  nel  promuovere  il  differenziamento  cellulare  e  la  complessa  organizzazione  dell’architeVura  =ssutale  tridimensionale.  L’obie]vo  è  di  generare  materiali  innova=vi  e  biocompa=bili  in  grado  di  mimare  proprio  le  caraVeris=che  della  ECM  e  quindi  influenzare  le  capacità  differenzia=ve  delle  cellule  iPS  .  

•  Sviluppo  di  molecole  e/o  pep=di  sinte=ci  in  grado  di  controllare  la  proliferazione  e/o  differenziamento  e/o  migrazione  delle  cellule  staminali  muscolari,  per  favorire  la  riparazione  del  danno  muscolare  acuto,  e/o  delle  cellule  endoteliali  e  dei  loro  precursori,  per  controllare  l’angiogenesi  associata  al  processo  di  rigenerazione  

Gruppi  PartecipanA  

•  Equipe  Francesca  De  Santa  –  Armando  Felsani,  IBCN    •  Equipe  Cesare  Gargioli,  UniRoma2  •  Equipe  Roberto  Rizzi,  IBCN  •  Equipe  Gabriella  Minchio],  IGB-­‐ABT  

Mouse mesoangioblasts expressing nLacZ

LacZ Myosin heavy chain

LacZ Myosin heavy chain

PEG-Fibrinogen molecules purification

Hydrogel mould

Photoinitiation

365nm (12W)

Hydrogel formation nLacZ-PLGF-Mabs

The PEG-fibrinogen gel

PEGylated-­‐Fibrinogen  (PF)  allows  myofibers  formaAon  

Mabs (nLacZ)

8mg/ml

PF

SYTOX Green Myosin heavy chain

Artificial muscle generation after subcutaneous implant

Impiant Scaffold

Cells

Tibialis Anterior

Artificial Muscle

Tibialis Anterior

Fibroblasts, Pericites and Satellite isolation Reprogramming into iPS cells iPS engineering for PLGF-MMP9 (PiPS-MiPS) Myogenic differentiation In Vivo In Vivo experiments supported by Hydrogel-scaffold

PLGF-­‐iPS  and  MMP9-­‐iPS  supported  by  hydrogel  scaffold  possess  an  enhanced  capacity  to  engraP  and  generate  muscle  in  vivo   In  vitro  

In  vivo  

•  Cripto  Loss  of  Func=on  (  Cripto  LOF)                                Guardiola  et  al.,  PNAS  2012  

•  Cripto  Gain  of  Func=on  (Cripto  GOF)  

Modelli  Murini  condizionali  in  cellule  staminali  muscolari  

(satelli=)  

• Approcci  gene=ci  e  farmacologici  alla  rigenerazione  muscolare  

• Mobilizzazione  delle  cellule  staminali  muscolari  (satelli=)  in  modelli  murini  di  danno  muscolare  acuto  

•  Iden=ficazione  di  nuovi  regolatori  delle  cellule  staminali                          (Automazione  HTS)  

IGB  “A.B.T.”  Gabriella  Minchio]  

• Proteina  Cripto  ricombinante  

• Delivery  sistemico  -­‐Biopolimeri  

Approcci  farmacologici  

 RNA  Seq/cellule  satelli=  

Cripto  LOF  

     

Cell-­‐based  Phenotypic  Screening:  Iden;ficazione  di  nuovi  regolatori  delle  cellule  staminali  

    Cell  Prolifera=on  

Cell  Colony  Phenotype  

Targeted  Differen=a=on      

•  LOPAC  •  HDAC  Inhibitors  

Small  molecules  

Casalino et al., Journal Molecular Cell Biol, 2011 Casalino et al., Molecular Biotechnology, 2011

96-channel head disposable pipetting tips  

The system executes Protocols for targeted differentiation of stem cells Screening of compounds libraries

Advantage/benefits High standard reliability, performance and flexibility Low user intervention Contamination risk reduction

Method standardization Up to 4000 single compounds simultaneously screened

Complete sterility

Robo=c  plajorm:  The  Cell  maker