INFIAMMAZIONE E ATEROSCLEROSI: RUOLO DELLE...

Università degli Studi dell’Insubria

Scuola di Dottorato in Scienze Biologiche e Mediche

Dottorato in Farmacologia Sperimentale e Clinica

Coordinatore: Dott.ssa Franca Marino

INFIAMMAZIONE E ATEROSCLEROSI:

RUOLO DELLE CELLULE IMMUNITARIE

Dott.ssa. Laura Schembri

Tutor: Dott.ssa . Franca Marino

Anno accademico: 2011/2012

II

INDICE

CAPITOLO 1 - INTRODUZIONE .................................................................................................. 1

1. ATEROSCLEROSI ..................................................................................................................... 2

1.1. EVIDENZE FISIOPATOLOGICHE .................................................................................... 2

1.2 INFIAMMAZIONE E ATH .................................................................................................. 3

1.2.2 CARATTERISTICHE DELLA LESIONE ATEROSCLEROTICA ........................................... 3

1.2.2 RUOLO DELLE LIPOPROTEINE A BASSA DENSITA’......................................................... 5

1.2.3 ATTIVAZIONE DELL’ENDOTELIO E RUOLO DELLE CELLULE DEL SISTEMA IMMUNITARIO ................................................................................................................................... 7

1.2.4 IMMUNITA' INNATA E IMMUNITA’ ADATTATIVA NELL’ATH .................................... 10

1.3 REFERENZE BIBLIOGRAFICHE ..................................................................................... 13

CAPITOLO 2 -DISFUNZIONE ENDOTELIALE COME CONSEGUENZA DI UNO STATO INFIAMMATORIO NELL’ATEROSCLEROSI ......................................................................... 15

2.1 INTRODUZIONE .................................................................................................................. 16

2.1.1 PLACCA CALCIFICA E FORMAZIONE DI DEPOSITI DI IDROSSIAPATITE ........ 16

2.1.2 ALTERAZIONE DEL MONOSTRATO ENDOTELIALE ............................................. 17

2.1.3 DISFUNZIONE ENDOTELIALE .................................................................................... 17

2.1.4 STRESS E ENDOTELIO ................................................................................................. 18

2.2 SCOPO .................................................................................................................................... 20

2.3 MATERIALI E METODI ..................................................................................................... 21

2.3.1 Coltura delle HUVEC ....................................................................................................... 21

2.3.2 Valutazione dell’espressione genica mediante Real Time PCR ....................................... 21

2.3.3. Stimolazione delle HUVEC con adrenalina ..................................................................... 21

2.3.4 Valutazione dell’espressione di ICAM-1 mediante analisi al microscopio confocale ..... 22

2.3.5 Analisi citofluorimetrica dell’attivazione delle HUVEC mediante analisi delle molecole di adesione.................................................................................................................................. 22

2.3.6 Valutazione dell’adesione dei PMN alle HUVEC mediante analisi citofluorimetrica ..... 22

2.3.7 Analisi statistica ................................................................................................................ 23

2.4 RISULTATI ............................................................................................................................ 24

2.4.1 Valutazione dell’espressione genica della TH, di VMAT-1 e -2 e della DBH ................. 24

2.4.2 Valutazione dell’espressione genica dei recettori α-adrenergici ...................................... 24

2.4.3 Valutazione dell’espressione genica dei recettori β-adrenergici....................................... 24

2.4.4 Valutazione dell’espressione proteica di ICAM-1 mediante analisi confocale ................ 25

2.4.5 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di ICAM-1 ........ 25

2.4.6 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione proteica di ICAM-1 mediante analisi citofluorimetrica .............................................................................................. 26

2.4.7 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di VCAM-1 ...... 26

2.4.8 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione proteica di VCAM-1 mediante analisi citofluorimetrica .............................................................................................. 26

2.4.9 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione di E-Selectina ............... 26

2.4.10 Valutazione dell’effetto dell’adrenalina sulla co-coltura HUVEC-PMN condotta mediante analisi citofluorimetrica .............................................................................................. 27

2.5 CONCLUSIONE .................................................................................................................... 28

2.6 PROSPETTIVE FUTURE .................................................................................................... 32

2.7 TABELLE E LEGENDE....................................................................................................... 33

2.8 FIGURE E LEGENDE .......................................................................................................... 34

III

2.9 REFERENZE BIBLIOGRAFICHE .................................................................................... 46

ALLEGATO 1 .............................................................................................................................. 47

ALLEGATO 2 .............................................................................................................................. 48

ALLEGATO 3 .............................................................................................................................. 49 CAPITOLO 3 - NEUTROFILI E ATEROSCLEROSI: RUOLO DELLO STRESS ................ 50

3.1 INTRODUZIONE .................................................................................................................. 51

3.1.1 PMN E INFIAMMAZIONE NELL’ATH ........................................................................ 51

3.1.2 PMN E STRESS NELL’ATH........................................................................................... 53

3.2 SCOPO .................................................................................................................................... 55


3.3.1 Isolamento dei PMN circolanti ......................................................................................... 57

3.3.2 Messa in coltura dei PMN per la valutazione del’espressione dei recettori adrenergici, della TH e dei trasportatori delle catecolamine ......................................................................... 57

3.3.3 Messa in coltura dei PMN stimolati con adrenalina ......................................................... 57

3.3.4 Valutazione dell’espressione genica dell’IL-8 e della β2-integrina mediante Real Time PCR ............................................................................................................................................ 57

3.3.5 Valutazione della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) .............................. 58

3.3.6 Arruolamento di dei pazienti con stenosi carotidea .......................................................... 58

3.3.7 Messa a punto di una metodica per la disgregazione meccanica della placca carotidea .. 58

3.3.8 Sorting immunomangetico dei PMN dalla placca carotidea ............................................. 61

3.3.9 Valutazione dell’espressione genica di IL-8 ed elastasi nei pPMN .................................. 61

3.3.10 Analisi immunoistochimica della placca carotidea ......................................................... 61

3.3.11 Analisi statistica .............................................................................................................. 62

3.4 RISULTATI ............................................................................................................................ 63

3.4.1 Valutazione dell’espressione genica della TH e dei trasportatori delle catecolamine ...... 63

3.4.2 Valutazione dell’espressione genica dei recettori α e β adrenergici e dei loro diversi sottotipi....................................................................................................................................... 63

3.4.3 Effetto della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di IL-8 ....................... 64

3.4.4 Effetto della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica della molecola di adesione β2-integrina .................................................................................................................. 64

3.4.5 Effetto della stimolazione con adrenalina sulla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) ................................................................................................................... 64

3.4.6 Valutazione del numero di cellule ottenute dopo disgregazione della placca carotidea ... 64

3.4.7 Valutazione dell’espressione genica dell’IL-8 e dell’elastasi nei pPMN e nei cPMN di pazienti sottoposti a TEA ........................................................................................................... 65

3.4.8 Valutazione della presenza dei PMN nella placca carotidea. ........................................... 65

3.5 CONCLUSIONI ..................................................................................................................... 66

3.6 PROSPETTIVE FUTURE .................................................................................................... 70

3.7 TABELLE E LEGENDE....................................................................................................... 72

3.8 FIGURE E LEGENDE .......................................................................................................... 74

3.9 REFERENZE BIBLIOGRAFICHE .................................................................................... 86

ALLEGATO 4 .............................................................................................................................. 88

IV

CAPITOLO 4 - EFFETTO DELL’ANGIOTENSINA II SULLA RISPOSTA FUNZIONALE

DEI LINFOCITI T REGOLATORI: STUDIO IN VITRO .......................................................... 89

4.1 INTRODUZIONE .................................................................................................................. 90

4.1.1 IL SISTEMA RAS ............................................................................................................ 91

4.2 SCOPO .................................................................................................................................... 93


4.3.1 Separazione delle PBMC da Buffy Coat........................................................................... 94

4.3.2 Sorting immunomagnetico delle sottopopolazioni linfocitarie ......................................... 94

4.3.3 Valutazione della purezza delle Treg e delle Teff ............................................................ 94

4.3.3.1 Analisi dell’espressione genica di FoxP3 in Real-Time PCR per la valutazione della purezza ............................................................................................................................................................. 94

4.3.3.2 Analisi citofluorimetrica per la valutazione della purezza delle Treg ..................................... 95

4.3.4 Valutazione dell’espressione di membrana di AT1R nei linfociti Treg mediante analisi citofluorimetrica multiparametrica ............................................................................................ 97

4.3.5 Valutazione della produzione di citochine IL-4 e INF-γ mediante Kit ELISA ................ 97

4.3.6 Valutazione dell’espressione genica del FoxP3 e delle citochine IL-10 e TGF-β mediante Real Time PCR .......................................................................................................................... 97

4.3.7 Valutazione della proliferazione cellulare ........................................................................ 98

4.3.7.1 Marcatura delle cellule con il CFSE ........................................................................................ 98

4.3.7.2 Analisi citofluorimetrica della proliferazione .......................................................................... 98

4.3.8 Analisi statistica .............................................................................................................. 100

4.3 RISULTATI .......................................................................................................................... 101

4.4.1 Valutazione dell’espressione genica e proteica di AT1R ................................................ 101

4.4.2 L’Angiotensina II non influenza la proliferazione delle CD4+ indotta da PHA ............. 101

4.4.3 L’Angiotensina II non influenza il rapporto Th1/Th2 nelle CD4+ ................................. 101

4.4.4 Valutazione dell’espressione genica di AT1R nelle Teff e nelle Treg ............................ 101

4.4.5 Valutazione dell’espressione di membrana dell’AT1R nelle Teff e nelle Treg .............. 101

4.4.6 Valutazione del trattamento dell’angiotensina II sull’espressione del FoxP3 nelle Treg e nelle Teff .................................................................................................................................. 102

4.4.7 Valutazione del trattamento dell’angiotensina II e di antagonisti dei recettori AT1 e AT2 sulla proliferazione delle Teff .................................................................................................. 102

4.4.8 Valutazione dell’espressione genica del TGF-β nelle Treg e nelle Teff......................... 102

4.4.9 Valutazione dell’espressione genica di IL-10 nelle Treg e nelle Teff ............................ 103

4.4.10 Analisi citofluorimetrica dell’effetto dell’angiotensina sulla attività soppressoria delle Treg .......................................................................................................................................... 103

4.5 CONCLUSIONI ................................................................................................................... 104

4.6 PROSPETTIVE FUTURE .................................................................................................. 106

4.7 TABELLE E LEGENDE..................................................................................................... 107

4.8 FIGURE E LEGENDE ........................................................................................................ 110

4.9 REFERENZE BIBLIOGRAFICHE .................................................................................. 118

CAPITOLO 1

INTRODUZIONE

2

1. ATEROSCLEROSI

L’aterosclerosi (ATH) è una condizione patologica che comprende numerosi e avversi eventi

vascolari, inclusa la patologia arterio-coronarica (coronary artery disease, CAD), l’infarto, la

patologia arteriosa periferica, eventi responsabili della maggior parte della morbidità e mortalità

cardiovascolare nel mondo occidentale (1). Studi epidemiologici indicano che il rischio di ATH è

aumentato in tutto il mondo a causa dell’adozione di un stile di vita occidentale che negli ultimi 15

anni ha portato ad un rapido aumento del rischio di obesità e diabete (2; 3)

1.1. EVIDENZE FISIOPATOLOGICHE

L’ATH è la forma più comune dell’arteriosclerosi, termine che indica genericamente un

complesso di patologie che provocano un ispessimento delle arterie di grosso e medio calibro che

porta alla perdita di elasticità delle pareti arteriose, che compaiono con il progredire dell’età e che

può ridurre o impedire del tutto il flusso ematico.

Clinicamente l’ATH può essere asintomatica o manifestarsi, di solito dai 40-50 anni, con fenomeni

ischemici a livello delle arterie cerebrali, infarto miocardico e con altri effetti come l’insufficienza

renale, ipertensione ed aneurismi. Si manifesta tendenzialmente a livello di osti, biforcazioni o

curvature dei vasi dove le alterazioni del flusso sanguigno (diminuzione dello shear stress ed

aumento della turbolenza) (4), sommate alla presenza di diversi fattori di rischio come

l’iperlipidemia, l’ipertensione, il fumo di sigaretta, il diabete mellito, le infezioni e le anomalie

genetiche, stimolano l’insorgenza della lesione iniziale (5).

I trombi causano le maggiori complicazioni dell’ATH; la graduale formazione di stenosi impedisce

il corretto passaggio del sangue rendendolo fisso, cioè incapace di aumentare quando le condizioni

funzionali lo richiedono, come ad esempio durante uno sforzo fisico. Quindi, la sintomatologia

tende a scomparire in condizioni di riposo e a presentarsi nei periodi di attività fisica più o meno

intensa. La sindrome tipica è l’angina pectoris. La riduzione del flusso dipende, oltre che dalla

stenosi, dalla presenza di meccanismi di compenso insufficienti, come l’instaurarsi di circoli

collaterali che consentono al sangue di raggiungere i territori poco irrorati attraverso vasi adiacenti.

L’ateroma, comunemente detto anche placca aterosclerotica, è la lesione caratteristica dell’ATH. Si

tratta dell’ispessimento dell’intima (lo strato più interno delle arterie, rivestito dall’endotelio in

diretto contatto col sangue) delle arterie dovuto principalmente all’accumulo di materiale lipidico

(colesterolo, fosfolipidi) ed alla proliferazione di tessuto connettivo. La placca evolve nel tempo:

dapprima il contenuto predominante è quello lipidico ed assume un colore giallastro, quindi evolve

verso depositi sempre più grandi e consistenti, mutando il colore in bianco. Nello stadio avanzato si

3

può osservare una degenerazione (necrosi); inoltre il substrato lipidico può richiamare la fibrina,

sostanza a composizione proteica, di natura filamentosa e insolubile e dare origine quindi a trombi.

1.2 INFIAMMAZIONE E ATH

Nel 1970 Ross, nella sua teoria “Response to injury” fu il primo a mettere in dubbio la “teoria

lipidica” secondo cui la placca aterosclerotica era causata da un accumulo di colestererolo

all’interno del vaso. In particolare, Ross fu il primo a sostenere che la placca aterosclerotica nasce

da una lesione a livello dell’endotelio arterioso, seguita dall’adesione e aggregazione delle piastrine

(6). Il successivo rilascio del fattore di crescita piastrinico (platelet-derived growth factor, PDGF)

da parte delle piastrine, promuove la risposta proliferativa delle cellule muscolari liscie (smooth

muscle cells, SCM), la cui eccessiva proliferazione può causare un’eventuale occlusione

dell’arteria. Già nel 1958, Poole e Florey erano stati i primi a sostenere che a seguito della

deposizione di colesterolo, i monociti aderivano all’endotelio e migravano attraverso l’endotelio

dell’aorta di coniglio (7). Parecchi anni dopo, Micheal Gimbrone per primo propose il concetto di

disfunzione endoteliale sottolineando il ruolo principale dell’endotelio sano nel proteggere contro

l’aterosclerosi, a sostegno del fatto che un’alterazione della sua normale funzionalità fosse alla base

della patologia aterosclerotica (8). Nel 1986 Ross rivide la sua teoria “Response to injury”

sostenendo che il danneggiamento dell’endotelio è il primo evento importante che porta all’ATH

(9), e nel 1999 pubblicò una review importante nella quale sosteneva per la prima volta che l’ATH

è una malattia infiammatoria cronica nella quale le cellule del sistema immunitario hanno un ruolo

di rilevante importanza (5). Dopo di lui, numerosi studiosi hanno pubblicato diversi lavori a

sostegno di questa ipotesi, ritenendo che l’adesione dei monociti e dei linfociti all’endotelio attivato

rappresenta la prima fase importante della patologia aterosclerotica.

1.2.2 CARATTERISTICHE DELLA LESIONE ATEROSCLEROTICA

Come descritto nel paragrafo precedente, l’ATH è una patologa infiammatoria caratterizzata

da un’intensa attività immunologica, e rappresenta sempre più una grossa minaccia per la salute

umana nel mondo (1). L’ATH implica la formazione di una lesione nelle’intima, che rappresenta lo

strato più interno del vaso, definita con il nome di stria lipidica, che inizia con l’attivazione

dell’endotelio, l’ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (low-density lipoprotein, LDL), il

richiamo nel sito d’infiammazione di magrofagi che inglobano le oxLDL e successivamente si

trasformano in cellule schiumose. A questo stadio, le strie lipidiche sono semplicemente costituite

da cellule schiumose e lipidi mentre i linficiti T e i lipidi extracellulari sono ancora presenti in

numero ridotto. Non tutte le strie lipidiche sono destinate a trasformarsi in lesioni più avanzate. Una

4

classificazione dell’American Heart Association divide le lesioni aterosclerotiche in sei tipologie, a

partire dalle cellule schiumose isolate (denominate “punto lipidico”), attraverso lo stadio dalla stria

lipidica, dell’ateroma, del fibroateroma, fino ad arrivare alle lesioni complicate (figura 1).

Fig. 1: Classificazione della lesione aterosclerotica secondo la

classificazione dell’American Heart Association

Il continuo ispessimento dell’intima porta quindi alla formazione della lesione matura, definita

placca aterosclerotica o ateroma, caratterizzata da un grosso stato infiammatorio e ricca in lipidi,

cellule morte, cellule immunitarie (molti macrofagi e linfociti T), cellule vascolari endoteliali,

cellule muscolari lisce, matrice extracellulare (10) (figura1).

Fig. 2: Composizione cellulare della placca aterosclerotica. La placca aterosclerotica ha un

core contenente lipidi (che include colesterolo esterificato e cristalli di colesterolo) e detriti di

cellule morte. Inoltre contiene cellule del muscolo liscio e fibre di collagene, che hanno il

compito di stabilizzare la placca stessa, cellule immunitarie, macrofagi, cellule T e mastociti

(11).

5

La placca matura tende ad aver una struttura molto più complessa delle strie lipidiche, protrudendo

spesso nel lume dell’arteria. L’ateroma è costituito da una parte centrale, detto core, che contiene

cellule schiumose, gocciole lipidiche cellule morte e detriti cellulari, circondato da un cappuccio

costituito da cellule muscolari lisce e collagene (10). Altri tipi cellulari presenti a livello di placca e

descritti in letteratura sono rappresentati da cellule dendritiche (12), i mastociti (13), pochi linfociti

B (10), i linfociti T natural killer. La regione che costituisce l’interfaccia tra il core e il cappuccio

fibroso è invece ricca in linfociti T e macrofagi (10).

La maggior parte delle cellule immunitarie presenti al livello di placca sono presenti in uno stato di

attivazione e producono citochine proinfiammatorie come per esempio l’interferone (interferon,

INF)-γ on il fattore di necrosi tumorale (tumor necrosis factor, TNF)-α (14). Con il tempo, la placca

progredisce in una forma più complessa, la secrezione di proteasi da parte della matrice

extracellulare e di citochine da parte delle cellule infiltranti la placca, e l’aggregazione delle

gocciole di colesterolo e la formazione di cristalli porta alla formazione di un cappuccio fibroso che

delimita la placca e previene il contatto tra il circolo sanguigno e il materiale protrombotico della

placca. Infine, il cappuccio fibroso può andare incontro a rottura, causando la liberazione del

materiale protrombotico nel circolo sanguigno. La rottura della placca rappresenta l’evento clinico

più severo e dannoso, in quanto l’esposizione del materiale protrombotico nel circolo sanguigno

può provocare l’improvvisa occlusione delle arterie nel sito di rottura della placca. A livello di

cuore, l’aterosclerosi può portare all’infarto del miocardio e all’arresto cardiaco; mentre a livello di

arterie cerebrali può provare ischemia o ictus. Se l’ATH interessa anche altre branche di arterie, può

portare a disfunzione renale, ipertensione, aneurisma aortico.

1.2.2 RUOLO DELLE LIPOPROTEINE A BASSA DENSITA’

Il ruolo fondamentale nello sviluppo della reazione infiammatoria cronica dell'intima è svolto

dalla ossidazione delle LDL, che a seguito di incremento della permeabilità vascolare restano

intrappolate nella matrice extracellulare dello spazio subendoteliale (15). Qui, subiscono modifiche

chimico-fisiche indotte dalle specie reattive dell’ossigeno (reactive oxygen species, ROS) e

dall’enzima lipossigenasi-15 (16) aventi tutte come evento scatenante l’ossidazione dei lipidi (16).

Inoltre, la comparsa di cariche negative sulle LDL è un requisito essenziale per il riconoscimento

specifico da parte del recettore scavenger espresso dai macrofagi intimali (17). Inizialmente, si ha la

perossidazione della componente lipidica delle LDL, che interferisce debolmente sull'interazione

delle LDL con il recettore ApoB-E (o LDL-R); tali LDL poco ossidate (MM-LDL) sono

fisicamente simili alle LDL, ma con un carico di macromolecole bioattive, che viene introdotto

nella cellula con la endocitosi delle MM-LDL (18). Nelle fasi successive, si generano prodotti dei

6

lipidi perossidati e prodotti aldeidici (malondialdeide, MDA; 4-idrossinonenale), che possono

modificare covalentemente la componente proteica delle LDL; queste oxLDL non vengono più

riconosciute da LDL-R, ma si legano agli "scavenger receptors" (SR: SR-A, CD36 e CD68). Poiché

gli SR non sono soggetti a regolazione a feedback-negativo, le OX-LDL non solo introducono nelle

cellule che le fagocitano macromolecole attive, ma in aggiunta causano l'accumulo intracellulare di

esteri del colesterolo, responsabile della trasformazione in cellule schiumose o foam cells,

caratteristiche del tessuto aterosclerotico (figura 2).

L'interazione con i corrispondenti recettori LDL-R e SR (e la conseguente generazione di

messaggeri intracellulari, in particolare i ROS) e l'introduzione nella cellula di prodotti ossidati

sono la base biochimica dell'azione patogena delle LDL. Le oxLDL attivano nelle cellule

(endotelio, macrofagi, cellule muscolari lisce) fattori di trascrizione (es. NF-κB), che inducono

l'espressione di geni che codificano per le molecole di adesione, citochine e fattori di crescita e che

danno l'avvio alla risposta infiammatoria.

Figura 2. Effetti dell’attivazione e dell’infiltrazione delle LDL sull’infiammazione nelle arterie. In pazienti con ipercolesterolemia, l’LDL in eccesso infiltra le arterie è viene trattenuta nell’intima del vaso. Le modificazioni ossidative ed enzimatiche portano al rilascio di citochine infiammatorie che inducono le cellule endoteliali ad esprimere molecole di adesione . Le modificazioni delle LDL sono causate da recettori, detti “scavenger”, presenti nei macrofagi che successivamente si diventano cellule schiumose.

7

1.2.3 ATTIVAZIONE DELL’ENDOTELIO E RUOLO DELLE CELLULE DEL

SISTEMA IMMUNITARIO

Lo studio delle fasi precoci dell’ATH umana presenta numerosi ed evidenti ostacoli, per

questo che negli anni sono stati ampiamente utilizzati i modelli animali al fine di meglio capire

e chiarire i meccanismi di iniziazione dell’ATH, nonostante le limitazioni dovute alle

differenze tra modello animale ed umano.

La rewiew pubblicata prima da Hansson e Libby nel 2006 (11) e successivamente quella di Weber

(19) hanno permesso di meglio chiarire le diverse fasi del processo infiammatorio durante la

formazione della placca aterosclerotica.

In particolare, è possibile evidenziare diverse fasi che si succedono in sequenza durante la

formazione della lesione:

- l’attivazione dell’endotelio e l’aumento dell’espressione delle molecole di adesione, come

VCAM-1 (vascular cell adhesion molecole-1) e ICAM-1 (intracellular adhesion molecole-

1), sull'endotelio;

- l’adesione all’endotelio e l’infiltrazione dei monociti prima e, successivamente, di altre

cellule del sistema immunitario nell’intima;

- l'accumulo e il richiamo di ulteriori cellule da parte delle chemochine prodotte, tra cui il

fattore chemotattico monocitario (monocyte chemotactic protein- 1, MCP-1);

- la trasformazione dei monociti in cellule schiumose in risposta alla produzione di citochine,

come il fattore di crescita stimolante i macrofagi (macrophage colony-stimulating factor, M-

CSF);

- l’alterazione della stabilità della placca causata dalla produzione di citochine ed enzimi da

parte delle cellule infiltrate, con conseguente modifica della natura del cappuccio fibroso,

che, nel peggiore dei casi, può portare alla rottura della placca e alla trombosi, con

conseguente ictus o infarto del miocardio.

E' stato stabilito nel corso degli ultimi 15 anni, che l'endotelio non è un semplice rivestimento di

cellule sulla parete interna delle arterie. Le cellule endoteliali secernono una grande varietà di

molecole attive (20). L’endotelio sano rappresenta una barriera selettiva importante per il libero

passaggio di molecole e cellule attraverso l'interstizio sottostante; è un organo endocrino e

dinamico, che non solo media la vasodilatazione endotelio-dipendente, ma inibisce attivamente

anche l'adesione dei leucociti e la loro migrazione verso l’intima, oltre che l’adesione e

l’aggregazione piastrinica, la proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari e la loro

migrazione. Inoltre inibisce la coagulazione, la fibrinolisi e promuove e partecipa attivamente nelle

reazioni immunitarie e infiammatorie (21).

8

La disfunzione o l’attivazione endoteliale può essere causata in risposta ad una grande varietà di

stimoli, come le oxLDL, i radicali liberi causati dal fumo, l’ipertensione, il diabete, le alterazioni

genetiche, l’elevata concentrazione di omocisteina plasmatica e i microrganismi infettivi. Tutti

questi stimoli portano ad un’alterazione dell’omeostasi endoteliale e ciò influenza la permeabilità

dell’endotelio, la vasocostrizione, la coagulazione e scatena tutta una serie di reazioni infiammatorie

ed immunologiche. E' stato dimostrato che la disfunzione endoteliale è uno dei primi segni

nell’ATH, anche in assenza di evidenza angiografica di malattia. La riduzione dell’attività

dell'ossido nitrico (NO) rappresenta uno dei marcatori maggiormente presi in considerazione in

passato e anche tra i più importanti nel rilevare la disfunzione endoteliale (22). L’endotelina-1 (ET-

1), un potente vasocostrittore, sembra essere in un equilibrio con la regolazione del tono vascolare

da parte dell’NO. E' stato dimostrato che l’ET-1 può essere coinvolta nell’ATH e che i sui recettori

mostrano un aumento della loro espressione nelle placche aterosclerotiche umane (23).

Se la risposta infiammatoria non riesce a neutralizzare ciò che è estraneo, l'infiammazione va avanti

e stimola la migrazione e proliferazione delle cellule muscolari lisce. La risposta è mediata dai

macrofagi derivati dai monociti e da specifici sottotipi di linfociti T. L’eccessiva risposta

infiammatoria e fibroproliferativa porta ad un ispessimento della parete arteriosa e alla formazione

della lesione aterosclerotica.

L’endotelio sano non lega i globuli bianchi. In seguito alla disfunzione endoteliale, molte cellule

endoteliali (CE) cominciano a esprimere sulla loro superficie le molecole di adesione (selectine,

ICAM, VCAM) che fungono da recettori per le integrine presenti sui monociti e sulle cellule T. In

particolare, VCAM-1 si lega in maniera specifica ai monociti e ai linfociti T. Questa molecola di

adesione, come dimostrato da studi sperimentali, è principalmente espressa dalle CE nelle lesioni

aterosclerotiche (24; 25) e sembra essere correlata con un maggiore accumulo di cellule

mononucleate (26). L'espressione di VCAM-1 nelle cellule endoteliali è aumentata dalla presenza di

mediatori infiammatori o citochine. Questa regolazione dell’espressione di VCAM-1 avviene a

livello trascrizionale ed è mediata, almeno in parte, dal fattore di trascrizione nucleare-kB (nuclear

factor KappaB, NF-kB) (27).

L’attivazione di NF-kB è coinvolta con l’espressione di diversi geni proinfiammatori ed è presente

nelle CE delle lesioni precoci (28). Nelle CE non attivate, la forma predominante di NF-kB è

presente nel citoplasma come un eterodimero costituito da due subunità p50 e p65 complessato con

una proteina inibitrice di kB (IKB). Dopo la stimolazione delle cellule, IkB viene degradato,

rilasciando NF-kB e permettendo così la sua traslocazione al nucleo (29).

Meccanismi ateroprotettivi difettosi, potrebbero anche contribuire all'inizio dell'ATH. A livello

della ramificazione delle arterie, l'assenza di normale shear stress riduce la produzione locale di NO

9

(30), che può bloccare l'espressione di VCAM-1 (31). La turbolenza e l’anormale shear stress può

aumentare la produzione di ICAM-1 (32), e promuovere la produzione da parte delle cellule

muscolari lisce di proteoglicani, che possono legare e trattenere particelle di lipoproteina, che dopo

la loro ossidazione, promuovono una risposta infiammatoria nei siti di formazione della placca (33).

Dopo la loro adesione alla parete arteriosa, i leucociti iniziano la loro migrazione verso l’intima,

grazie anche all’aiuto di diverse molecole chemoattrattanti. MCP-1 sembra essere responsabile della

migrazione dei monociti nell’intima. Una volta dentro l'intima, i monociti si differenziano in

macrofagi in risposta alla presenza di M-CSF e di altri stimoli. Aumenta l’espressione di molti

recettori, tra cui i recettori scavenger e recettori Toll-like (TLR) che amplificano la risposta

infiammatoria (34). I recettori scavenger mediano l'assorbimento di particelle oxLDL da parte dei

macrofagi, che porta a accumulo intracellulare di colesterolo e alla formazione di cellule schiumose

(Figura 3, b). I recettori TLR legano il lipopolisaccaride (LPS), la heat-shock proteina 60 (HSP60),

le oxLDL, e altri substrati che stimolano la produzione di molecole pro-infiammatorie da parte dei

macrofagi (34). Successivamente o contemporaneamente anche i linfociti T vengono richiamati

all’interno dell’intima, dove vengono attivati dopo l’interazione con le cellule presentanti l'antigene

(antigen-presenting cells, APC), come i macrofagi o le cellule dendritiche, che mediante la

produzione di citochine IL-12, IL-18 e altre citochine, promuovendo l’ulteriore attivazione dei

linfociti T e la loro differenziazione in linfociti T helper di tipo 1 (TH1) (Figura 3, c). Una volta

differenziate le cellule TH1 iniziano a produrre citochine infiammatorie, tra cui l'IFNγ e il TNF-α

promuovendo, da una parte l’ulteriore attivazione dell’endotelio con l’incremento dell’espressione

delle molecole d’adesione, l’aumento della premebeabilità dell’endotelio, la propensione alla

formazione di trombi, e dall’altra l’inibizione della proliferazione della muscolatura liscia e la

produzione di collagene (Figura 3, d). Tutti questi processi aumentano l’infiammazione all’interno

della placca aterosclerotica, infiammazione che potrebbe essere attenuata in seguito alla produzione

di altre due citochine anti-infiammatorie l’IL-10 e il fattore di crescita trasformante (transforming

growth factor, TGF)-β, prodotte da diversi tipi di cellule tra cui le cellule T regolatorie (Treg) e i

macrofagi, e per il TGFβ, anche da parte delle cellule vascolari. Queste citochine anti-infiammatorie

hanno l’importante ruolo di contrastare ed inibire la funzionalità dei linfociti TH1 e quindi di

ridurre lo stato infiammatorio all’interno della lesione favorendo la stabilizzazione della placca, con

tutti gli effetti benefici che ne derivano (Figura 3, e). In particolare per il TGF-β è stato dimostrato

nel modello animale che essa promuove la produzione di collagene, favorendo la stabilità di placca

(35; 36).

10

1.2.4 IMMUNITA' INNATA E IMMUNITA’ ADATTATIVA NELL’ATH

L’ATH è caratterizzata dalla conservazione e modificazione dei lipidi nella parete vascolare

seguita dalla infiltrazione delle cellule infiammatorie. Tra le cellule implicate nella formazione e

nella progressione della placca aterosclerotica, si possono distinguere sia cellule dell’immunità

innata che cellule dell’immunità acquisita (37). Tra le prime ricordiamo i macrofagi e le cellule

schiumose che sono tra quelle maggiormente presenti nella placca aterosclerotica ed sono essenziali

Figura 3. Richiamo e attivazione delle cellule immunitarie nella placca aterosclerotica (11).

11

per lo sviluppo della placca aterosclerotica (38;39); oltre che ai neutrofili, i mastociti e le piastrine.

Tutte queste cellule mediante la produzione di citochine, ROS, proteinasi, mediatori lipidici, fattori

di crescita, promuovono la proliferazione delle cellule muscolari lisce, la deposizione della matrice

extracellulare, il rimodellamento del vaso, l’angiogenesi e ulteriore infiammazione (37; Figura 4, I).

Tra le cellule dell’immunità acquisita, ritroviamo da un lato i linfociti TH1 che, mediante la

produzione di citochine quali l’INF-γ e il TNF-α, promuovono lo sviluppo della placca

aterosclerotica, esacerbando l’attivazione endoteliale; e i linfociti TH2 che producono citochine

anti-infiammatorie quali l’IL-4 e l’IL-10 con azione appunto anti-infiammatoria e quindi riduzione

dell’attivazione dell’endotelio e della formazione di cellule schiumose (40;41; Figura 4, II). Infine,

troviamo ancora linfociti Treg con azione positiva sulla stabilizzazione di placca mediante

produzione di citochine anti-infiammatorie e cellule B.

Figura 4. Leucociti e piastrine rilasciano mediatori che controllano l’infiammazione nella placca aterosclerotica e determinano il destino della lesione (37).

12

L’attivazione endoteliale e il continuo richiamo di cellule immunitarie, che si tratti di immunità

innata o acquisita, porta comunque alla progressione della lesione, alla migrazione delle cellule

muscolatura liscia vascolare dallo strato sottostante mediale, e le cellule progenitrici circolanti

contribuiscono alla formazione del cappuccio fibroso e alla stabilizzazione della placca. Come detto

precedentemente, tra le cellule dell’immunità acquisita sono implicati anche i linfociti T e B. In

particolare, nel corso degli ultimi 10 anni, è stato sempre riconosciuto il ruolo di queste cellule, che

anche se non sono necessari per l'aterogenesi, sono in grado di modulare la progressione di questa

malattia, nonostante il loro numero relativamente basso nella placca (42; 43).

Negli ultimi anni, l’attenzione si è focalizzata su una specifica sottopopolazione di linfociti T

CD4+CD25+ o Treg che contribuiscono alla soppressione della risposta immunitaria rivolta sia

contro il self che contro il non-self (44; 45). Una riduzione nel numero delle Treg è stata osservata

in diverse patologie autoimmuni (46); recentemente, uno studio condotto su pazienti con patologie

coronariche, ha suggerito come un’alterazione della loro funzione potrebbe rappresentare un

sintomo di instabilità di placca.

Mentre il ruolo dei monociti, dei macrofagi, dei linfociti T e B, e delle piastrine è ben riconosciuto

nel contesto dell’ATH, solo recentemente studi emergenti hanno fornito una prova convincente che

PMN sono stati trascurati nella patogenesi delle malattie cardiovascolari. Recenti studi (47) hanno

dimostrato che la migrazione e l’adesione dei PMN alle CE sono eventi critici durante

l'infiammazione. Inoltre, PMN, piastrine, monociti e aderiscono alle CE attivate e interagiscono tra

loro attraverso la formazione di aggregati, con conseguente maggiore adesione dei leucociti

all'endotelio (48).

La conta dei PMN è stato dimostrato essere un fattore di rischio indipendente e un indicatore

prognostico di futuri eventi cardiovascolari, indipendentemente dallo stato di malattia (49). Molti

tipi cellulari tra cui PMN, monociti e CE sono in grado di generare ROS in risposta alla attivazione

(50;51). I ROS sono stati implicati nella promozione dell'infiammazione (52) e della proliferazione

delle cellule muscolari lisce portando a maggiore sviluppo delle lesioni aterosclerotiche. I ROS

sono anche responsabili dell'ossidazione delle LDL, contribuendo allo sviluppo di aterosclerosi

(53).

13

1.3 REFERENZE BIBLIOGRAFICHE

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15

CAPITOLO 2

DISFUNZIONE ENDOTELIALE COME CONSEGUENZA DI

UNO STATO INFIAMMATORIO NELL’ATEROSCLEROSI

16

2.1 INTRODUZIONE

Numerose evidenze sia cliniche che sperimentali dimostrano che il processo aterosclerotico è una

conseguenza di molteplici fattori tra cui l’infiammazione gioca un ruolo rilevante (1). Nell’ultimo

decennio diversi studi hanno infatti dimostrato come il processo infiammatorio sia tra le cause

principali di innesco di una lenta e graduale alterazione funzionale delle cellule endoteliali che

come conseguenza induce una alterazione della permeabilità della parete vasale con conseguente

ingresso nel lume vasale di cellule infiammatorie. Il primo evento dimostrabile nell’insorgenza di

questo fenomeno è dato dall’attivazione del tessuto endoteliale che si può misurare ad es mediante

la misurazione dell’incremento di espressione di molecole di adesione quali intracellular adhesion

molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) e diverse altre che sono

tipicamente implicate nel processo di adesione e rotolamento delle cellule immunitarie con

conseguente migrazione di esse nel torrente circolatorio e amplificazione della risposta

infiammatoria (2). Come evidenziato in figura, all’attivazione endoteliale segue l’adesione da parte

delle cellule immunitarie con conseguente diapedesi e quindi ingresso nei tessuti infiammati.

2.1.1 PLACCA CALCIFICA E FORMAZIONE DI DEPOSITI DI IDROSSIAPATITE

Una disfunzione cronica con depositi di colesterolo e altri elementi nell’intima dei vasi porta

alla tipica formazione della placca aterosclerotica che può avere consistenza molto diversa: da un

tessuto molle (placca lipidica) ad un tessuto molto duro e calcificato (placca calcifica).

Recentemente abbiamo analizzato tramite microscopia elettronica a scansione una placca carotidea

e ne abbiamo analizzato la composizione (3). Da questo studio abbiamo visto che la placca calcifica

17

è composta principalmente da un deposito di idrossiapatite. Abbiamo quindi analizzato altre placche

nella loro struttura e il risultato di questo lavoro è presentato nell’allegato 1 (4).

2.1.2 ALTERAZIONE DEL MONOSTRATO ENDOTELIALE

L’alterazione della funzione dell’endotelio porta anche ad un ri-arrangiamento strutturale del

tessuto. L’endotelio di un vaso malato infatti mostra una struttura molto diversa dal tipico

monostrato “sano”. Nel lavoro che abbiamo pubblicato di recente (allegato 2, 5) si può osservare

bene la struttura del lume vasale e la sua differenza rispetto ad un vaso “sano”.

2.1.3 DISFUNZIONE ENDOTELIALE

Come già descritto nel capitolo 1, l’ATH è definita come una malattia cronica multifattoriale

in cui diversi fattori di rischio concorrono alla genesi e alla progressione. I primi cambiamenti

funzionali dimostrabili nella fase iniziale della malattia riguardano le cellule endoteliali (EC) che

subiscono delle modificazioni funzionali rilevanti (6). Come prima conseguenza vi è il reclutamento

di leucociti dal sangue circolante (7).

In condizioni sane il monostrato endoteliale, pur essendo in costante contatto con le cellule del

sangue, non è in grado di instaurare con esse nessun legame; quando invece le EC subiscono

un’attivazione infiammatoria, sono indotte ad esprimere in superficie diverse molecole di adesione

transmembrana (8), responsabili di rotolamento, adesione, migrazione e accumulo di leucociti e in

particolare monociti e linfociti T (7).

In particolare, una prima conseguenza di queste alterazioni funzionali sono l’aumentata espressione

di molecole di superficie quali molecole di adesione che richiamano cellule infiammatorie e ne

promuovono l’adesione al monostrato e la successiva infiltrazione come già sopra descritto.

Le prime ad agire nel rotolamento, con interazioni deboli, sono le selectine (7). I leucociti

esprimono costitutivamente L-selectina mentre le EC presentano in superficie E-selectina e P-

selectina solo dopo attivazione (9) consentendo in tal modo di mantenere una specificità di legame

endotelio-leucocita solo nella sede del processo infiammatorio.

Una volta legati all’endotelio attivato, i leucociti penetrano, come sopra descritto, per diapedesi tra

le EC integre grazie alle molecole CD31 o PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule

1) ed entrano nella tunica intima (10).

Prima di migrare nell’intima, i leucociti devono aderire all’endotelio: questo è reso possibile grazie

ad un altro gruppo di molecole di adesione che svolgono un ruolo importante nella genesi dalla

placca: ICAM-1 e VCAM-1; quest’ultima in particolare è emerso essere la prima molecola

18

implicata nell’adesione endoteliale di leucociti mononucleati nei siti di formazione della stria

lipidica (8). VCAM-1 e ICAM-1, membri della superfamiglia delle immunoglobuline, sono

recettori glicoproteici transmembrana, costituiti da una corta coda citoplasmatica (11) e contenenti

rispettivamente sette e cinque domini Ig extracellulari, ciascuno di 70-100 amminoacidi disposti in

due foglietti beta legati da un ponte disolfuro, formanti il caratteristico ripiegamento

immunoglobulinico che costituisce il sito di adesione (9).

La molecola responsabile della prima adesione dei leucociti mononucleati nei siti predisposti alla

lesione aterosclerotica (9) è VCAM-1 (8). Essa, infatti, viene espressa prima che il reclutamento

leucocitario nell’intima abbia inizio. Da studi condotti su topi geneticamente modificati e studi

successivi sulle EC delle arterie coronarie umane, l’endotelio vascolare esprime costitutivamente

ICAM-1, che è in grado di rispondere allo shear stress (12) ma non VCAM-1; nei siti di lesione

viene poi stimolata o indotta la loro trascrizione attraverso una cascata di eventi intracellulari (1).

Questa differenza di espressione suggerisce ruoli diversi di ICAM-1 e VCAM-1 nello sviluppo

dell’ateroma ed un loro ruolo nella progressione del processo. E’ proprio di queste molecole che ci

siamo occupati nello studio presentato nell’allegato 3 (13).

2.1.4 STRESS E ENDOTELIO

Tra i fattori che contribuiscono alla generazione e alla progressione della malattia, il ruolo

dello stress non è stato ancora chiarito, in particolare quando per stress si considerano i fattori

ambientali che agiscono sulle fasi iniziali della malattia. Lo stress porta all’attivazione dell’asse

ipotalamo-ipofisi-surrene e del sistema nervoso simpatico, causando il rilascio di diversi

neurotrasmettitori e ormoni come i glucocorticoidi, il neuropeptide Y e le catecolamine (CAs) che

possono alterare la fisiologia del sistema cardiovascolare e conseguentemente accelerare la cronicità

dell’ATH. In questo contesto, le conoscenze riguardanti le relazioni reciproche tra il sistema

nervoso e quello immunitario – il sistema neuroimmunitario – fornirebbero delle nuove opportunità

di chiarire i meccanismi cellulari e molecolari implicati nel danno vascolare e nella progressione

dell’ATH.

La principale via di comunicazione tra il sistema nervoso e quello immunitario avviene attraverso le

fibre simpatoadrenergiche che rappresentano il punto di legame per l’omeostasi e la regolazione del

sistema cardiovascolare. Le terminazioni nervose arrivano alle cellule immunitarie nei tessuti

linfoidi oltre che alle pareti dei vasi e rilasciano trasmettitori catecolaminergici come noradrenalina

(NA) e – in minore quantità – dopamina (DA) e adrenalina (A) insieme a peptidi neuromodulatori

come NPY. La farmacologia molecolare delle CA, e offre vasto assortimento di bersagli adatti per

la modulazione della risposta funzionale: NA e A legano diversi recettori accoppiati a proteine-G

19

distinti in α-1 e -2 adrenergici (AR), e β-1 e -2 e -3 (βAR), funzionalmente legati a secondi

messaggeri come l’AMPc, il Ca++ e il sistema di proteine-chinasi (14). La conoscenza

dell’importante ruolo dell’infiammazione nello sviluppo dell’ATH solleva alcune domande critiche

circa la ben nota, ma poco conosciuta associazione tra lo stress della vita di tutti i giorni e la

malattia cardiovascolare, portando a morte improvvisa e infarto del miocardio fino a manifestazioni

patologiche gravi con infiammazione vascolare e aumento della pressione sanguigna.

Infatti, gli eventi infiammatori causati dallo stress possono costituire circa il 40% nei pazienti di

ATH con nessun altro fattore di rischio (15; 16). Numerose evidenze suggeriscono che uno stress

prolungato e un aumentato rilascio di trasmettitori adrenergici potrebbe portare ad infiammazione

vascolare, e allo sviluppo dell’ATH (17). Tra le cellule implicate nell’ATH, i diversi sottotipi di

recettori per le CA sono stati identificati sia sulle cellule immunitarie che su quelle endoteliali.

L’attivazione del sistema simpatico porta ad un aumentato rilascio di IL-6 da parte delle EC.

Rilevanze cliniche di questo fenomeno sono indicate dalla capacità di antagonisti dei βAR di ridurre

i livelli di IL-6 e proteina C reattiva in pazienti con una malattia vascolare, suggerendo l’attivazione

di βAR (18).

Un’ulteriore evidenza di un network tra sistema nervoso e sistema immunitario deriva da recenti

osservazioni (ottenute da diversi gruppi compreso il nostro) circa la presenza nei linfociti di un

sistema dopaminergico/adrenergico endogeno e di meccanismi molecolari completi per la loro

sintesi, immagazzinamento e rilascio (19; 20). Il sistema è regolato positivamente durante

l’attivazione delle cellule, contribuisce alle funzioni chiavi dei linfociti e sembra essere alterato in

malattie immunoinfiammatorie come l’artrite reumatoide (21) e la sclerosi multipla (22).

20

2.2 SCOPO

Lo scopo del presente progetto, che proseguirà nel mio post-doc, è di chiarire se l’ATH è la

conseguenza della disfunzione cronica del sistema neuroimmune e se lo stress rappresenta un punto

chiave di questa malattia. Il nostro principale obiettivo è quello di individuare il meccanismo chiave

che collega il sistema nervoso, il sistema immunitario e quello vascolare, nello specifico il sistema

dei trasmettitori catecolaminergici (adrenergico) con le terminazioni nervose, le cellule immunitarie

ed endoteliali attivate durante l’infiammazione o lo stress. A questo scopo, questo studio è diviso in

due parti di cui il mio ultimo anno di dottorato si è focalizzato sulla prima parte:

PARTE 1

a) valutazione dell’espressione dei recettori adrenergici in cellule endoteliali di ottenute

da vena di cordone ombelicale (HUVEC; un valido modello in vitro di cellule endoteliali)

in condizioni normali e dopo attivazione;

b) valutazione in vitro della risposta funzionale in cellule HUVEC dopo stimolazione

con agenti stressogeni, misurandole modificazione dei marcatori di attivazione in queste

cellule.

PARTE 2

a) effetto della stimolazione delle HUVEC con siero o cellule di soggetti

ipercolesterolemi o normocolesterolemici per valutare eventuali modificazioni funzionali

delle cellule endoteliali;

b) separazione di cellule endoteliali circolanti e da placca al fine di confrontare i dati

rispetto a quanto osservato utilizzando il modello in vitro delle HUVEC;

21

2.3 MATERIALI E METODI

2.3.1 Coltura delle HUVEC

Le HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) sono acquistate dalla Millipore

Corporation e coltivate in un terreno di coltura apposito (EndoGRO Basal Medium, Celbio, Italia)

addizionato del 2% di siero bovino fetale (FBS), 10 mM di L-Glutamina and 0.75 U/ml di eparina a

37°C, 5% CO2. Il terreno è inoltre supplementato con 5 ng/ml rh VEGF, rh EGF, rh FGF, con 15

ng/ml rh IGF-1 e con 50 µg/ml acido ascorbico.

2.3.2 Valutazione dell’espressione genica mediante Real Time PCR

L’mRNA totale è estratto da 1x106 cellule utilizzando il kit Perfect Eukariotic Mini Kit

(Eppendorf, Germania) e la quantità di mRNA ottenuta è quantificata mediante utilizzo dello

spettrometro utilizzando una lunghezza d’onda di 260 nm. L’mRNA è successivamente retro

trascritto utilizzando il kit Hig-capacity DNA Archive Kit (Applied Biosystem, California, USA)

secondo la procedura descritta sul libretto delle istruzioni. L’analisi di Real Time è, infine, condotta

utilizzando lo strumento ABI prism 7000 (Applied Biosystem, California, USA), dove hanno inizio

una serie di cicli riportata in breve: un primo ciclo di 2 min a 50°C, un secondo di 10 min a 95°C e

40 cicli di 15 sec a 95°C.

I risultati sono analizzati utilizzando il programma ABI prism SDS (Applied Biosystem). Il

programma ha fornito i valori del ciclo di amplificazione soglia (cycle threshold, CT) al quale

l’intensità di fluorescenza ha cominciato ad aumentare. I risultati sono poi normalizzati in relazione

ai valori di CT dell’ housekeeping gene (in questo caso l’RNA ribosomale della subunità 18s)

utilizzando la formula 2 – (CT campione - CT housekeeping gene) (2 – ∆CT).

2.3.3. Stimolazione delle HUVEC con adrenalina

Le HUVEC sono coltivate in una piastra da 12 pozzetti e lasciate riposare per 24 h al fine di

raggiungere la piena confluenza. Successivamente, le cellule sono stimolate con adrenalina (curva

concentrazione risposta, 0,01 pg/ml – 1 µg/ml) e lasciate in incubazione per tutta la notte.

Terminato il tempo di incubazione, le cellule sono lavate con PBS e recuperate per le analisi

successive.

22

2.3.4 Valutazione dell’espressione di ICAM-1 mediante analisi al microscopio confocale

Allo scopo di verificare l’espressione delle molecole di adesione ICAM-1 da parte delle

HUVEC e la modulazione della stessa attraverso l’incubazione con stimoli noti, quali LPS, TNF-α e

con la sostanza di nostro interesse quale stimolo stressogeno, l’adrenalina, sono allestiti test di

immunofluorescenza. Il test è basato sulla marcatura indiretta (anticorpo primario anti-CD54 più

anticorpo secondario anti-IgG1 coniugato con FITC – fluoresceina isotiocianato) di cellule HUVEC

coltivate a confluenza su vetrino porta oggetti precedentemente predisposto in piastre da 24

pozzetti.

2.3.5 Analisi citofluorimetrica dell’attivazione delle HUVEC mediante analisi delle

molecole di adesione

L’espressione delle molecole di adesione ICAM- 1 (CD54) e VCAM-1 (CD106) è condotta

mediante analisi citofluorimetrica. Dopo aver attivato le cellule con due diversi stimoli l’LPS (1

µg/mL, ON) o il TNF-α (10 µg/mL, 24 h), oppure trattate con adrenalina, le HUVEC sono lavate

con PBS e recuperate per l’analisi. Sono utilizzate circa 2x105 cellule per condizione, risospese in

10 µl di BBS/BSA 0.5% e marcate con 20 µl di anticorpo anti-CD54 coniugato con phycoerythrin

(PE), oppure con anticorpo anti-CD106sempre coniugato con phycoerythrin (PE). Dopo 45 min di

incubazione a 4°C al buio, le cellule sono lavate con 1 ml di PBS/BSA 0.5 % e analizzate al

citometro FACSCanto II (BDB, Milano) e i dati sono analizzati utilzzando il programma

FACSDiva (versione 6.1.3) (BDB, Milano). Le HUVEC sono identificate sulla base dei parametri

morfologici forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC). Sono stati acquisiti 15.000 eventi per

ciascun campione analizzato e i risultati sono espressi come percentuale (%) di cellule positive per

ciascun marcatore utilizzato.

2.3.6 Valutazione dell’adesione dei PMN alle HUVEC mediante analisi citofluorimetrica

L’adesione della PMN alle HUVEC è determinata dalla pre-marcatura dei PMN con

ficoeritrina legata covalentemente alla cianina 5 (PECy5) di topo coniugato ad anticorpo anti-CD16

umano, marcatore altamente espresso su queste cellule. La marcatura è effettuata tramite

l'incubazione dei PMN in terreno di coltura (RPMI 1640) addizionato con 5 µl di anticorpo anti-

CD16-PECy5/1x106 cellule in un volume finale di 100 µl per 30 minuti a 4 ° C al buio. Trascorso il

tempo di incubazione le cellule sono lavate con 1 ml di terreno per rimuovere l'anticorpo non

legato. Successivamente i PMN sono risospesi alla concentrazione di 0.5 ml /1x106 cellule nel

terreno delle HUVEC e aggiunti a ciascun pozzetto precedentemente piastrato. Una volta aggiunti

23

alle HUVEC, i PMN sono attivati fMLP (0,1 µM) per indurre la loro adesione alle cellule

endoteliali e incubate per 30 min a 37 ° C. Trascorso il periodo di incubazione, i PMN non adesi al

monostrato sono rimossi mediante 2 lavaggi e le cellule rimanenti sono recuperate mediante

l’utilizzo di un trattamento non enzimatico trattamento (cellule soluzione dissociazione (1X) non-

enzimatica, SIGMA) e centrifugati a 500 g per 5 min. L’analisi dell’adesione dei PMN alle HUVEC

è eseguita al citometro al citometro FACSCanto II (BDB, Milano) e i dati sono stati analizzati

utilzzando il programma FACSDiva (versione 6.1.3) (BDB, Milano). Le HUVEC e i PMN sono

individuati in base alla loro side scatter (SSC) e alla marcatura dei PMN con anticorpo anti-CD16-

PECy5. Sono acquisiti almeno 25,000 eventi da ciascun campione. L'adesione dei PMN in co-

coltura è espressa come percentuale (%) dei PMN CD16+.

2.3.7 Analisi statistica

I risultati sono stati espressi come media ± SD (Standard Deviation o Deviazione Standard) di

ogni gruppo sperimentale. La significatività statistica delle differenze tra gruppi è stata valutata

mediante test del t di Student a due code per dati appaiati, mentre i grafici sono stati costruiti

utilizzando un software disponibile in commercio (GraphPad Prism versione 5.02 per Windows,

GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Per la valutazione statistica delle

curve concentrazione-risposta è stata utilizzata l’analisi della varianza ad una via (one-way

ANOVA).

24

2.4 RISULTATI

2.4.1 Valutazione dell’espressione genica della TH, di VMAT-1 e -2 e della DBH

Le HUVEC sono messe in coltura in condizioni di riposo o attivate con due diversi stimoli

proinfiammatori, l’LPS (1 µg/mL, overnight) o il TNF-α (10 ng/mL a 24 h).

La tirosina idrossilasi (TH), enzima limitante la sintesi delle catecolamine, e i trasportatori

delle catecolamine,VMAT-1 e -2, presentano dei livelli di espressione genica al di sotto della soglia

di rilevazione dello strumento. Infine, l’analisi dell’espressione genica della dopamina-beta

idrossilasi (DBH) mostra la presenza dell’enzima nelle cellule in condizioni basali (figura 1,

pannello A) che viene significativamente aumentata (di 2 volte) sia dopo attivazione con LPS che

con TNF-α (figura 1, pannello B).

2.4.2 Valutazione dell’espressione genica dei recettori α-adrenergici

I recettori α1A, α2A sono espressi nelle HUVEC in condizioni basali (figure 2 e 3, pannelli A)

seppur i loro livelli di mRNA siano molto bassi; gli altri sottotipi recettoriali, α1B, α1D sono poco

espressi e non modulati dagli stimoli (tabella 1); mentre per quanto riguarda i recettori α2B e α2C la

loro espressione genica è al di sotto della soglia di rilevabilità dello strumento ed non sono quindi

identificabile né in condizioni di riposo nè dopo attivazione delle cellule.

La stimolazione delle cellule con LPS induce un incremento significativo del recettore α1A (figura 2,

pannello B), seppur si tratta di un aumento di 1 sola volta dell’espressione genica; mentre per

quanto riguarda la stimolazione con TNF-α essa induce un incremento statisticamente significativo

dell’mRNA del recettore, pari ad un aumento di ben 3 volte rispetto alle cellule a riposo (figura 2,

pannello B).

L’espressione dell’mRNA per il recettore α2A, è invece aumentata dopo stimolazione sia con

LPS che con TNF-α; in particolare si osserva un aumento di ben 5 volte con LPS e di 4 con TNF-α

(figura 3, pannello B).

2.4.3 Valutazione dell’espressione genica dei recettori β-adrenergici

I recettori β2 e β3 sono espressi nelle HUVEC in condizioni basali (figure 4 e 5, pannelli A), e

come per i recettori di tipo α presentano dei livelli di espressione genica bassa; mentre il recettore β1

ha un espressione al di sotto del limite di rilevazione dello strumento.

25

La stimolazione delle HUVEC mostra un aumento dell’espressione genica del recettore β2-

adrenergico statisticamente significativo di circa 4 volte dopo stimolazione con LPS e di ben 12

volte con TNF-α (figura 4, pannelli A e B). Anche per quanto riguarda il recettore β3, si osserva un

aumento significativo dei livelli di mRNA dopo attivazione delle HUVEC, in particolare

quest’aumento è di circa 6 volte dopo stimolazione con LPS e di circa 5 volte con TNF- α (figura 5,

pannello B).

2.4.4 Valutazione dell’espressione proteica di ICAM-1 mediante analisi confocale

L’analisi mediante microscopia confocale dell’espressione proteica di ICAM-1 mostra

un’espressione di membrana in basale nelle HUVEC di ICAM-1 del 18%, confermato anche dalle

immagini in figura 6 (quadrante A) come indicato dalla freccia bianca. Come atteso, la positività

per ICAM-1 aumenta del 73% dopo attivazione delle HUVEC con LPS (1 µg/ml, overnight), come

mostrato nelle immagini in cui si può osservare una maggiore positività di membrana dovuta alla

marcatura in verde dell’anticorpo secondario coniugato a ICAM-1 (figura 6, quadrante B). Anche

dopo attivazione con TNF-α (10 ng/ml, 24 h) si osserva un aumento del 91% di cellule positive a

ICAM-1(figura 6, quadrante C).

Il trattamento delle HUVEC con adrenalina (A; 1 µM, overnight) induce una modificazione

della morfologia delle cellule (figura 6, quadrante D) con una distribuzione puntiforme della

marcatura verde lungo la membrana delle cellule e che mostra una positività per ICAM-1 di circa il

33%.

2.4.5 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di ICAM-1

Per la valutazione della stimolazione con A sull’espressione genica delle molecole di adesione

abbiamo utilizzato come controlli positivi, al fine di verificare lo stato di attivazione delle cellule,

LPS (1 µg/ml, overnight) e il TNF-α (10 ng/ml, 24 h). Come atteso, il trattamento delle HUVEC

con LPS induce un aumento significativo di circa 40 volte (vs CTRL: 49.45±45.97) e di circa 50

volte con TNF-α (vs CTRL: 56.86±21.88).

La stimolazione delle HUVEC con concentrazioni crescenti di A (0,1 pg – 1 µM), overnight)

mostra un aumento dell’espressione genica di ICAM-1 a partire dalla concentrazione di 0,01 µM,

per poi divenire significativa alle concentrazioni di 0,1-1 µM dove si osserva un aumento di 2 volte

dei livelli di mRNA (figura 7, pannelli A e B).

26

2.4.6 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione proteica di ICAM-1

mediante analisi citofluorimetrica

Come per l’analisi precedente, abbiamo verificato l’attivazione delle HUVEC mediante

trattamento con LPS (1 µg/ml, overnight) e il TNF-α (10 ng/ml, 24 h). Come atteso, il trattamento

delle HUVEC con LPS o TNF-α induce un aumento dell’espressione di membrana ICAM,

rispettivamente,di circa il 95% - 98% (LPS: 95.9±0.4; TNF- α: 99.0±0.9). Tuttavia, la stimolazione

con A (0.001 – 1 µM) non ha alcun effetto sull’espressione di membrana di ICAM-1 (figura 8).

2.4.7 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di VCAM-1

Come per ICAM-1, anche per VCAM-1 abbiamo verificato l’attivazione delle cellule con (1

µg/ml, overnight), mentre al momento non sono presenti dati circa l’effetto del TNF-α. In

particolare, la stimolazione con LPS mostra un aumento significativo di circa 9 volte dei livelli

mRNA della molecola di adesione dopo stimolazione con LPS (vs CTRL: 9.69±4.42).

Il trattamento delle HUVEC con una curva concentrazione di A (0.1 pg – 1 µM, overnight)

mostra un aumento dell’espressione genica di VCAM-1 di 1 volta a partire dalla concentrazione di

0.001 µM, che si conferma alla concentrazione di 1 µM (figura 9), seppur non è al momento ancora

possibile condurre un’analisi statistica, probabilmente dovuta per la scarsa numerosità.

2.4.8 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione proteica di VCAM-

1 mediante analisi citofluorimetrica

Come atteso, il trattamento delle HUVEC con LPS o TNF-α induce un aumento

dell’espressione di membrana ICAM, rispettivamente, di circa il 95% - 98% (LPS: 29.9±15.9; TNF-

α: 27.2±11.9). Tuttavia, la stimolazione con A (0.001 – 1 µM) non ha alcun effetto sull’espressione

di membrana di ICAM-1 (figura 10).

2.4.9 Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione di E-Selectina

La stimolazione con LPS induce un aumento statisticamente significativo, di circa 6 volte dei

livelli di mRNA di E-Selectina (vs CTRL: 7.67±2.17).

Il trattamento delle HUVEC con A (curva concentrazione-risposta: 0,1 pg – 1 µM, overnight)

induce un aumento statisticamente significativo di 2 volte dei livelli di mRNA della molecola di

adesione E-Selectina già a partire dalla concentrazione di 0.001 µM per poi continuare ad

aumentare in modo concentrazione dipendente ed arrivare fino ad un aumento di 6 volte con la

concentrazioen di 1 µM (figura 11, pannelli A e B).

27

2.4.10 Valutazione dell’effetto dell’adrenalina sulla co-coltura HUVEC-PMN condotta

mediante analisi citofluorimetrica

I dati mostrano in condizioni basali circa il 15 % (%: 15.63±13.44; figura 12, colonna bianca)

di adesione dei PMN alle HUVEC, espressa come percentuale (%) di cellule CD16+. Dopo 1 h di

pre-trattamento delle HUVEC con A 1 µM, si osserva un aumento significativo della % di cellule

CD16+ che sale fino al 40 % (%: 39.95±12.05; colonna grigio chiaro). La stimolazione dei PMN

con fMLP (0.1 µM; 30 min), utilizzato come controllo positivo in quanto rappresenta un tipico

stimolo di attivazione dei PMN induce un aumento staticamente significativo della % di cellule

CD16+ rispetto al controllo (29.48±17.7, colonna nera), seppur di minore intensità rispetto

all’effetto della stimolazione delle HUVEC con A; inoltre l’ulteriore trattamento delle HUVEC con

A induce un aumento statisticamente significativo della % di cellule CD16+ portando i valori a

quelli della sola stimolazione delle HUVEC con adrenalina (40.33±15.07).

28

2.5 CONCLUSIONE

Negli ultimi decenni, diversi studi hanno dimostrato come il processo infiammatorio sia tra le cause

principali di innesco di una graduale alterazione funzionale delle cellule endoteliali che di

conseguenza induce un’alterazione della permeabilità dell’endotelio vasale con ingresso nel lume

del vaso di cellule infiammatorie. Il primo evento di questo processo è rappresentato

dall’attivazione del tessuto endoteliale, fenomeno che può essere evidenziato mediante la

misurazione dei livelli di espressione di due molecole di adesione rappresentate da ICAM-1 e

VCAM-1 (2). Una disfunzione endoteliale cronica può portare all’accumulo di colesterolo e cellule

infiammatorie nell’intima del vaso, con la conseguente formazione della placca aterosclerotica che

può essere costituita sia da tessuto molle (placca lipidica) che da tessuto calcifico (placca fibrosa o

calcifica). La consistenza della placca è molto importante per l’evolversi della patologia, infatti

placche più calcifiche sono quelle meno pericolose in quanto rischiano meno di andare in contro a

rottura e causare tutti quei problemi tipici della rottura di una placca soft. Abbiamo dimostrato in

uno studio condotto mediante analisi condotta al microscopio elettronico a scansione come la

componente di questo tipo di placche sia idrossiapatite (3; 4) che quindi porta alla formazione di

una placca solida e probabilmente meno prona a rotture e quindi rischi di accidenti cardiovascolari.

Ma le placche possono avere consistenza differente a secondo del processo che porta alla loro

formazione. Gli studi sono quindi volti a cercare di comprendere il meccanismo alla base

dell’innesco di questo processo. La causa principale e che sta alla base della formazione della

lesione è l’alterazione dell’endotelio, alterazione che abbiamo ampiamente dimostrato in uno studio

condotto su diverse placche carotidee in cui è possibile osservare le differenze tra un endotelio sano

e un endotelio alterato,dove si può osservare lo sfaldamento dell’endotelio e l’alterazione profonda

delle cellule endoteliali che perdono il contatto tra loro e che tendono quindi a stancarsi dalla lamina

basale sottostante (5).

Tra i diversi fattori che influiscono sulla generazione e progressione della patologia, gioca un ruolo

importante lo stress. La via di comunicazione principale tra il sistema nervoso e quello immunitario

avviene tramite le fibre simpatoadrenergiche. Le terminazioni nervose arrivano alle cellule

immunitarie nei tessuti linfoidi e rilasciano neurotrasmettitori cateloaminergici. Numerose evidenze

suggeriscono che uno stress prolungato con conseguente rilascio di CA può portare ad

infiammazione vascolare e allo sviluppo dell’ATH (17). L’attivazione del sistema simpatico porta

ad un aumentato rilascio di IL-6 da parte delle CE, e sembrerebbe che l’utilizzo di antagonisti dei

recettori β-adrenergici riducano i livelli di questa citochina, suggerendo quindi l’attivazione di

questo tipo di recettori.

29

Lo studio che abbiamo appena iniziato e che proseguirà nel mio post-doc si è proposto di

investigare il coinvolgimento dello stress, in particolare dell’attivazione simpatica nella

progressione della malattia aterosclerotica investigando gli effetti della stimolazione stressogena

sulla funzione endoteliale e sull’abilità di questo tessuto di favorire la penetrazione nel torrente

vascolare delle cellule immunitarie. Quindi, chiarire il meccanismo che collega il sistema nervoso

con il sistema immunitario e con quello vascolare.

Per condurre questo studio ci siamo serviti delle HUVEC, una coltura primaria che rappresenta un

valido strumento per lo studio in vitro della funzione delle CE. Innanzitutto siamo andati ad

investigare l’espressione genica della TH, enzima limitante la sintesi delle CA, e dei loro

trasportatori VMAT-1 e -2; i dati da noi ottenuti mostrano che l’espressione di TH, e dei due

trasportatori è al di sotto della soglia di rilevazione dello strumento. Altra tappa fondamentale nella

sintesi dei mediatori dello stress è l’enzima dopamina-beta idrossilasi che converte la dopamina in

noradrenalina, quindi ci siamo occupati di misurare i livelli di espressione anche di questo enzima. I

dati ottenuti mostrano la presenza dell’mRNA di quest’enzima e anche una sua up-regolazione con

entrambi gli stimoli da noi utilizzati (LPS e TNF-α; il primo rappresenta un tipico stimolo di

attivazione delle CE e il secondo uno stimolo di attivazione di queste cellule più fisiologico in

quanto si tratta di una citochina pro-infiammatoria).

Abbiamo dimostrato la presenza dell’mRNA dei recettori α- e β-AR (compresi i diversi sottotipi) ad

eccezione del β1-AR, sulle HUVEC in condizioni basali. In particolare, per quanto riguarda i

recettori di tipo α-AR essi sono poco espressi e poco modulati dagli stimoli da noi utilizzati, ad

eccezione del sottotipo α2A. i cui livelli di mRNA, seppur bassi, sono incrementati in modo

significativo dopo attivazione delle cellule. Invece, i recettori β2 e β3-AR aumentano in maniera

rilevante dopo attivazione delle HUVEC.

La presenza dei recettori su queste cellule e la loro up-regolazione dopo attivazione cellulare

suggerisce un ruolo di questi recettori nella modulazione della funzione di queste cellule. Di

conseguenza per dare una prima risposta al significato della presenza di questi recettori su queste

cellule abbiamo stimolato le HUVEC con l’agente stressogeno standard cioè l’adrenalina per

valutare gli effetti di questo stimolo sulla funzione delle HUVEC. Abbaimo misurato quindi la

capacità dell’adrenalina di attivare queste cellule valutando gli effetti sull’espressione delle

molecole di adesione ICAM-1 e VCAM-1 che sono i principali responsabili dell’adesione delle

cellule infiammatorie all’endotelio. Il trattamento con concentrazioni crescenti di adrenalina porta

ad un aumento significativo dei livelli di mRNA di entrambe le molecole di adesione, dimostrando

quindi un effetto diretto dell’adrenalina sull’attivazione dell’endotelio, sebbene l’effetto ottenuto sia

sempre inferiore a quello osservato con gli stimoli di controllo che abbiamo usato (LPS e TNF-α).

30

La valutazione dell’espressione di membrana non sembra corroborare tali dati sebbene in questo

caso potrebbe trattarsi più che altro di un problema relativo alla metodica da perfezionare. Questa

nostra preliminare conclusione sulla mancanza di effetto sulla proteina è supportata dai dati ottenuti

in microscopia confocale almeno per ICAM-1 dove si osserva un netto aumento della fluorescenza

dopo trattamento con adrenalina con una distribuzione puntiforme della fluorescenza lungo la

membrana delle cellule ad indicare un effetto sull’espressione della proteina della molecola

d’adesione. Saranno tuttavia necessari ulteriori esperimenti al fine di capire a cosa è dovuta questa

differente distribuzione della proteina e quindi capire meglio il meccanismo d’azione

dell’adrenalina.

Ci siamo anche interessati ad un’altra molecola d’adesione, rappresentata dall’E-selectina, che è la

molecola responsabile dell’adesione dei neutrofili all’endotelio. I dati ottenuti mostrano un aumento

dell’espressione genica di questa molecola dopo attivazione delle HUVEC concentrazioni crescenti

di adrenalina. Questo dato già di per se estremamente rilevante, è reso ancora più interessante dal

dato ottenuto stimolando le HUVEC con adrenalina e quindi facendo aderire i PMN al monostrato

attivato. 1 h di trattamento delle HUVEC con adrenalina induce un aumento significativo

dell’adesione dei PMN alle CE.

Questi dati, seppure ancora parziali e da completare con altre evidenze, mostrano come le HUVEC

siano un valido modello sperimentale per lo studio in vitro della fisiofarmacologia delle cellule

endoteliali e quindi utile approccio per fornire indicazioni sulla modulazione simpatoadrenergica

della funzionalità endoteliale. Inoltre, la regolazione dell’espressione dei recettori adrenergici dopo

esposizione a stimoli proinfiammatori suggerisce il potenziale coinvolgimento di queste vie

recettoriali in diverse condizioni sia fisiologiche che patologiche.

I risultati riguardanti le modificazioni dell’espressione di ICAM-1 in presenza di A richiedono

ulteriori approfondimenti, ma in ogni caso suggeriscono la possibilità di una modulazione

adrenergica dell’espressione della funzionalità delle molecole di adesione endoteliali fino ad oggi

non ancora descritta.

Complessivamente, il modello sperimentale allestito si è rivelato valido e funzionale agli scopi e

permetterà, nell’ambito del complessivo programma di ricerca in cui si inserisce, di chiarire

numerosi aspetti legati alla modulazione simpatoadrenergica della funzionalità endoteliale.

In conclusione, da questi dati preliminari si evince che come già descritto in letteratura,

l’attivazione del SNS (modulazione adrenergica) e l’interazione tra stress e processo infiammatorio,

generano un circuito che può accrescere gli effetti patologici dell’infiammazione, con conseguente

aumento della permeabilità dell’endotelio alle cellule infiammatorie e facilitazione dello stravaso

con aumento della risposta infiammatoria locale. Dato importante però da considerare è che queste

31

cellule esprimono tutti i tipi di recettori adrenergici che come è noto hanno un ruolo diverso nel

mantenimento dell’omeostasi vascolare e pertanto comprendere i meccanismi che conseguono

all’attivazione di uno o dell’altro tipo di recettore può portare nuovi contributi ad un approccio

terapeutico mirato tra l’altro considerando che per ciascuna classe di recettori esistono molecole di

interesse terapeutico già in commercio e pertanto facilmente utilizzabili in maniera specifica.

32

2.6 PROSPETTIVE FUTURE

In riferimento a quelli che sono i presupposti di questo studio sono naturalmente necessari ulteriori

esperimenti volti a chiarire l’effetto dell’adrenalina sulla funzionalità delle cellule endoteliali. In

particolare, saranno necessari esperimenti con antagonisti specifici dei recettori adrenergici al fine

di chiarire quali di questi recettori sono responsabili delle modificazioni funzionali osservate.

Lo studio sarà poi esteso lavorando direttamente sulle CE endoteliali circolanti e sulle CE ottenute

da placca di pazienti sottoposti a intervento di rivascolarizzazione periferica. In tal modo sarà

possibile avere ulteriori informazioni per evidenziare le eventuali differenze esistenti nei soggetti in

funzione della patologia e questo permetterebbe di capire i meccanismi molecolari alla base di

questo processo. Informazioni di questo tipo posso essere utili per individuare possibili alterazioni

funzionali che potrebbero permettere di studiare nuovi approcci terapeutici utili a contrastare se non

l’instaurarsi, ma almeno la progressione della patologia e potrebbe contribuire alla comprensione di

potenziali differenze nell’attivazione cellulare in relazione con le diverse fasi dell’ATH e del ruolo

svolto dallo stress nelle diverse condizioni cliniche.

33

2.7 TABELLE E LEGENDE

α1B-AR α1D-AR

CTRL 1.07±1.52x10-8 4.26±2.11x10-9

LPS 1 µg/ml 1.63±2.70x10-8 5.78±2.14x10-9

TNF-α 10 ng/ml 1.27±3.61x10-8 6.40±3.12x10-9

Tabella 1. Valutazione dell’espressione genica dei recettori e α1B α1D mediante Real Time PCR. La tabella mostra i valori di espressione dopo trattamento delle cellule con LPS o TNF-α. I dati sono espressi come media±SD. n=3.

CTRL LPS 1 µµµµg/ml TNF-αααα 10 ng/ml0

1.0×10 -8

2.0×10 -8

3.0×10 -8

4.0×10 -8

5.0×10 -8

*

DB

H (

2-∆∆ ∆∆

ct)

**


1

2

3

4

DB

H (

2-∆∆ ∆∆

ct)

(ra

tio

del

CT

RL

)

**

**

2.8 FIGURE E LEGENDE

Figura 1. Valutazione dell’espressione genica della DBH. Effetto della stimolazione delle HUVEC con LPS (1µg/ml, overnight) o TNF-α (10 ng/ml, 24 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come ratio del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=6. *=P<0.05 vs CTRL.

A B

35


2.0×10 -8

4.0×10 -8

6.0×10 -8

***

αα αα1

A (

2-∆∆ ∆∆

ct )

*


2

4

6

***

αα αα1

A (

2- ∆∆ ∆∆

ct)

(ra

tio

del

C

TR

L)

*

Figura 2. Valutazione dell’espressione genica del recettore α1A-adrenergico. Effetto della stimolazione delle HUVEC con LPS (1µg/ml, overnight) o TNF-α (10 ng/ml, 24 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come ratio del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=14-11. *=P<0,05 vs CTRL; ***= P<0,0005 vs CTRL.

A B


5.0×10 -8

1.0×10 -7

1.5×10 -7

**

*

αα αα2

A (

2-∆∆ ∆∆

Ct )


2

4

6

8

10

*

*

αα αα2

A (

2-∆∆ ∆∆

Ct )

(ra

tio

del

CT

RL

)

Figura 3. Valutazione dell’espressione genica del recettore α2A-adrenergico. Effetto della stimolazione delle HUVEC con LPS (1µg/ml, overnight) o TNF-α (10 ng/ml, 24 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come ratio del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=14-7. *=P<0,05 vs CTRL; **=P<0,005 vs CTRL.

A B


5

10

15

20

*

*

ββ ββ2 (

2-∆∆ ∆∆

Ct )

(ra

tio

del

CT

RL

)


1.0×10 -7

2.0×10 -7

3.0×10 -7

4.0×10 -7

*

*

ββ ββ2 (

2-∆∆ ∆∆

Ct )

A B

Figura 4. Valutazione dell’espressione genica del recettore β2-adrenergico. Effetto della stimolazione delle HUVEC con LPS (1µg/ml, overnight) o TNF-α (10 ng/ml, 24 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come ratio del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=5. *=P<0,05 vs CTRL.

38


5.0×10 -8

1.0×10 -7

1.5×10 -7

2.0×10 -7

2.5×10 -7

*

**

ββ ββ3 (

2-∆∆ ∆∆

Ct )


2

4

6

8

10

*

**

ββ ββ3 (

2-∆∆ ∆∆

Ct )

(ra

tio

del

CT

RL

)

A B

Figura 5. Valutazione dell’espressione genica del recettore β2-adrenergico. Effetto della stimolazione delle HUVEC con LPS (1µg/ml, overnight) o TNF-α (10 ng/ml, 24 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come ratio del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=5. *=P<0,05 vs CTRL; **=P<0,005 vs CTRL.

Figura 6. Espressione proteica di ICAM-1 nelle HUVEC. Immagine ottenuta mediante analisi al microscopio confocale delle HUVEC marcate con anticorpo primario anti-CD54 coniugato ad un anticorpo secondario anti-IgG1-FITC (verde), in condizioni di riposo (A), dopo trattamento con LPS 1 µg/ml, overnight (B), con TNF-α 10 ng/ml, 24 h (C) e con A 1 µg/ml, overnight (D).

A B

C D

CT

RL

0,00

0000

010,

0000

010,

0001

0,00

1

0,01 0,

1 10

5.0×10 -8

1.0×10 -7

1.5×10 -7

2.0×10 -7

2.5×10 -7

A (µµµµM)

* *

ICA

M-1

(2

- ∆∆ ∆∆c

t )

CT

RL

0,00

0000

010,

0000

010,

0001

0,00

1

0,01 0,

1 1

0

1

2

3

A (µµµµM)

ICA

M-1

(2

-∆∆ ∆∆ct

)

ra

tio

vs

CT

RL

**

Figura 7. Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di ICAM-1. Effetto della stimolazione delle HUVEC con adrenalina (curva concentrazione risposta: 0,1 pM – 1 µM; overnight). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come ratio del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=6. *=P<0,05 vs CTRL.

A B

CTRL A 0,001 µµµµM A 1 µµµµM 0

20

40

60

% c

ell

ule

po

siti

ve

ICA

M-1

Figura 8. Valutazione della stimolazione con

adrenalina sull’espressione proteica di ICAM-1 mediante analisi citofluorimetrica. Effetto della stimolazione delle HUVEC con adrenalina (0.001 -1 µM, overnight). I dati sono espressi come % di cellule positive a ICAM-1. N=8-3.

CT

RL

0,00

0000

010,

0000

010,

0001

0,00

1

0,01 0,

1 1

0

5.0×10 -8

1.0×10 -7

1.5×10 -7

A (µµµµM)

VC

AM

-1 (

2-∆∆ ∆∆

ct)

CT

RL

0,00

0000

010,

0000

010,

0001

0,00

1

0,01 0,

1 1

0

1

2

3

A (µµµµM)

VC

AM

-1 (

2-∆∆ ∆∆

ct)

ra

tio

vs

CT

RL

Figura 9. Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di VCAM-1. Effetto della stimolazione

delle HUVEC con adrenalina (curva concentrazione risposta: 0,1 pM – 1 µM; overnight). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come ratio del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=6.

A B

CTRL A 0,001 µµµµM A 1 µµµµM 0

1

2

3

% c

ell

ule

po

siti

ve

VC

AM

-1

Figura 10. Valutazione della stimolazione con

adrenalina sull’espressione proteica di VCAM-1 mediante analisi citofluorimetrica. Effetto della stimolazione delle HUVEC con adrenalina (0.001 -1 µM, overnight). I dati sono espressi come % di cellule positive a ICAM-1. N=8-3.

CT

RL

0,00

0000

010,

0000

010,

0001

0,00

1

0,01 0,

1 1

0

5.0×10 -7

1.0×10 -6

1.5×10 -6

2.0×10 -6

2.5×10 -6

3.0×10 -6

3.5×10 -6

4.0×10 -6

4.5×10 -6

A (µµµµM)

*

*

*

*

E-S

ele

ctin

a (

2-∆∆ ∆∆

ct)

CT

RL

0,00

0000

010,

0000

010,

0001

0,00

1

0,01 0,

1 1

0

5

10

15

20

A (µµµµM)

*

*

*

*E

-Sele

ctin

a (

2-∆∆ ∆∆

ct)

rati

o v

s C

TR

L

Figura 11. Valutazione della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di E-Selectina. Effetto della stimolazione delle HUVEC con adrenalina (curva concentrazione risposta: 0,1 pM – 1 µM; overnight). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come ratio del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=3-6 *=P<0.05 vs CTRL.

A B

CTR

L Mµµµµ

A 1

fM

LP

fMLP+A

0

20

40

60

*

* #

**

% d

i esp

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ion

e d

el

CD

16

Figura 12. Valutazione del’effetto dell’adrenalina sulla co-coltura PMN-HUVEC mediante analisi citofluorimetrica. Valutazione dell’adesione dei PMN alle HUVEC in condizioni basali e dopo trattamento delle HUVEC con adrenalina (1 µM ); come controllo positivo sono stati stimolati i PMN con fMLP (0.1 µM ), che rappresenta un tipico stimolo di attivazione dei PMN. L’analisi condotta al citofluorimetro dopo pre-marcatura dei PMN con anticorpo anti-CD16. La colonna bianca rappresenta la percentuale (%) di adesione dei PMN in condizioni basali; la colonna grigio chiaro la % di adesione dopo stimolazione delle HUVEC con A; la colonna nera la % di adesione dopo attivazione dei PMN con fMLP; la colonna grigio scuro la % di adesione dopo la pre-stimolazione delle HUVEC con A e dei PMN con fMLP. I dati sono espressi come media±SD della % di cellule CD16+. N=4 *=P<0.05 vs CTRL; *=P<0.005 vs CTRL; *#=P<0.05 vs fMLP.


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47

ALLEGATO 1

LAMINAR PATTERN OF MINERAL CALCIUM-PHOSPHORUS

DEPOSITS IN A HUMAN CAROTID PLAQUE: NANOSCALE

ULTRASTRUCTURE AND ELEMENTAL ANALYSIS

48

ALLEGATO 2

SCANNING ELECTRON MICROSCOPY EXAMINATION OF

ENDOTHELIUM MORPHOLOGY IN HUMAN CAROTID

PLAQUES

49

ALLEGATO 3

GENE EXPRESSION OF ADHESION MOLECULES IN

ENDOTHELIAL CELLS FROM PATIENTS WITH PERIPHERAL

ARTERIAL DISEASE IS REDUCED AFTER SURGICAL

REVASCULARIZATION AND PHARMACOLOGICAL

TREATMENT

50

CAPITOLO 3

NEUTROFILI E ATEROSCLEROSI: RUOLO DELLO STRESS

51

3.1 INTRODUZIONE

3.1.1 PMN E INFIAMMAZIONE NELL’ATH

I PMN rappresentano un componente importante della risposta immunitaria innata. Queste

cellule fagocitarie sono coinvolte principalmente nell’infiammazione acuta inglobando il tessuto

danneggiato e i batteri, secernendo enzimi proteolitici come elastasi e metalloproteinasi della

matrice. Per quanto riguarda le alterazioni funzionali che si verificano a livello cellulare nell’ATH,

un primo intervento dei PMN, associato ad un aumento dello stress ossidativo e al rilascio di

citochine pro-infiammatorie, è stata descritto sia nel modello animale che in quello umano con alto

rischio cardiovascolare, ipercolesterolemia, ipertensione, diabete e insufficienza renale (1;2).

L’ipercolesterolemia causa un incremento della conta dei monociti ed ei neutrofili circolanti e rende

queste cellule più soggette alla migrazione all’interno della placca aterosclerotica (3).

L’ipercolesterolemia è una patologia multifattoriale e i PMN infiltrano le arterie precocemente

durante le fasi iniziali dell’ATH. Questi dati suggeriscono l’importanza del ruolo di queste cellule

nell’inizio dell’ATH (4). L’implicazione delle cellule infiammatorie, come macrofagi e cellule T,

nell’aterogenesi è ben documentata (5). Il primo evento nell’ATH è la ritenzione delle lipoproteine

ossidate ad alta densità (LDLox) nello spazio subendoteliale innescando una risposta immunitaria

che porta alla disfunzione delle cellule endoteliali (CE) e ad un incremento dell’interazione cellule

immunitarie-EC, portando all’amplificazione della cascata infiammatoria (6). E’ ben noto che

durante le fasi iniziali dell’ATH, i leucociti sono richiamati all’interno del vaso tutto intorno

all’endotelio integro che esprime molecole di adesione (7) e la transmigrazione delle cellule è

guidata da fattori chemotattici prodotti nello strato subendoteliale e/o dalle cellule infiammatorie. In

questo contesto, l’interleuchina (IL)-8 prodotta da monociti e leucociti polimorfonucleati (PMN)

gioca un ruolo chiave agendo in modo autocrino/paricrino, potenziando la risposta infiammatoria

sistemica e locale reclutando le cellule infiammatorie. L’IL-8 presumibilmente stimola l’ATH

attraverso l’incremento dell’adesione monociti-endotelio (8), attraverso la propria azione mitogena

e chemoattrattante sulle cellule muscolari lisce (9), e mediando l’angiogenesi nella placca

aterosclerotica (10).

I PMN sono effettori ubiquitari in condizioni diverse e sono i principali produttori di mediatori

proinfiammmatori come l’IL-8, le metalloproteinasi, e le specie reattive dell’ossigeno (ROS) (11).

In alcuni nostri lavori abbiamo dimostrato che le cellule immunitarie subiscono cambiamenti

funzionali in soggetti sani ad alto rischio cardiovascolare (12;13;14;15) e che queste risposte

funzionali sono modulate dal trattamento farmacologico.

52

I PMN, come i monociti, sono cellule fagocitarie implicate nell’immunità innata (16). Rispetto al

riconoscimento e alla distruzione del patogeno, i neutrofili contribuiscono al danno tissutale

liberando enzimi, come mieloperossidasi, elastasi, esterasi, e la metalloproteinasi della matrice

(MMP)-9 (17). Recentemente, sono stati pubblicati molti dati circa la pentrassina 3 (PTX3), un

componente essenziale del sistema umorale dell’immunità innata. Le pentrassine sono una

superfamiglia di proteine della fase acuta altamente conservate durante l’evoluzione e che possono

essere classificate come pentrassine corte, come la proteina C-reattiva e pentrassine lunghe come

PTX3. PTX3 come la PCR, sono marcatori dell’ATH e correlano con i fattori di rischio per lo

svilupparsi di eventi vascolari (18). PTX3 è sintetizzata localmente nel sito dell’infiammazione da

diverse tipi cellulari dopo esposizione a stimoli diversi e componenti microbici, inclusi il

lipopolisaccaride (LPS) (19;20). Stimoli infiammatori, quali l’IL-1β, l’LPS, inducono l’espressione

di PTX3 in un gran numero di tipi cellulari diversi come per esempio nelle CE vascolari, nelle

cellule muscolari lisce (SMC), nelle cellule dendritiche (DCs), negli adipociti, e i sinoviociti (21). I

PMNs non esprimono l’mRNA di PTX3 nelle cellule in condizioni basali o dopo stimolazione (22),

tuttavia, un accumulo intracellulare della proteina funzionale è presente in specifici granuli

lattoferrina-positivi dei neutrofili umani (23). Dopo il riconoscimento microbico, PTX3 viene

liberato dai granuli dei PMN e si localizza in granuli extracellulari che protrudono dai PMN attivati

(24;25).

I PMNs sono presenti nella lesione aterosclerotica anche se sembra in numero molto ridotto. Queste

cellule insieme ai mediatori derivati da essi sono stati recentemente descritti nella lesione

aterosclerotica di campioni umani e nei modelli animali di aterosclerosi (26;27). I PMN sono stati

trovati infiltrati a livello del cappuccio della placca, e nelle aree attorno alla media (28). Il numero

dei PMN è fortemente associato alle caratteristiche istopatologiche di rottura della lesione

aterosclerotica e suggerisce un ruolo dei PMN nella destabilizzazione della placca (28). In uno dei

primi studi di cui mi sono occupata durante il mio corso di dottorato, abbiamo visto che i PMN

circolanti di pazienti sottoposti a endoarterectomia (TEA) femorale mostrano una funzionalità

alterata rispetto a soggetti sani (allegato 4; 29). Questo dato è apparentemente in contrasto con i

dati che dimostrano uno stato infiammatorio elevato in questa categoria di pazienti e ci ha portato

ad ipotizzare che il ruolo dei PMN in una fase avanzata della malattia come la placca conclamata

possa essere differente da quello che queste cellule hanno nella fase iniziale della risposta

infiammatoria, aprendo quindi un nuovo scenario di ricerca sul ruolo di queste cellule nelle diverse

fasi del processo aterosclerotico.

53

3.1.2 PMN E STRESS NELL’ATH

Numerose evidenze indicano che l’ATH rappresenta una patologia immuno-infiammatoria dove

diversi fattori potrebbero giocare un ruolo chiave. Tra gli altri fattori che potrebbero contribuire alla

generazione e alla progressione della patologia, il ruolo dello stress non è molto conosciuto, in

particolare quando per stress si intendono i fattori ambientali che agiscono nelle prime fasi della

patologia. Lo stress attiva l’asse ipotalamo-ipofisario e il sistema nervoso simpatico (SNS),

portando al rilascio di diversi neurotrasmettitori e ormoni come i glucocorticoidi e le catecolamine

(CAs) che possono influenzare negativamente il sistema cardiovascolare e come conseguenza

accelerare la cronicità dell’ATH. La fine organizzazione nella comunicazione tra il sistema nervoso

e quello immunitario si realizza principalmente attraverso le fibre simpatiche che costituiscono

anche un legame tra la regolazione del sistema cardiovascolare e l’omeostasi cellulare. Le

terminazioni nervose raggiungono le cellule immunitarie nei tessuti linfoidi così come le pareti dei

vasi e liberano CA come noradrenalina (NA), dopamina (DA) e adrenalina (A). La farmacologia

molecolare delle CA è infatti molto complessa, e offre un ampio spettro di possibili punti di

modulazione delle risposte funzionali: NA e A legano una particolare categoria di recettori

accoppiate a proteine-G, i recettori adrenergici (AR), inclusi gli α-1 e -2, e i β-1, -2 e -3,

funzionalmente legati a secondi messaggeri intracellulari come l’cAMP, il Ca++ (30). Circa l’80%

della NA liberata dalle terminazioni nervose è riciclata mentre la rimanente rimane in circolo (31).

Diversi tra questi recettori sono stati identificati sia sulle cellule immunitarie. La consapevolezza

dell’importante ruolo dello stress nello svilupparsi dell’ATH solleva anche alcune questioni

piuttosto critiche circa la ben nota, ma poco conosciuta associazione tra lo stress della vita

quotidiana e la patologia cardiovascolare. Infatti, gli eventi infiammatori causati dallo stress

contano circa il 40% dei pazienti aterosclerotici, con nessun altro rischio cardiovascolare associato

(32;33). Numerose evidenze suggeriscono che lo stress prolungato e l’aumentata produzione di

trasmettitori adrenergici potrebbero indurre infiammazione vascolare e probabilmente anche lo

sviluppo dell’ATH (34). Tra le cellule implicate nell’ATH, i sottotipi recettoriali per le CA sono

stati identificati sia sulle cellule immunitarie che su quelle endoteliali. Per esempio, l’attivazione del

sistema simpatico porta ad un aumento della liberazione di IL-6 da parte delle CE. Rilevanze

cliniche di questi fenomeni è indicata dalla capacità degli agenti bloccanti gli β-ADR di ridurre la

produzione di IL-6 e dei livelli di proteina C-reattiva in pazienti con patologia cardiovascolare,

suggerendo l’implicazione del rilascio di NA e dell’attivazione dei β-AR (35). Un ulteriore

complicazione al sistema neuro-immunitario deriva da recenti osservazioni che i linfociti umani

possiedono un sistema endogeno dopaminergico/adrenergico e meccanismi molecolari completi per

la loro sintesi, accumulazione e rilascio (36;37). Non solo i linfociti, ma anche i neutrofili sono

54

capaci di sintetizzare CA (38), ed è stato dimostrato che questo neurotrasmettitori sono in grado di

influenzare la funzione di queste cellule (39). I PMN esposti a stimoli infiammatori/infettivi

mostrano un aumentata produzione non solo di CA ma anche di altri enzimi tirosina idrossilasi

(TH), dopamina-beta-idrossilasi (DBH) (39). La concentrazione plasmatica della proteina heat

shock di 72kDa e la sua produzione cellulare aumentano sotto condizione di stress, incluso

l’esercizio fisico intenso e le cellule che producono questa proteina sono i neutrofili (40). E’ stato

anche dimostrato che la concentrazione fisiologica post-esercizio fisico di NA stimola i macrofagi

(41) e la funzione dei neutrofili (42), suggerendo un ruolo fisiologico importante della NA come

“mediatore dello stress” o “segnale di pericolo” nella stimolazione della risposta immunitaria innata

durante lo stress indotto dall’esercizio.

55

3.2 SCOPO

Numerose evidenze indicano che l’ATH è causata da un processo immuno-infiammatorio cronico e

che i PMN giocano un ruolo chiave nelle prime fasi della patologia prima delle tipiche

manifestazione cliniche e durante la clinica destabilizzazione della patologia associate alla rottura

della placca. Tuttavia, il ruolo del sistema neuro-immunitario e del sistema stressogeno non è ben

conosciuto, in particolare è poco noto il ruolo esercitato dalla componente simpato-adrenergica

nella patogenesi dell’infiammazione cronica e nell’ATH. Questo rappresenta un importante anello

mancante nella conoscenza, e potrebbe suggerire un nuovo e innovativo approccio di ricerca mirato

a chiarire i meccanismi molecolari e cellulari implicati sia nella disfunzione cellulare precoce e

nella formazione della placca aterosclerotica e nella destabilizzazione della placca associata con la

presenza sintomi clinici.

Lo scopo del presente studio in conclusione del mio corso di dottorato e che sarà il programma del

mio post-dottorato, è stato quello e di individuare un possibile marker predittivo di instabilità della

placca analizzando da un punto di vista funzionale i PMN, cellule che sono coinvolte nella fase

iniziale del processo aterosclerotico. In particolare, questo lavoro, in quest’anno ha avuto lo scopo

di chiarire l’influenza esercitata dai mediatori della stress del sistema simpatico nell’influenzare la

risposta funzionale dei PMN, cellule immunitarie principalmente implicate nell’ATH ma poco

studiate. In questa fase preliminare dello studio mi sono occupata di iniziare a caratterizzare nei

PMN di soggetti sani la presenza del sistema adrenergico e la possibilità di modulare questo sistema

attraverso stimoli che classicamente sono utilizzati in vitro per attivare queste cellule. Sono quindi

stati condotti esperimenti con la stimolazione dei PMN con il peptide fMLP.

Lo studio proseguirà poi nel mio post-dottorato, sulla valutazione in vivo ed ex vivo degli effetti

dello stress nelle progressione della malattia aterosclerotica. In particolare, una prima parte dello

studio sarà organizzata in due fasi ed avrà lo scopo di valutare in due gruppi di soggetti: soggetti

sani e soggetti ipercolesterolemici: 1) gli effetti in vitro della stimolazione con agenti stressogeni

(NA e A) sulla funzione dei PMN e 2) in un modello ex vivo per studiare gli effetti dello stress (in

un modello ex vivo di stress mentale) sulla funzione dei PMN. La seconda parte si pone come

obiettivo la caratterizzazione delle differenze tra la funzione dei PMN e la risposta della

“stimolazione in vitro” con agenti stressogeni in cellule ottenute da sangue venoso periferico e dalla

placca carotidea di pazienti che presentano o no anamnesi di sintomi neurologici legati alla placca e

sottoposti a TEA carotidea.

In funzione di sviluppare poi nel mio post-dottorato la parte 2 di questo progetto, in quest’ultimo

anno mi sono occupata della messa a punto di un metodo innovativo che permettesse di separare i

PMN da tessuto e in particolare visto lo scopo del nostro progetto, da sezioni di placca carotidea.

56

Questa prima parte della messa a punto della metodica quindi ha riguardato appunto la scelta del

metodo adatto ad ottenere delle cellule che poi potessero essere valutate anche dal punto di vista

funzionale per avere la possibilità di studiare eventuali differenze non solo tra cellule ottenute da

placche di pazienti con grado diverso di patologia, ma anche tra cellule residenti nella placca e

cellule circolanti per eventualmente evidenziare differenze funzionali che possano permettere di

chiarire meglio il ruolo di queste cellule in questo tessuto.

57


3.3.1 Isolamento dei PMN circolanti

I PMN sono isolati dal sangue venoso di pazienti e donatori sani seguendo mediante

centrifugazione su gradiente di Ficoll (Ficoll-Paque Plus, Amersham) utilizzando le metodiche

standard.

3.3.2 Messa in coltura dei PMN per la valutazione del’espressione dei recettori

adrenergici, della TH e dei trasportatori delle catecolamine

I PMN ottenuti da donatori sani sono posti in coltura in condizioni di riposo e dopo attivazione

con fMLP (0.1 µM) per 3 h e successivamente analizzati per valutare l’espressione genica dei

recettori adrenergici α-1 e -2 e β-1, -2 e -3, oltre che della tirosina idrossilasi (TH) e dei trasportatori

delle catecolammine, VMAT1 e 2.

3.3.3 Messa in coltura dei PMN stimolati con adrenalina

I PMN ottenuti da donatori sani stati posti in coltura in presenza di una curva concentrazione

risposta all’adrenalina (0,1 pM - 1 µM) per 1, 3 e 24 h. Trascorso il tempo di coltura i campioni

sono recuperati, centrifugati a 400 g per 10 min e le cellule e i surnatanti sono congelati per le

analisi successive.

3.3.4 Valutazione dell’espressione genica dell’IL-8 e della β2-integrina mediante Real

Time PCR





secondo la procedura descritta sul libretto delle istruzioni. L’analisi di real time è, infine, condotta

utilizzando lo strumento ABI prism 7000 (Applied Biosystem, California, USA), dove ha inizio una

serie di cicli riportata in breve: un primo ciclo di 2 min a 50°C, un secondo di 10 min a 95°C e 40

cicli di 15 sec a 95°C.

58






3.3.5 Valutazione della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS)

I livelli intracellulari di ROS sono misurati mediante l’uso di una sonda

dichlorodihydrofluorescein-diacetate (C-DCDHF-DA; MolecularProbe, Eugene, OR, USA) come

descritto in letteratura (Guasti et al., 2006) e analizzati allo spettrofluorimetro (Perkin-Elmer LS-

50B). I dati sono espressi come intensità di fluorescenza (FI). La produzione di ROS è calcolata a

riposo e come delta (D) della variazione misurata come produzione indotta dopo 60 min

d’incubazione con fMLP (0.1 µM) aggiunto dopo 1 min di valutazione nel campione non stimolato.

3.3.6 Arruolamento di dei pazienti con stenosi carotidea

I pazienti sono arruolati (10: 6M; 4F, età compresa tra 57 e 81 anni) al dipartimento di Scienze

Chirurgiche e Morfologiche in quanto affetti da insufficienza cerebrovascolare e portatori di stenosi

carotidea e successivamente sottoposti ad intervento di rivascolarizzazione mediante

tromboendoarteriectomia carotidea (TEA) per semieversione presso l’Unità Operativa di Chirurgia

Vascolare.

La TEA carotidea è stata effettuata secondo le linee guida della Società Europea di Chirurgia

Vascolare ESVS. Il tessuto asportato e un campione di sangue venoso periferico è successivamente

arrivato nel nostro laboratorio per le analisi successive.

3.3.7 Messa a punto di una metodica per la disgregazione meccanica della placca

carotidea

La disgregazione della placca mediante il sistema automatico Becton-Dickinson Medimachine

utilizzato nel nostro studio, è una metodica innovativa. Fino al 2009 la disgregazione delle placche

aterosclerotiche era effettuata mediante disgregazione enzimatica, una tecnica molto più costosa e

laboriosa e che soprattutto portava ad avere cellule che poi non era possibile utilizzare per saggi

funzionali.

Per la messa a punto della metodica sono utilizzate 10 placche aterosclerotiche carotidee di pazienti

sottoposti a TEA della biforcazione carotidea. Inizialmente sono stati effettuati diversi tentativi

59

(Tab. 11) al fine di ottenere un campione che avesse una vitalità cellulare superiore al 95% per

procedere con le fasi successive dello studio.

Una volta messa a punto la metodica, la placca è stata processata nel seguente modo:

1) Lavaggio della placca e conservazione in RPMI 1640

Per prima cosa la placca viene sottoposta a 3 lavaggi con soluzione fisiologica al fine di

eliminare il sangue macroscopicamente visibile e residuo nel lume vasale. Successivamente viene

posta in una provetta contenente RPMI 1640 Medium con 25 mM di Hepes (EuroClone Spa, Life

Sciences Division, Italia) che permette di mantenere il tessuto in condizioni ottimali fino al

momento della disgregazione tissutale.

2) Disgregazione della placca

La placca carotidea viene processata mediante l’utilizzo del sistema automatico Becton-

Dickinson Medimachine (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) che ne permette la disgregazione

meccanica.

Questo sistema comprende tre componenti: la Medimachine (figura 1, pannello A), i Medicons

(figura 1, pannello b). ed i Filcons (figura 1, pannello C).

Tabella 11. Messa a punto della metodica: diversi tentativi per ottenere una buona vitalità cellulare e riuscire a separare i PMNs.

60

I Medicons sono cellette all’interno delle quali vengono posti 2 o 3 frammenti di placca (ottenuti

sezionandoli attraverso l’uso di un bisturi sterile) insieme a 2 ml di RPMI 1640. I medicons

contengono una lamina che viene messa in rotazione alla velocità di 100 rpm dalla medimachine in

cui essi vengono inseriti. La lamina è fatta ruotare per 3 minuti, tempo necessario alla disgregazione

dei frammenti ed alla formazione di un omogenato cellulare, cioè una sospensione costituita dal

terreno RPMI 1640 all’interno del quale si potranno individuare cellule di diverso genere,

frammenti di colesterolo, calcio e tutto ciò di cui è costituita la placca aterosclerotica. Il processo

viene ripetuto fino alla disgregazione dell’intera placca, raccogliendo tutto l’omogenato all’interno di

una provetta da 50 ml.

3) Filtrazione dell’omogenato cellulare

Successivamente, tale sospensione viene ripetutamente filtrata usando i Filcons, filtri con il

diametro dei pori di 70, 50 e 30 µm. Questo processo viene ripetuto più volte passando da filtri di

diametro diverso, cercando di eliminare il più possibile detriti o frammenti non completamente

disgregati. Successivamente. Il campione viene centrifugato a 400g per 10 min e il pellet recuperato

viene risospeso in 10 ml di RPMI 1640 e si procede alla conta ed alla valutazione della vitalità

cellulare.

4) Conta e valutazione della vitalità cellulare

Per la conta e la valutazione della vitalità cellulare la sospensione cellulare viene incubata e

con di TrypanBlue. La figura 2 mostra un campione di omogenato cellulare osservato al

microscopio ottico.

Figura 1. Pannello A: medimachine. Pannello B: medicon. Pannello C: filcons

A B

61

5) Messa in coltura dell’omogenato cellulare

Terminata la conta cellulare, l’omogenato viene messo in coltura overnight in terreno

completo di 20% di FBS e 1% di antibiotico al fine di migliorare la resa per la separazione dei

PMN.

3.3.8 Sorting immunomangetico dei PMN dalla placca carotidea

I pPMN (PMN da placca) sono purificati a partire dall’omogenato cellulare mediante sorting

immunmagnetico utilizzando il kit CD15 Beads (MACS, Bilteny Biotec) seguendo le istruzioni

fornite dal kit.

3.3.9 Valutazione dell’espressione genica di IL-8 ed elastasi nei pPMN

Per la descrizione della metodica vedi par. 3.3.5

3.3.10 Analisi immunoistochimica della placca carotidea

Per la valutazione della presenza dei PMN nella placca ci siamo affidati alla collaborazione

con il Consorzio MIA di Milano. In particolare per la loro identificazione abbiamo utilizzato il

CD66b che è un marker specifico per i PMN ampiamente descritto in letteratura (43). L’analisi

immunoistichimica è stata condotta seguendo le procedure standard.

A B C

Figura 2. Osservazione al microscopio ottico dell’omogenato cellulare ottenuto dopo disgregazione meccanica della placca. Pannello A: omogenato cellulare; le frecce indicano le cellule presenti nella sospensione cellulare. Pannello B: cristallo di colesterolo (freccia nera).

62


I risultati sono espressi come media ± SD (Standard Deviation o Deviazione Standard) di






ANOVA).

63

3.4 RISULTATI

3.4.1 Valutazione dell’espressione genica della TH e dei trasportatori delle catecolamine

L’analisi dell’espressione genica condotta sui PMN isolati e messi in coltura in condizioni

basali e dopo 3 h di trattamento con fMLP (0.1 µM) mostra la presenza della TH che, sebbene

espressa, lo è a valori molto bassi e la sua espressione non risulta modificata dopo stimolazione con

fMLP (tabella 1). Per quanto riguarda i trasportatori delle catecolamine, VMAT-1 e -2, la loro

espressione risulta essere al di sotto dei limiti di rilevazione dello strumento (tabella 1).

3.4.2 Valutazione dell’espressione genica dei recettori α e β adrenergici e dei loro diversi

sottotipi

Tutti i recettori α e β adrenergici sono espressi sui PMN in condizioni basali (figure 1, 2, 3, 4, e

5, pannelli A) ad eccezione dei sottotipi α2B e α2C per i quali i valori sono al di sotto della soglia di

rilevazione dello strumento (tabella 1). In particolare, mentre i sottotipi recettoriali α1, α2 e β1 sono

espressi a dei livelli molto bassi (α1A: 2.1±5.7x10-8; α1B e α1D: vedi tabella 1; α2A: 6.5±1.8x10-8; β1:

4.6±1.5x10-8), i sottotipi β2 e β3 presentano dei livelli di mRNA più elevati già in condizioni di

riposo (β2: 1.2±3.3x10-7; β3: 2.6±7.1x10-6).

La stimolazione con fMLP (0.1 µM, 3 h) mostra un aumento statisticamente significativo

dell’espressione genica del recettore α1A (figura 1, pannello B), seppur si tratta di un aumento di 1

sola volta dell’espressione genica (fMLP vs CTRL: 2.3±1.0). Per quanto riguarda gli altri due

sottotipi recettoriali, α1B e α1D, non si osservano modificazioni significative dopo trattamento con

fMLP (tabella 1). I livelli di mRNA del recettore α2A risultano essere aumentati dopo trattamento dei

PMN con fMLP, infatti si osserva un aumento di circa 4 volte (figura 2, pannello B, fMLP vs

CTRL: 5.8±4.2) seppur al limite della significatività.

L’analisi mediante Real Time PCR del recettore adrenergico β1 mostra un aumento statisticamente

significativo di circa 2 volte dopo trattamento dei PMN con fMLP (figura 3, pannello B). Anche per

quanto riguarda il recettore β2 si osserva un aumento di 4 volte dei livelli di mRNA seppur non

avvalorata dalla significatività statistica (figura 4, pannello B). Infine, riguardo al recettore β3 i dati

mostrano un aumento altamente significativo di ben 11 volte dei livelli di mRNA dopo trattamento

con fMLP (figura 5, pannello B).

64

3.4.3 Effetto della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica di IL-8

La stimolazione per 1 h con concentrazioni crescenti di adrenalina (A; 0.1 pM – 1 µM) induce

un aumento statisticamente significativo dei livelli di mRNA per l’IL-8 di circa 3 volte a partire

dalla concentrazione di 0.1 nM. La stimolazione per 3 h con A mostra un incremento di circa 14

volte con la concentrazione di 0.1 pM e da 4 a 5 volte con le altre concentrazioni utilizzate (figura

7, pannelli A e B). Il trattamento dei PMN con le stesse concentrazioni per 24 h non induce alcuna

modificazione dell’espressione.

3.4.4 Effetto della stimolazione con adrenalina sull’espressione genica della molecola di

adesione β2-integrina

La stimolazione per 1 h con concentrazioni crescenti di A (0.1 pM – 1 µM) induce un

incremento statisticamente significativo dei livelli di mRNA per la β2-integrina di circa 3 volte a

partire dalla concentrazione di 1 nM (figura 7, pannelli A e B). Anche il trattamento per 3 h con

concentrazioni crescenti di A induce un aumento di circa 7 volte con la concentrazione di 0.1 nM e

da 4 a 10 volte con le altre concentrazioni utilizzate (figura 7, pannelli A e B). Come per L’IL-8, il

trattamento dei PMN con le stesse concentrazioni per 24 h non induce alcuna modificazione

dell’espressione.

3.4.5 Effetto della stimolazione con adrenalina sulla produzione di specie reattive

dell’ossigeno (ROS)

La produzione basale di ROS non viene modificata dall’incubazione per 60 s con

concentrazioni crescenti di A (tabella 2).

3.4.6 Valutazione del numero di cellule ottenute dopo disgregazione della placca carotidea

La figura 8 mostra il numero totale di cellule ottenute dalla lesione aterosclerotica carotidea

disgregata meccanicamente mediante l’utilizzo della Madimachine, secondo le modalità descritte in

precedenza, prima della separazione dei PMNs mediante sorting positivo immunomagnetico. E’

possibile evidenziare la differenza fra il numero di cellule ottenute dalle placche a prevalenza

lipidica (soft; n° cellule: 3.3±2.9x107) e quelle a prevalenza calcifica (hard; n° cellule: 1.1±1.1x107)

o mista (fibro-lipidiche; n° cellule: 7.6±6.5x106), seppur priva di significatività statistica.

65

3.4.7 Valutazione dell’espressione genica dell’IL-8 e dell’elastasi nei pPMN e nei cPMN di

pazienti sottoposti a TEA

I PMN circolanti (cPMN) dei pazienti sottoposti a TEA mostrano livelli di mRNA più bassi

rispetto ai cPMN ottenuti da sangue venoso periferico di controlli sani (figura 9, pannello A),

seppur questa differenza non risulta significativa. Inoltre, l’espressione genica dell’IL-8 nei PMN

isolati dalla placca carotidea (pPMN) hanno un’espressione più bassa sia rispetto ai cPMN dei

controlli sani che rispetto ai cPMN ottenuti dal sangue venoso periferico degli stessi pazienti.

I dati relativi ai livelli di mRNA per l’elastasi mostrano una ridotta espressione in cPMN e pPMN di

pazienti rispetto ai controlli sani (figura 9, pannello B). Inoltre, i pPMN presentano una ridotta

espressione dell’elastasi rispetto ai cPMN.

3.4.8 Valutazione della presenza dei PMN nella placca carotidea.

La figura 10 mostra un’immagine di una placca carotidea, ottenuta da un paziente sottoposto a

TEA, nella quale è possibile identificare i PMN mediante la marcatura del tessuto con anticorpo

anti-CD66b (rosso), che è un marker specifico e distintivo dei PMN. E’ possibile inoltre notare

come i PMN sia preferenzialmente localizzati nella zona vicina alla placca a differenza

dell’infiltrato infiammatorio (identificato dai nuclei blu marcati con ematossilina) che invece

presenta una distribuzione ben più omogenea su tutto il tessuto (figura 10).

66

3.5 CONCLUSIONI

I PMN, come i monociti, sono cellule implicate nella risposta immunitaria di tipo innato. Numerose

evidenze indicano che l’ATH è causata da un processo immuno-infiammatorio cronico e che i PMN

giocano un ruolo chiave nelle prime fasi della patologia prima delle tipiche manifestazioni cliniche

e durante la destabilizzazione della patologia associate alla rottura della placca (4). I PMN sono

effettori ubiquitari in condizioni diverse e sono i principali produttori di mediatori pro-infiammatori

come l’IL-8, le metalloproteinasi e i ROS (11). In alcuni nostri lavori abbiamo dimostrato che le

cellule immunitarie subiscono cambiamenti funzionali in soggetti sani ad alto rischio

cardiovascolare (12;13;14;15) e che queste risposte funzionali sono modulate dal trattamento

farmacologico.

Diversi sono i fattori che contribuiscono allo sviluppo della patologia cardiovascolare. Tra gli altri

fattori, il ruolo dello stress non è molto conosciuto, soprattutto quando per stress si intendono i

fattori ambientali che agiscono nelle prime fasi della patologia. Lo stress, infatti, attiva sia l’asse

ipotalamo-ipofisiario che il SNS, causando il rilascio di CA che posso agire direttamente sul

sistema cardiovascolare, agendo direttamente sulle cellule immunitarie e influenzare negativamente

il sistema causando, come conseguenza, un’esacerbazione della patologia aterosclerotica. Il ruolo

del sistema neuro-immunitario e di quello stressogeno non è ben conosciuto, in particolare è poco

noto il ruolo esercitato dalla componente simpato-adrenergica nella patogenesi dell’infiammazione

cronica e nell’ATH.

In questa fase iniziale di questo progetto che continuerà nel mio post-doc, abbiamo innanzitutto

evidenziato che i PMN esprimono, a livello di mRNA, la tirosina idrossilassi (TH), enzima

limitante la sintesi delle CA, che seppur espresso a dei livelli molto bassi, è presente ma tuttavia la

sua espressione genica non risulta essere modificata dallo stimolo tipico dei PMN, rappresentato

dall’fMLP. Mentre i trasportatori delle catecolammine, VMAT1 e -2, sembrerebbero non essere

espressi o comunque a dei livelli che non sono rilevabili con la strumentazione da noi utilizzata.

Questa prima osservazione verrà ulteriormente approfondita nei prossimi mesi andando ad indagare

se anche la stimolazione dei PMN con stimoli più propriamente fisiologici, e di notevole interesse

nell’aterosclerosi per il ruolo importante che hanno nella progressione della malattia, quali IL-8,

TNF-α e IL-1β non modificano l’espressione di TH e dei trasportatori. Dati precedenti del nostro

laboratorio hanno già evidenziato che i PMN contengono catecolamine (CA) (44), pertanto parte

ancora da valutare è se questo contenuto può differire nelle diverse fasi della patologia.

Pochi studi sono stati condotti sulla valutazione dell’espressione dei recettori per le CA nei PMN. In

questa fase di inizio dello studio, ci siamo occupati di andare a misurare l’espressione del mRNA

per i diversi recettori adrenergici nei PMN e se quest’espressione è modulabile. Ci sono lavori in

67

vivo e in vitro che suggeriscono un ruolo dei recettori β-adrenergici sui PMN, in particolare molti di

questi si riferiscono ad un ruolo dei recettori β2-AR come modulatori delle funzioni dei PMN; si

tratta si di lavori condotti sia in modelli animali (45) che in modelli umani (46;47), ma la maggior

parte di questi studi sono condotti in maniera indiretta, cioè indagando il ruolo dei diversi recettori

utilizzando degli antagonisti non selettivi o selettivi. In alcuni casi sono anche stati analizzati i

livelli di espressione di questi recettori dimostrando per esempio l’assenza del recettore β1-AR e

un’espressione del β2-AR nonché una sua implicazione in alcune funzioni importanti dei neutrofili

quali per esempio la migrazione cellulare con un diverso effetto su soggetti di sesso diverso (48).

Noi, in questo lavoro siamo andati ad indagare l’espressione genica di tutti i recettori α (α1 e α2) e

βAR e dei loro diversi sottotipi (α1A, α1B e α1D, α2A, α2B e α2C,. β1, β2 e β3) I dati ottenuti mostrano

un’espressione di tutti i recettori adrenergici sui PMN in condizioni basali ad eccezione dei sottotipi

α2B e α2C per i quali i livelli di espressione di mRNA sono al di sotto della soglia di rilevabilità dello

strumento da noi utilizzato. In particolare, mentre i sottotipi recettoriali α1 e α2 (compresi i sottotipi)

e il β1 sono espressi a dei livelli molto bassi, i recettori β2 e β3-AR presentano dei livelli di

espressione di mRNA più elevati già in condizioni basali. Inoltre, questi recettori, ad eccezione di

α1B e α1D, subiscono un incremento della loro espressione dopo trattamento delle cellule con fMLP,

che rappresenta uno stimolo di attivazione tipico dei PMN. Quest’aumento dell’espressione risulta

essere particolarmente importante per i recettori β2 e β3-AR, suggerendo un loro predominante ruolo

e confermando, in parte per il β2-AR, i dati di letteratura. Un aspetto che sicuramente rimane da

investigare è se stimoli più appropriati e fisiologici per i PMN quali ad es IL-8 e TNF-α (che sono i

tipici stimoli che in vivo attivano queste cellule) siano in grado di up-regolare l’espressione di

questi recettori. Un effetto di questo tipo sarebbe sicuramente di estremo interesse perché

porterebbe ad ipotizzare che in specifiche condizioni quali l’infiammazione, la risposta adrenergica

può essere attivata e quindi tale via può assumere una rilevanza funzionale differente.

Nella seconda parte di questo lavoro siamo andati ad investigare l’effetto dell’adrenalina su alcune

funzioni importanti dei PMN. In particolare, siamo andati a valutare la capacità di queste cellule di

produrre citochine pro-infiammatori, rappresentata principalmente dal’IL-8 che è uno dei principali

mediatori dei PMN e la β2-integrina che è la molecola di adesione responsabile del richiamo dei

PMN a livello di sede di infiammazione. I dati ottenuti mostrano come l’adrenalina sia in grado di

incrementare da 3 a 7 volte l’espressione genica sia dell’IL-8 che della b2-integrina, dopo solo 1 h di

trattamento dei PMN e a delle concentrazioni nell’ordine delle nM, che come noto corrispondono

alle concentrazioni fisiologiche di adrenalina circolante. Questo dato a nostro parere, di notevole

interesse perché porta ad ipotizzare che il tono adrenergico è funzionalmente importante in queste

cellule e che pertanto alterazioni del sistema simpatico possano portare di conseguenza anche ad

68

alterazione della funzione di queste cellule. Inoltre è ben noto che i diversi sottotipi di recettori beta

e alfa ad es svolgono ruoli differenti nella modulazione del tono vascolare e sulla funzione cellulare

in generale.

Dati preliminari condotti su un’altra funzione importante dei PMN, rappresentata dalla loro capacità

di produrre ROS, mostrano che l’adrenalina non è in grado in condizioni basali di modificare la loro

produzione basale di specie reattive dell’ossigeno e rimane però da investigare se la produzione che

viene esacerbata durante uno stimolo infiammatorio è da essa modulata.

La modulazione dell’espressione dei recettori α e β-adrenergici nei neutrofili attivati e gli effetti

dell'adrenalina su alcune funzioni di queste cellule suggeriscono quindi, come detto, un ruolo

cruciale per le vie adrenergiche. Naturalmente, queste osservazione meritano nel futuro studi mirati

per l'indagine ulteriore dell’effetto dell’adrenalina sulla modulazione delle funzioni dei PMN.

Inoltre, sarà necessario investigare quale sottotipo recettoriale specifico è coinvolto nella

modulazioni di queste funzioni, soprattutto in considerazione dei dati relativi ad una diversa

regolazione dell’espressione dei diversi recettori. A tal proposito, saranno necessari e indispensabili

esperimenti con antagonisti specifici dei diversi recettori al fine di chiarire meglio la relazione tra

sistema neuro-immunitario e quello stressogeno, in particolare è poco noto il ruolo esercitato dalla

componente simpato-adrenergica nella patogenesi dell’infiammazione cronica e nell’ATH. Questo

rappresenta un importante anello mancante nella conoscenza, che potrebbe suggerire un nuovo ed

innovativo approccio di ricerca mirato a chiarire i meccanismi molecolari e cellulari implicati sia

nella disfunzione cellulare precoce che nella formazione della placca oltre che nella

destabilizzazione della placca associata con la presenza di sintomi clinici. La conclusione di questo

studio a nostro parere, potrà dare informazioni più esaustive sul ruolo esercitato dai mediatori dello

stress del sistema simpatico nell’influenzare la risposta funzionale dei PMN e quindi nel favorire o

inibire la progressione della formazione della placca.

Nel primo studio di cui mi sono occupata durante il mio dottorato, condotto su pazienti sottoposti ad

intervento di rivascolarizzazione periferica per stenosi dell’arteria femorale (allegato 4, 29),

abbiamo osservato una funzionalità alterata dei PMN circolanti rispetto alle cellule di soggetti sani.

In particolare, i pazienti presentavano una ridotta produzione di IL-8 in basale e anche una ridotta

responsività allo stimolo (fMLP) sia rispetto ai soggetti ad alto rischio cardiovascolare che rispetto

ai soggetti sani. Sulla base di questi dati ci siamo chiesti cosa succedesse nei PMN di questi pazienti

e se l’alterata funzionalità dei PMN potesse essere spiegata solo sulla base della politerapia alla

quale tali pazienti sono sottoposti oppure che lo stato avanzato della patologia non sia anche la

causa di una funzionalità differente di queste cellule da ricondursi a meccanismi di natura diversa,

in cui sicuramente la terapia può avere un ruolo, ma non necessariamente debba essere l’unico. Che

69

i trattamenti farmacologici possano influenzare la risposta funzionale di queste cellule è

ampiamente dimostrato sia dal nostro gruppo che da altri (come discusso in diverse sezioni di

questo lavoro). Abbiamo quindi deciso che per dare una risposta esaustiva a questi quesiti fosse

necessario poter indagare la funzione di queste cellule nel tessuto in cui possono svolgere il loro

ruolo cioè nella placca dove di recente è stato dimostrata la loro presenza, sebbene ancora non siano

presenti in letteratura dati sulla eventuale diversa funzione in questo tessuto. Abbiamo, quindi,

messa a punto una metodica innovativa che permette di isolare i PMN da placca carotidea, che ci ha

dato la possibilità di confermare l’esistenza di queste cellule nelle placche carotidee umane e per la

prima volta è stato possibile eseguire valutazioni di saggi funzionali su queste cellule. I primi

esperimenti condotti sulla placca carotidea ottenuta da pazienti sottoposti ad intervento di

rivascolarizzazione periferica, mostrano ad una prima analisi, che questi pPMN risultano essere

postivi per i marker tipici quali elastasi e IL-8 tipicamente misurati nei PMN circolanti. In questo

caso la comparazione tra cellule circolanti e residenti mostra anche che i pPMN risultano avere

un’espressione genica più bassa dell’IL-8 rispetto ai cPMN ottenuti dal sangue venoso periferico,

dato ancora più interessante è che tale espressione è anche inferiore a quella misurata nei cPMN di

controlli sani. Anche per quanto riguarda l’espressione dell’elastasi si osservano differenze tra

controlli sani e pazienti ma non nei pazienti tra cPMN e pPMN. Questi primi dati, che andranno

approfonditi con altre valutazioni funzionali e di fenotipo offrono nuove opportunità da un punto di

vista di studio permettendo non solo di isolarle ma di mantenerle vitali al fine di valutazioni di

risposta funzionale a sostanze di interesse terapeutico. Inoltre dati circa l’espressione dei PMN

(CD66b) nella placca mostrano non solo la loro presenza ma soprattutto una loro diversa

distribuzione rispetto alle restanti cellule dell’infiltrato infiammatorio. Infatti, mentre l’infiltrato

infiammatorio presenta una distribuzione ben più omogenea, la marcatura con il CD66b risulta

essere principalmente localizzata nella parte interna dell’intima verso la placca e con una

localizzazione prossima a quelli che sembrerebbero essere dei neovasi. Quest’ultima osservazione

ovviamente riveste un ruolo di estrema importanza in considerazione del fatto che ancora ben poco

si sa sul fenomeno che porta alla neovascolarizzazione nella placca e quindi sulle possibili strategie

terapeutiche per contrastarla al fine di ridurre gli accidenti cardiovascolari in soggetti con stenosi

carotidea. Infatti ad oggi non ci sono ancora indicazioni sugli stimoli che potrebbero alla

formazione di questi neovasi e quindi su quali potrebbero essere i possibili approcci atti a ridurla.

Un aiuto e forse uno spunto può venire dai recenti dati di letteratura che almeno nei tumori

mostrano un ruolo rilevante dei PMN nella neoangiogenesi.

70


Sulla base di quanto già detto precedentemente, sono necessari ulteriori esperimenti e nuovi

approcci sperimentali per chiarire il ruolo di PMN nella malattia aterosclerotica e il coinvolgimento

del sistema simpato-adrenergico nella patogenesi dell’infiammazione cronica e nell’ATH

In questi due anni del mio post-dottorato, il mio primo scopo sarà quello di completare e

confermare questi primi dati ottenuti al fine di chiarire l’influenza esercitata dai mediatori dello

stress (prima l’adrenalina e successivamente la noradrenalina) del sistema simpatico

nell’influenzare la risposta funzionale dei PMN in questa patologia in particolare.

A tal fine, il mio primo obiettivo sarà:

- confermare i dati relativi all’espressione e alla modulazione dei recettori adrenergici, utilizzando,

oltre all’fMLP, anche degli stimoli fisiologici dei PMN implicati nella patologia aterosclerotica,

quali per esempio l’IL-8, l’IL1β e il TNF-α (47);

- dosare i livelli di catecolamine nei PMN anche in risposta a stimoli specifici;

- chiarire gli effetti dell’adrenalina sulle funzioni dei PMN, cercando anche di capire quali sono i

meccanismi molecolari alla base di questa modulazione;

- utilizzare antagonisti dei recettori per chiarire quali di questi recettori è responsabile della

modulazione delle funzioni dei PMN;

- chiarire l’effetto dell’adrenalina sulla produzione di ROS; quindi per esempio investigare la

capacità dell’adrenalina di modulare la produzione di ROS nei PMN attivati;

- valutare l’effetto dell’adrenalina sull’adesione dei PMN all’endotelio, utilizzando come modello

le HUVEC (cellule endoteliali venose di cordone ombelicale umano) che rappresentano un valido

modello in vitro per lo studio della funzione endoteliale.

Una volta chiariti tutti questi punti di primaria importanza, lo studio proseguirà, durante il mio post-

dottorato, sulla valutazione in vitro ed in ex vivo degli effetti dello stress sulla progressione della

patologia cardiovascolare. In particolare, una prima parte dello studio sarà organizzata in due fasi ed

avrà lo scopo di valutare in due gruppi di soggetti: soggetti sani e soggetti ipercolesterolemici: 1) gli

effetti in vitro della stimolazione con agenti stressogeni (noradrenalina-NA e A) sulla funzione dei

PMN e 2) in un modello ex vivo per studiare gli effetti dello stress (in un modello ex vivo di stress

mentale) sulla funzione dei PMN. La seconda parte si pone come obiettivo la caratterizzazione delle

differenze tra la funzione dei PMN e la risposta della “stimolazione in vitro” con agenti stressogeni

in cellule ottenute da sangue venoso periferico e dalla placca carotidea di pazienti che presentano o

no anamnesi di sintomi neurologici legati alla placca e sottoposti ad intervento di

rivascolarizzazione periferica.

71

In particolare, ci focalizzeremo sui seguenti punti:

- valutare i livelli di espressione dei recettori adrenergici (NA e A) nei PMN di pazienti

ipercolesterolemici e soggetti sani e pazienti con manifestazione cliniche della patologia

(sintomatici vs asintomatici);

- ottenere informazioni sulla modulazione da parte di stimoli stressogeni sulla risposta funzionale

dei PMN nelle diverse condizioni cliniche;

- individuare se le diverse condizioni cliniche possono influenzare la capacità dei PMN di aderire

all’endotelio e se tale processo può essere influenzato dagli agenti adrenergici;

La possibilità di studiare il ruolo funzionale degli stimoli stressogeni nelle diverse condizioni

cliniche così come quella di utilizzare cellule di soggetti sani e pazienti, potrebbe contribuire alla

comprensione di potenziali differenze nell’attivazione cellulare durante lo stress in relazione con le

diverse fasi dell’ATH. L’approccio che combina il modello in vitro ed ex vivo, con i dati clinici

(soggetti sani e soggetti ipercolesterolemici), con campioni di tessuto ottenuti da pazienti sottoposti

a TEA carotidea, a nostro avviso, offre la possibilità di investigare i cambiamenti fisio-patologici

indotti dalla stimolazione e di indagare a che livelli molecolari gli stimoli stressogeni giocano il loro

ruolo.

Infine, questa seconda parte dello studio è stato oggetto di una richiesta di finanziamento al

ministero della salute (RICERCA FINALIZZATA Bando Progetti di Ricerca Giovani Ricercatori –

Ricerca Finalizzata 2010) per il quale siamo in attesa di una risposta.

.


TH α1B-AR α1D-AR Α2B-AR Α2C-AR VMAT-1 VMAT-2

CTRL 2.8±1.2x10-8 3.3±2.6x10-9 9.5±1.7x10-9 UND. UND. UND. UND.

fMLP 3.2±1.2x10-8 2.8±9.8x10-11 1.6±5.1x10-9 UND. UND. UND. UND.

Tabella 1. Valutazione dell’espressione genica della TH, dei trasportatori delle catecolammine, VMAT1 e -2 e dei recettori α1B, α1D, α2B, α2C mediante Real Time PCR. La tabella mostra i valori di espressione dopo trattamento delle cellule con fMLP (0,1 µM). I dati sono espressi come media±SD. n=2-6.

ROS (D 60 min)

A (μM)

CTRL fMLP 0.01 0,1 1

106.7±26.4 422.3±188.7 132.7±58.6 108.0±16.1 95.4±18.4

Tabella 2. Valutazione della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Effetto dell’adrenalina (0.01 – 1 µM) sulla produzione di ROS da parte dei PMN in confronto ad un controllo positivo rappresentato dalla stimolazione con fMLP (0.1 µM). I dati sono espressi come media±SD. n=3. #=P<0.05 vs fMLP.

PMN fMLP0

1.0×10 -7

2.0×10 -7

3.0×10 -7

4.0×10 -7

5.0×10 -7

*

AR

-αα αα1

A

mR

NA

ex

press

ion

(2

-∆∆ ∆∆ct )

PMN fMLP0

1

2

3

AR

- αα αα1

A

mR

NA

ex

press

ion

(2

-∆∆ ∆∆ct )

% C

TR

L


Figura 1. Valutazione dell’espressione genica del recettore adrenergico α1A. Effetto della stimolazione dei PMN con fMLP (0,1 µM, 3 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media±SD. n=5. *=P<0,05 vs CTRL.

A B

PMN fMLP0

1.0×10 -7

2.0×10 -7

3.0×10 -7

4.0×10 -7

5.0×10 -7

*

AR

- αα αα2

A

mR

NA

ex

press

ion

(2

-∆∆ ∆∆ct )

PMN fMLP0

2

4

6

8

10

AR

- αα αα2

A

mR

NA

ex

pre

ssio

n (

2- ∆∆ ∆∆

ct )

% C

TR

L

*

Figura 2. Valutazione dell’espressione genica del recettore adrenergico α2A. Effetto della stimolazione dei PMN con fMLP (0,1 µM, 3 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media±SD. n=5.

A B

PMN fMLP0

5.0×10 -8

1.0×10 -7

1.5×10 -7

*

AR

- ββ ββ1

mR

NA

ex

press

ion

(2

-∆∆ ∆∆ct )

PMN fMLP0

1

2

3

4

5

*

AR

-ββ ββ1

mR

NA

ex

press

ion

(2

-∆∆ ∆∆ct )

(% C

TR

L)

Figura 3. Valutazione dell’espressione genica del recettore adrenergico β1. Effetto della stimolazione dei PMN con fMLP (0,1 µM, 3 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media±SD. n=5. *=P<0,05 vs CTRL.

A B

PMN fMLP0

5.0×10 -6

1.0×10 -5

1.5×10 -5

AR

- ββ ββ2

mR

NA

exp

ress

ion

(2

- ∆∆ ∆∆ct )

PMN fMLP0

2

4

6

8

AR

- ββ ββ2

mR

NA

ex

press

ion

(2

-∆∆ ∆∆ct )

(% C

TR

L)

Figura 4. Valutazione dell’espressione genica del recettore adrenergico β2. Effetto della stimolazione dei PMN con fMLP (0,1 µM, 3 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media±SD. n=5.

A B

PMN fMLP0

1.0×10 -4

2.0×10 -4

3.0×10 -4

4.0×10 -4

**

AR

- ββ ββ3

mR

NA

ex

press

ion

(2

-∆∆ ∆∆ct )

PMN fMLP0

5

10

15

20

*

AR

-ββ ββ3

mR

NA

ex

press

ion

(2

-∆∆ ∆∆ct )

(%C

TR

L)

Figura 5. Valutazione dell’espressione genica del recettore adrenergico β3. Effetto della stimolazione dei PMN con fMLP (0,1 µM, 3 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media±SD. n=6. *=P<0,05 vs CTRL; **=P<0,005 vs CTRL.

A B

79

0

1.0×10 -5

2.0×10 -5

3.0×10 -5

4.0×10 -5

5.0×10 -5

6.0×10 -5

1h 3h

**

*

**

***

**

*

*

*

IL-8

mR

NA

(2

-∆∆ ∆∆C

t )

+ - - - - - - - + - - - - - - - 0 - + - - - - - - - + - - - - - - 0.1 pM - - + - - - - - - - + - - - - - 1 pM

- - - + - - - - - - - + - - - - 0.1 nM - - - - + - - - - - - - + - - - 1 nM

- - - - - + - - - - - - - + - - 0.01 µµµµM

- - - - - - + - - - - - - - + - 0.1 µµµµM

- - - - - - - + - - - - - - - + 1µµµµM

Figura 6. Valutazione dell’espressione genica per IL-8. Effetto della stimolazione dei PMN con concentrazioni

crescenti di A (0.1 pM – 1 µM; 1- 3 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media±SD. N=5-2. *=P<0,05 vs CTRL; **=P<0,005 vs CTRL.

A

80

0

1

2

5

10

15

20

* ****

*

*

* **

*

*

1h 3h

+ - - - - - - - + - - - - - - - 0 - + - - - - - - - + - - - - - - 0.1 pM - - + - - - - - - - + - - - - - 1 pM

- - - + - - - - - - - + - - - - 0.1 nM - - - - + - - - - - - - + - - - 1 nM

- - - - - + - - - - - - - + - - 0.01 µµµµM

- - - - - - + - - - - - - - + - 0.1 µµµµM

- - - - - - - + - - - - - - - + 1µµµµM

IL-8

mR

NA

(2

-∆∆ ∆∆C

t )

(% C

TR

L)

B

81

0

2.0×10 -6

4.0×10 -6

6.0×10 -6

8.0×10 -6

1.0×10 -5

1.2×10 -5

2.1×10 -5

2.4×10 -5

**

* *

**

*

*

*

ββ ββ2 i

nte

gri

na

mR

NA

(2

-∆∆ ∆∆C

t )

1h 3h

+ - - - - - - - + - - - - - - - 0 - + - - - - - - - + - - - - - - 0.1 pM - - + - - - - - - - + - - - - - 1 pM

- - - + - - - - - - - + - - - - 0.1 nM - - - - + - - - - - - - + - - - 1 nM

- - - - - + - - - - - - - + - - 0.01 µµµµM

- - - - - - + - - - - - - - + - 0.1 µµµµM

- - - - - - - + - - - - - - - + 1µµµµM

Figura 7. Valutazione dell’espressione genica della β2-integrina. Effetto della stimolazione dei PMN con

concentrazioni crescenti di A (0.1 pM – 1 µM; 1- 3 h). Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di Real Time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media±SD. n=6-2. *=P<0,05 vs CTRL; **=P<0,005 vs CTRL.

A

82

0

4

8

12

16

20

1h 3h

+ - - - - - - - + - - - - - - - 0 - + - - - - - - - + - - - - - - 0.1 pM - - + - - - - - - - + - - - - - 1 pM

- - - + - - - - - - - + - - - - 0.1 nM - - - - + - - - - - - - + - - - 1 nM

- - - - - + - - - - - - - + - - 0.01 µµµµM

- - - - - - + - - - - - - - + - 0.1 µµµµM

- - - - - - - + - - - - - - - + 1µµµµM

ββ ββ2 i

nte

gri

na

mR

NA

(2

-∆∆ ∆∆C

t )

(% C

TR

L)

****

*

*

*

*

*

B

0

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

Soft Fibrolipidiche

Hard

Nu

mero

cell

ule

Figura 8. Valutazione del numero di cellule ottenute dopo

disgregazione della placca carotidea. Numero di cellule totali ottenute dalla lesione aterosclerotica dopo disgregazione meccanica: placche soft (colonna grigio chiaro) vs placche hard o miste (colonna grigio scuro) vs

placche hard (colonna nera)..

0

2.0×10 -6

4.0×10 -6

6.0×10 -6

8.0×10 -6

1.0×10 -5

1.0×10 -3

2.0×10 -3

3.0×10 -3

cPMN cPMN pPMN

CTRL sani

PZ

*#IL

-8 m

RN

A (2

- ∆∆ ∆∆C

t )

0

1.0×10 -8

2.0×10 -8

3.0×10 -8

4.0×10 -8

5.0×10 -8

5.0×10 -4

1.0×10 -3

1.5×10 -3

2.0×10 -3

2.5×10 -3

cPMN cPMN pPMN

CTRL sani

PZ

**#

*

Ela

sta

si m

RN

A

(2-∆∆ ∆∆

Ct )

Figura 9. Valutazione dell’espressione genica per IL-8 ed elastasi. I cPMN (PMN circolanti) di controlli sani e i cPMN e i pPMN (PMN da placca) di pazienti sottoposti a TEA sono separati ed analizzati mediante Real Time PCR per la valutazione di livelli di mRNA per IL-8 (pannello A) ed elastasi (pannello B). I dati sono espressi come media±SD. n=13-5. *=P<0,05 vs cPMN CTRL sani; **=P<0,005 vs cPMN CTRL sani; #= P<0,005 vs pPMN.

A B

Figura 10. Valutazione della presenza dei PMN nella placca carotidea. La placca carotidea ottenuta dopo TEA è stata appositamente trattata e marcata con anticorpi anti-CD66b (rosso), per l’individuazione dei PMN, e con ematossilina (blu) per la marcatura dei nuclei dell’infiltrato infiammatorio. Pannello A: panoramica. Pannello B: ingrandimento.

A

B


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88

ALLEGATO 4

ANGIOTENSIN TYPE 1 RECEPTOR EXPRESSION AND

INTERLEUKIN-8 PRODUCTION IN POLYMORPHONUCLEAR

LEUKOCYTES OF PATIENTS WITH PERIPHERAL ARTERIAL

DISEASE

89

CAPITOLO 4

EFFETTO DELL’ANGIOTENSINA II SULLA RISPOSTA

FUNZIONALE DEI LINFOCITI T REGOLATORI: STUDIO IN

VITRO

90

4.1 INTRODUZIONE

L'aterosclerosi è sempre più riconosciuta come un processo infiammatorio cronico della parete

arteriosa, in cui i linfociti T attivati svolgono un ruolo chiave e tra le classi principali di cellule T

implicate nella lesione aterosclerotica i linfociti T CD4+ sono le cellule maggiormente

rappresentate, come suggerito dalla loro presenza costante durante tutto lo sviluppo della placca

aterosclerotica (1). I linfociti T CD4+ si differenziano in Th1 e Th2. I linfociti Th1 sono quelli

maggiormente presenti nel sito di infiammazione e sono responsabili dell’immunità cellulo-mediata

secernendo alti livelli di interferone (IFN)-γ, citochina proinfiammatoria. Le cellule TH2 sono

raramente rilevate nella sede di infiammazione; esse secernono citochine antiinfiammatorie come

IL-4, IL-5, IL-10, IL-13. I linfociti Th1 sono considerati come principali regolatori dell’aterogenesi

e il controllo locale a favore dei Th1 vs risposte Th2 è un fattore critico per lo sviluppo della

malattia (2). Inoltre, la differenziazione delle cellule CD4+ nel fenotipo Th1 o Th2 è regolata da

specifiche citochine (3) e una possibile modulazione di questa differenziazione può essere di

potenziale interesse terapeutico per la stabilizzazione o la regressione della placca. La

differenziazione preferenziale delle cellule T CD4 naive in cellule effettrici Th1 in seguito alla

stimolazione antigenica delle cellule contribuisce allo sviluppo dell’aterosclerosi e la possibilità di

contrastare la differenziazione Th1 e Th2 potrebbe quindi rappresentare una strategia terapeutica

mirata (4).

Una sottopopolazione di linfociti T CD4+, di recente identificazione, è costituita dai linfociti T

regolatori (nTreg) che sono cellule specializzate che svolgono un ruolo chiave nella soppressione

delle risposte immunitarie giocando così un ruolo centrale per la repressione della risposta

immunitaria di tipo Th1 (5). Le Treg sono caratterizzate dall’espressione in membrana di alti livelli

della catena α del recettore per IL-2 (CD25) e dal fattore di trascrizione Forkhead box P3 (FoxP3).

Il ruolo chiave delle Treg nell’aterosclerosi è oggetto di numerosi studi (6), in particolare è stato

esaminato il ruolo dei principali prodotti di queste cellule nella progressione della malattia

rappresentati delle due citochine IL-10 e TGF-β (7).

Le citochine pleiotropiche, TGF-β e IL-10, prodotte dalle cellule Treg, giocano un ruolo critico

nella soppressione della risposta immune. Sia le Treg che le Teff producono IL-10 e TGF-β ma la

produzione di entrambe le citochine è più alta nelle Treg (8). In particolare, sono stati osservati e

studiati diversi meccanismi tramite i quali il TGF-β è coinvolto nella modulazione delle diverse

cellule del sistema immune portando alla soppressione della risposta infiammatoria: sopprime la

differenziazione delle cellule Teff, converte le cellule T näive in cellule Treg inducendo

l’espressione del FoxP, inibisce la proliferazione delle cellule T e B modulandone l’espressione dei

regolatori del ciclo cellulare (incrementa l’espressione degli inibitori ciclina chinasi dipendente e

91

diminuisce l’espressione dei promotori del ciclo cellulare), inibisce la produzione di citochine

effettrici come IL-2, IL-4, IFN-γ, modula lo sviluppo e la funzione di diverse cellule immunitarie

come macrofagi, cellule dendritiche e cellule NK (natural killer) (9).

Ulteriori informazioni sulla rilevanza di questo specifico sottogruppo di cellule nell’aterosclerosi è

stato ulteriormente supportato da prove preliminari in modelli animali che indicano che l'interazione

funzionale tra Treg CD4+ e linfociti T effettori può essere critica nel controllo dello sviluppo della

placca aterosclerotica (10;11); inoltre, in pazienti con malattia coronarica è stato recentemente

riportato che la destabilizzazione della placca è stata associata ad una riduzione del numero delle

Treg e all'espansione delle cellule Th1 (12).

Nonostante le Treg esprimano diversi marcatori, sia a livello intracellulare che di superficie,

nessuno di questi, allo stato attuale, risulta essere associato in maniera univoca alle Treg poiché essi

vengono espressi anche dalle Teff in seguito ad attivazione. Esiste però un ulteriore marcatore di

superficie che consente una più accurata distinzione delle Treg dalle altre cellule T ed è

rappresentato dalla catena α del recettore per IL-7 (CD127): il fenotipo CD25+CD127low mostra in

vitro attività soppressiva, alti livelli di FoxP3 e CTLA4, è ipoproliferativo e poco responsivo alla

stimolazione del TCR, mentre quello CD25+CD127high non mostra alcuna attività soppressiva (13).

Il meccanismo molecolare attraverso il quale le Treg esercitano la loro azione di inibizione della

proliferazione delle cellule Teff è stato studiato in vitro e sembra avvenire tramite meccanismi

multipli, non completamente noti, che coinvolgono il contatto diretto cellule-cellula e la secrezione

di citochine inibitorie (13).

4.1.1 IL SISTEMA RAS

L’angiotensina II (Ang II) è un peptide proinfiammatorio che è fondamentale nella

modulazione della risposta immuno-mediata e dei processi che portano alla aterosclerosi e alle

manifestazioni cliniche tipiche di questa patologia (14;15). L‘Ang II esercita i propri effetti tramite

l’interazione con specifici recettori: ne sono stati individuati 4 (AT1-4R) di cui due sono ancora poco

conosciuti. Gli effetti proaterogenici dell’Ang II, sono esercitati attraverso l'attivazione del

recettore di tipo 1 recettori (AT1R) (16) e la via di attivazione dell’ AT1R rappresenta un importante

target per interferire con i processi aterosclerotici e ridurre il rischio cardiovascolare (17). Uno

studio condotto nel nostro laboratorio mediante l'utilizzo di tecniche citofluorimetriche su cellule

ottenute da sangue periferico di soggetti sani, ha confermato l’espressione del recettore di tipo 1 su

popolazioni linfocitarie, con un’espressione che è peculiare per ogni tipo di popolazione (18).

92

Risultati recenti ottenuti da studi clinici e sperimentali hanno migliorato le nostre conoscenze

sull’azione del sistema renina angiotensina (RAS), rivelando una nuova dimensione a questo

sistema al di là del regolatore di emodinamica.

Anche se classicamente il sistema RAS è stato considerato come un sistema endocrino con il

compito di regolare l’ipotensione acuta attraverso cambiamenti delle resistenze vascolari periferiche

e il mantenimento dell’omeostasi elettrolitica (19;20), il sistema RAS è ormai riconosciuto come

importante nel controllo a lungo termine della pressione arteriosa (21), della progressione della

nefropatia diabetica (22), e lo sviluppo di cardiomiopatia ipertensiva (23) e, più recentemente, come

un fattore modulante nel controllo dello sviluppo (o progressione) di aterosclerosi (24;25).

Il sistema RAS è classicamente considerato come una cascata enzimatica proteica, che attraverso la

generazione di prodotti intermedi di natura peptidica conduce infine alla produzione di Ang II, un

piccolo octapeptide. L’Ang II svolge una duplice e diversificata funzione in tutto il sistema

cardiovascolare, tra cui l'induzione di vasocostrizione, della produzione di aldosterone,

dell’ipertrofia cardiaca, della proliferazione delle cellule muscolari lisce (VSMC), e la produzione

di ROS (23;26).

In condizioni fisiologiche, le funzioni biologiche dell’Ang II sono particolarmente importanti per

l'omeostasi del sistema cardiovascolare, la pressione sanguigna, la pressione di perfusione di una

serie di organi, nonché per i meccanismi di crescita cellulare e la replicazione (27). Nella patogenesi

dell’ATH, una maggiore attività dell’Ang II può agire a vari livelli, come la modificazione del

metabolismo lipidico, la disfunzione endoteliale, e l'instabilità della placca; e gli effetti pro-ATH

dipendono principalmente all'attivazione dell’AT1R.

È stato recentemente dimostrato che gli antagonisti dell’AT1R possono ridurre la formazione della

placca ateromasica in diversi modelli animali di aterosclerosi (28;29) e che Ang II aumenta

l'adesione dei leucociti all'endotelio in vitro (23). Inoltre, l’Ang II stimola la generazione di ROS

nelle cellule muscolari lisce attraverso l'attivazione di NADH / NADPH ossidasi (30;31) e potrebbe

essere anche implicata nella produzione di ROS nelle cellule endoteliali.

L’Ang II influenza ampiamente la funzione dei linfociti, ad esempio, inducendo la produzione di

IL-1 β, la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), aumentando l’espressione di molecole

di adesione, chemochine, citochine, metalloproteinasi della matrice (MMP), tuttavia non esistono

informazioni per quanto riguardo i possibili effetti, ma al momento solo pochi dati sono disponibili

sulla capacità di Ang II a influenzare la risposta funzionale di specifiche sottopopolazioni

linfocitarie come CD4+ e non esistono dati sulla capacità di Ang II di modulare la funzione Treg.

93

4.2 SCOPO

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’effetto dell’Ang II sui linfociti CD4+ e nello

specifico l’azione di questo peptide sulla funzionalità di una sottopopolazione di linfociti CD4+

rappresentata dai linfociti T CD4+CD25+ o linfociti T regolatori. A tal fine, è stata investigata

l’espressione sia di membrana che genica del recettore di tipo 1 per l’Ang II (AT1R), responsabile

degli effetti proinfiammatori, a partire dalle CD4+ fino ad arrivare sottopopolazioni linfocitarie

CD4+CD25+ (Treg) e CD4+CD25- (Teff) purificate mediante sorting immunognetico. La fase

successiva del lavoro è stata quella di valutare l’effetto dell’angiotensina II sulla funzionalità delle

CD4+, misurata come capacità dell’Ang II di modulare la proliferazione delle cellule indotta da uno

stimolo mitogenico e la produzione di citochine Th1/Th2. L’ultima parte dello studio è stato

condotto allo scopo di valutare l’effetto del peptide sulla funzionalità delle Treg: misurata sia come

capacità di produrre le citochine TGF-β e IL-10, responsabili dell’attività soppressoria delle cellule

(anche in presenza di antagonisti selettivi) sia valutando direttamente la capacità inibitoria delle

Treg mediante l’utilizzo di un modellino in vitro di cocoltura delle Teff e delle Treg in presenza

dello stimolo mitogenico. Per la valutazione di quest’ultimo effetto, in quest’ultimo anno, mi sono

occupata di mettere a punto una metodica citofluorimetrica di valutazione della risposta

proliferativa delle Teff, e quindi della capacità delle Treg di inibirla.

94


4.3.1 Separazione delle PBMC da Buffy Coat

Le PBMC sono state separate a partire da sangue venoso periferico di donatori sani proveniente

dal centro trasfusionale dell’Ospedale di Circolo di Varese mediante centrifugazione su gradiente di

Ficoll (Ficoll-Paque Plus, Amersham) utilizzando le metodiche standard.

4.3.2 Sorting immunomagnetico delle sottopopolazioni linfocitarie

Le PBMC sono utilizzate sia per la separazione immunomagnetica delle CD4+, mediante

l’utilizzo del kit Dynal CD4 Positive Isolation (Dynal, Oslo, Norvegia) che per la separazione dei

linfociti T regolatori (CD4+CD25+) e T effettori (CD4+CD25-) mediante l’utilizzo del kit

CD4+CD25

+ Regulatory T cell isolation kit (MACS, Miltenyi Biotec), seguendo le istruzioni fornite

dai rispettivi prodotti.

4.3.3 Valutazione della purezza delle Treg e delle Teff

4.3.3.1 Analisi dell’espressione genica di FoxP3 in Real-Time PCR per la valutazione

della purezza

Il fattore di trascrizione Forkhead box P3 (FoxP3), considerato il principale regolatore

responsabile dello sviluppo e della funzione dei linfociti T regolatori, è poco espresso nelle Teff

mentre è molto espresso nelle Treg, per questo viene utilizzato come marcatore cellulare distintivo

di quest’ultima sottopopolazione linfocitaria. L’analisi è stata effettuata per valutare la bontà della

separazione cellulare effettuata mediante sorting immunomagnetico; come si può osservare in

Figura 1, l’espressione dell’mRNA per FoxP3 è, come ci aspettavamo, significativamente maggiore

nelle Treg rispetto Teff (Figura 1).

95

Tef

f

Tre

g

0

1.0×10-6

2.0×10-6

2.0×10-4

3.0×10-4

4.0×10-4

5.0×10-4

6.0×10-4

7.0×10-4

**F

oxP

3 m

RN

A (

2- ∆∆ ∆∆

Ct )

4.3.3.2 Analisi citofluorimetrica per la valutazione della purezza delle Treg

Durante quest’anno di dottorato mi sono focalizzata sulla valutazione della purezza delle

Treg mediante analisi citofluorimetrica a tre colori al fine di meglio caratterizzare e in modo più

specifico possibile questa popolazione cellulare.

Il metodo si basa su un test di immunofluorescenza diretta a 3 colori in cui viene effettua una

marcatura diretta dei recettori di membrana CD4 (anti human CD4APC-Cy7), CD25 (anti human

CD25PE-Cy7) e CD127 (anti human CD127Alexa647), i quali sono diversamente espressi nelle

due sottopopolazioni cellulari di nostro interesse: le Treg sono caratterizzate dall’espressione in

membrana del CD4, di alti livelli di CD25 e bassi livelli di CD127 (CD4+CD25+hiCD127lo); le Teff

esprimono il CD25 a bassi livelli ed il CD127 ad alti livelli (CD4+CD25-CD127hi). Questa metodica

viene quindi utilizzata per verificare che i campioni cellulari ottenuti mediante sorting

Figura 1. Valutazione dell’espressione genica del FoxP3

nelle Teff e delle Treg isolate mediante sorting immunomagnetico Le Teff e le Treg appena purificate sono analizzate per la valutazione del FoxP3 mediante Real Time PCR per la valutazione della purezza delle due sottopopolazioni. I dati sono espressi come media ± SD di n = 10. ** P < 0,01 vs Teff.

96

CD25

+hiCD

127l

o

CD

25+C

D12

7+

CD

25-C

D12

7+

0

20

40

60

80 **

% c

ell

ule

po

siti

ve

lo

CD

127

+hi

CD

25

+

CD

127

+

CD

25

+

CD

127

-

CD

25

0

20

40

60 **

% c

ellu

le p

osit

ive

immunomagnetico siano effettivamente costituiti da Treg e da Teff. I campioni dopo la marcatura

sono stati analizzati mediante anlisi citofluorimetrica.

L’analisi mostra che in entrambi i campioni cellulari purificati mediante sorting immunomagnetico,

basato sulla sola selezione del CD25, è presente una terza sottopopolazione cellulare rappresentata

dal fenotipo CD25+CD127+. I dati relativi alle Treg mostrano una presenza significativamente

maggiore del fenotipo CD25+hiCD127lo (circa l’80 %) , tipico dei linfociti T regolatori, rispetto ai

fenotipi CD25+CD127+ (circa 20%) e CD25-CD127+ (circa 1-2%) (figura 2, pannelli A e C). Per

quanto riguarda le Teff, come atteso, si può osservare un andamento opposto con una presenza

significativamente maggiore del fenotipo CD25-CD127+, tipico dei linfociti T effettori, rispetto ai

fenotipiCD25+hiCD127lo e CD25+CD127+ (figura 2, pannelli B e D).

C D

Figura 2. Valutazione della purezza delle Treg e delle Teff mediante analisi citofluorimetrica. I pannelli A e B mostrano una rappresentazione biparametrica dell’analisi della purezza delle Treg e delle Teff, rispettivamente dopo tripla marcatura con anticorpi anti-CD4 (anti human CD4APC-Cy7), anti-CD25 (anti human CD25PE-Cy7) e anti-CD127 (anti human CD127Alexa647). Pannello C: analisi relativa al fenotipo Treg (CD4+CD25hiCD127low). Pannello D: analisi relativa al fenotipo Teff (CD4+CD25-CD127hi). I dati sono espressi come media ± SD di n = 2. ** P < 0.01 vs CD25-

A B

97

4.3.4 Valutazione dell’espressione di membrana di AT1R nei linfociti Treg mediante

analisi citofluorimetrica multiparametrica

Anche in questo caso si tratta di una nuova analisi, sempre condotta durante questo anno di

dottorato. Infatti, nei lavori precedentemente condotti l’analisi di membrana dell’AT1R nel nostro

laboratorio, era condotta utilizzando una sola tripla marcatura con anticorpi diretti verso gli antigeni

di membrana CD4 e CD25 e l’anticorpo diretto verso la nostra proteina di interesse. I dati di

letteratura sempre più consistenti circa un altro marcatore specifico delle Treg (CD127) capace di

discriminare molto più facilmente tra il fenotipo delle Treg e quello delle Teff, in concomitanza

dell’acquisto di un nuovo strumento in grado di analizzare 6 fluorescenze contemporaneamente, ci

ha portati ad una valutazione dell’espressione di membrana del recettore mediante una marcatura a

cinque colori, con l’aggiunta al vecchio pannello di analisi (CD4+, CD25+ e AT1R) del CD127

(marcatore espresso dalle Teff ed assente nelle Treg) e del FoxP3.

Questa metodica si basa su un test di immunofluorescenza indiretta e diretta a 5 colori, in cui

vengono marcati 4 target proteici (3 di membrana rappresentati dal CD4 (anti-human CD4APC-

Cy7), CD25 (anti-human CD25PE-Cy7) e CD127 (anti-human CD127Alexa647) ed uno

intracellulare rappresentato dal FoxP3(anti human FoxP3-PE), oltre a quello di interesse

rappresentato dall’AT1R(anti-human AT1R-FITC), caratteristici e distintivi della popolazione

cellulare in esame.

4.3.5 Valutazione della produzione di citochine IL-4 e INF-γ mediante Kit ELISA

La produzione di citochine da parte delle CD4+ trattate con Ang II è stata valutata mediante kit

ELISA (SPACE Import-Export s.r.l, Milano, Italia) seguendo le istruzioni descritte nel kit.

4.3.6 Valutazione dell’espressione genica del FoxP3 e delle citochine IL-10 e TGF-β

mediante Real Time PCR





secondo la procedura descritta sul libretto delle istruzioni. L’analisi di real time è, infine, condotta

utilizzando lo strumento ABI prism 7000 (Applied Biosystem, California, USA). dove ha avuto

98

inizio la serie di cicli riportata in breve:un primo ciclo di 2 min a 50°C, un secondo di 10 min a

95°C e 40 cicli di 15 sec a 95°C.






4.3.7 Valutazione della proliferazione cellulare

4.3.7.1 Marcatura delle cellule con il CFSE

Nello studio in vitro, l’analisi della proliferazione cellulare è effettuata sfruttando le

caratteristiche molecolari del CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester, Sigma), colorante

cellulare che penetra liberamente attraverso le membrane e una volta all’interno della cellula viene

tagliato da esterasi cellulari rendendolo fluorescente e non più in grado di attraversare la membrana

trattenendolo quindi all’interno della cellula: ad ogni divisione cellulare si distribuisce equamente

nelle due cellule figlie, dimezzando così il proprio livello di fluorescenza (verde) consentendo il

monitoraggio del numero di divisioni cellulari. In breve, in base al numero di cellule ottenute dopo

la separazione immunomagnetica ed al numero di pozzetti da allestire, viene calcolata la quantità di

cellule necessarie e vengono quindi prelevati i volumi corrispondenti, suddividendo il campione

delle cellule prese in esame in due nuove provette: cellule (senza CFSE) e cellule* (con CFSE). I

due campioni vengono centrifugati a 300 g per 5 min ed i pellet risospesi alla concentrazione di

1x106/ml con RPMI senza siero, in quanto i costituenti del siero presenti nel terreno completo (con

FBS e antibiotico) andrebbero a legare le molecole di CFSE impedendone l’ingresso nelle cellule. Il

fluorocromo viene aggiunto alla concentrazione di 1 µM, dopo adeguata diluizione, solo alla

provetta cellule* ed entrambi i campioni di cellule vengono incubati a 37°C per 5 min protetti dalla

luce. I campioni sono successivamente sottoposti a 2 lavaggi successivi con terreno completo; i

pellet vengono infine risospesi alla concentrazione di 1x106/ml con RPMI completo e quindi si

procede alla messa in coltura.

4.3.7.2 Analisi citofluorimetrica della proliferazione

Trascorso il tempo di incubazione (5 giorni), i campioni vengono risospesi nei pozzetti,

trasferiti in corrispondenti tubi da citometria e centrifugati per 5 min a 1400 g. Il surnatante viene

99

eliminato con una pasteur di vetro ed il pellet risospeso con 300 µl di PBS. I campioni vengono

quindi passati al citofluorimetro correttamente settato. L’acquisizione è condotta utilizzando il

citometro FACSCanto II (BDB, Milano) e i dati sono analizzati utilzzando il programma

FACSDiva (versione 6.1.3) (BDB, Milano). Sono analizzati un minimo di 20.000 eventi e il

parametro analizzato è un istogramma in cui nelle ascisse è riportata la conta cellulare (o numero di

eventi analizzati) mentre nelle ordinate il valore di fluorescenza della molecola. Questa metodica è

anche utilizzata per valutare la proliferazione cellulare delle Teff e in particolar modo la capacità

soppressoria delle Treg nel modellino di cocoltura Teff/Treg (1:1) in presenza di uno stimolo

mitogenico. In particolare, ad essere marcate con il CSFE sono le Teff, in quanto si vuole misurare

la capacità soppressorie delle Treg sulla proliferazione delle Teff. Il valore preso in considerazione

per l’analisi finale è la percentuale (%) di CFSElow che rappresenta la % di cellule in proliferazione

(Figura 3).

Figura 3: Rappresentazione grafica della valutazione della capacità soppressoria delle Treg mediante analisi citofluorimetrica dopo trattamento delle Teff con CFSE. L’asse delle ordinate indica il numero di eventi analizzati, l’asse delle ascisse l’intensità di fluorescenza del CFSE. Pannello A: istogramma rappresentante il segnale emesso dalle Teff non attivate. Pannello B: istogramma rappresentante il segnale emesso dalle Teff dopo 5 giorni d’incubazione con lo stimolo mitogenico; si noti la presenza di 4 picchi corrispondenti a 4 successive divisioni cellulari. Pannello C: istogramma della riduzione dei picchi e quindi della proliferazione delle Teff in cocultura con le Treg

C

B A

100


I risultati sono stati espressi come media ± SD (Standard Deviation o Deviazione Standard) di






ANOVA).

101

4.3 RISULTATI

4.4.1 Valutazione dell’espressione genica e proteica di AT1R

Il recettore di tipo 1 per l’angiotensina (AT1R) è espresso sia a livello proteico che genico nelle

CD4+ (figura 1).

4.4.2 L’Angiotensina II non influenza la proliferazione delle CD4+ indotta da PHA

Come atteso e mostrato nella figura 2, l’incubazione delle CD4+ con PHA 10 µg/ml induce

un’importante risposta proliferativa delle cellule misurata mediante marcatura delle cellule con

CFSE e analisi citofluorimetrica. La stimolazione delle CD4+ con concentrazioni crescenti di Ang

II (0,001 – 5 µM) non induce alcun stimolo proliferativo (dato non mostrato) e non modifica la

proliferazione indotta dalla PHA.

4.4.3 L’Angiotensina II non influenza il rapporto Th1/Th2 nelle CD4+

Come ci si aspettava, la stimolazione con PHA (48 h; 10 µg/ml) delle CD4+ induce un aumento

significativo della produzione di INF-γ (basale: 11.44±10.35; PHA: 38.83±16.25), mentre non

modifica i livelli di IL-4 (cellule a riposo: 0.23±0.40; PHA: 2.92±2.48); la pre-incubazione di 1 h

delle cellule con concentrazione crescenti di Ang II (0.001-5 µM) non influenza la produzione di

entrambe le citochine indotta dalla PHA (figura 3, pannello A e B).

4.4.4 Valutazione dell’espressione genica di AT1R nelle Teff e nelle Treg

L’mRNA di AT1R è espresso sia sulle Teff che sulle Treg, ma con una maggiore espressione

sulle Treg; differenza che è anche significativa dal punto di vista statistico (figura 4).

4.4.5 Valutazione dell’espressione di membrana dell’AT1R nelle Teff e nelle Treg

L’analisi è stata effettuata sul campione delle PBMC mediante marcatura dei recettori di

membrana caratteristici dei fenotipi cellulari di interesse (CD4, CD25, CD127). I risultati ottenuti

mostrano che i fenotipi cellulari CD25+CD127lo e CD25-CD127hi presentano una analoga

percentuale di cellule che esprimono AT1R, mentre il fenotipo CD25+CD127+ presenta una

maggiore espressione di AT1R rispetto agli altri due fenotipi cellulari (figura 5, pannello A). La

102

valutazione dell’intensità media di fluorescenza (MFI) mostra una maggiore densità cellulare che

risulta significativa per il fenotipo CD25+CD127lo rispetto al fenotipo CD25-CD127hi (figura 5,

pannello B).

4.4.6 Valutazione del trattamento dell’angiotensina II sull’espressione del FoxP3 nelle

Treg e nelle Teff

Il trattamento con concentrazioni crescenti di angiotensina II (0.001 – 1 µM; 24 h) non ha alcun

effetto sull’espressione genica del FoxP3 nelle Treg e nelle Teff separate mediante sorting

immunomagnetico (tabella 1).

4.4.7 Valutazione del trattamento dell’angiotensina II e di antagonisti dei recettori AT1 e

AT2 sulla proliferazione delle Teff

Il trattamento con concentrazioni crescenti di angiotensina II (0.001 – 1 µM) non modifica la

risposta proliferativa delle Teff indotta da PHA (10 µg/ml) misurata mediante analisi

citofluorimetrica dopo marcatura delle cellule con CFSE (tabella 2). Inoltre, il pre-trattamento di 1 h

delle Teff con antagonisti dei recettori dell’angiotensina II, candesartan (10 µM) e PD123319 (10

µM), rispettivamente antagonista del recettore di tipo 1 e 2, non hanno alcun effetto sulla

proliferazione delle cellule indotta da PHA (tabella 3).

4.4.8 Valutazione dell’espressione genica del TGF-β nelle Treg e nelle Teff

L’analisi è stata eseguita su entrambe le sottopopolazioni linfocitarie, purificate mediante

sorting immunomagnetico, dopo incubazione di 24 h con concentrazioni crescenti di Ang II (0.001

– 1 µM). I risultati ottenuti non mostrano alcune effetto del peptide sui livelli di mRNA del TGF-β

nelle Teff (tabella 4), mentre si può osservare un aumento statisticamente significato

dell’espressione genica nelle Treg di circa 2 volte in presenza delle concentrazioni di 0.001 e di

0.01 µM di Ang II (figura 6, pannelli A e B).

Il pre-trattamento di 1 h delle Treg con candesartan (10 µM) antagonista dell’AT1R, prima di

Ang II (0.001 µM), mostra una riduzione significativa di circa la metà dei livelli di mRNA per il

TGF-β rispetto ai valori misurati dopo stimolazione con Ang II, mentre il pre-trattamento con PD

123,319, antagonista dell’ AT2R non modifica l’incremento indotto da Ang II (figura 7, pannelli A

e B). Lo stesso risultato si osserva alla concentrazione di 1 µM, seppur privo di significatività

statistica.

103

4.4.9 Valutazione dell’espressione genica di IL-10 nelle Treg e nelle Teff

I dati relativi alle Teff mostrano un incremento, seppur non significativo, dell’espressione

dell’mRNA per IL-10 in presenza di Ang II alla concentrazione di 0.001 µM, mentre non si osserva

alcun effetto con le altre concentrazioni utilizzate (tabella 4). Per quanto riguarda le Treg, si osserva

un aumento di circa 1 volta, seppur privo di significatività statistica, dopo incubazione con la

concentrazione di 0.001 µM, e un incremento statisticamente significativo di 2 volte alla

concentrazione di 1 µM (figura 8, pannello A). Come per il TGF-β, il pre-trattamento di 1 h delle

Treg con candesartan (10 µM), prima di Ang II 0.001 µM, mostra una riduzione significativa di

circa la metà dei livelli di mRNA per l’IL-10 mentre il pre-trattamento con PD 123,319 non mostra

alcun effetto (figura 8, pannello B).

4.4.10 Analisi citofluorimetrica dell’effetto dell’angiotensina sulla attività soppressoria

delle Treg

L’analisi citofluorimetrica della funzionalità delle Treg intesa come capacità di inibire la

proliferazione delle Teff indotta da uno stimolo mitogenico, rappresentato nel nostro caso dalla

PHA (10 µg/ml) mostra, come atteso, un inibizione statisticamente significativa della proliferazione

delle Teff da parte delle Treg di circa il 50 % (figura 9, colonna nera). Il pre-trattamento di 1 h con

angiotensina alla concentrazione di 0.001 µM mostra un aumento statisticamente significativo di

circa il 10% dell’inibizione della proliferazione delle Teff indotta da PHA da parte delle Treg

(figura 9).

104

4.5 CONCLUSIONI

Il principale risultato del presente studio è rappresentato dal fatto che il recettore AT1 è espresso in

modo non uniforme nelle sottopopolazioni di linfociti CD4+, con una preferenziale distribuzione sia

a livello di gene che di proteina nelle CD4+CD25+ rispetto alle CD4+CD25-. Questo dato merita

un'attenta analisi, in considerazione del ruolo chiave della via di attivazione dell’angiotensina II che

attraverso il recettore AT1 espleta i propri effetti proinfiammatori. (32). Un aumento

dell’espressione di AT1R sulle cellule immunitarie è stato descritto nelle malattie cardiovascolari, e

fornisce un importante contributo al danno vascolare e alla progressione della malattia (33;34).

E’ noto che l’angiotensina II esercita i propri effetti proinfiammatori attraverso AT1R e abbiamo

recentemente dimostrato che AT1R è sovra-espresso nelle cellule immunitarie ottenute da soggetti

ad alto rischio (34;35). Questa evidenza è indicativa di un ruolo di modulazione chiave di Ang II

nella progressione della malattia e offrire nuove possibili strategie terapeutiche.

Le prove più importanti del ruolo delle CD4+ e dei sottotipi di linfociti T come le Tregs

nell'aterosclerosi provengono da studi su animali (36). Di particolare rilevanza, uno studio molto

recente condotto su CD4+ e CD8+ separati da splenociti di topo mostra l’esistenza di un sistema

endogeno di produzione di Ang II (37). Infatti, sembrerebbe che l’incubazione di queste cellule con

Ang II non abbia alcun effetto su alcune funzioni importanti quali l’adesione e la transmigrazione

cellulare mentre il trattamento delle stesse cellule con un antagonista AT1 porti ad una inibizione di

queste funzioni (37). Secondo gli autori quindi queste funzioni sembrano essere regolate dal

recettore di tipo 1 e non dal 2 in quanto l’utilizzo di antagonisti AT2 non sembrerebbero avere alcun

effetto e che quest’effetto evidenzi un tono endogeno dell’Ang II probabilmente dovuto ad una

produzione locale di questo peptide. Diversi studi hanno evidenziato l’esistenza dei precursori

dell’Ang II nelle cellule del sistema immunitario. Anche un nostro lavoro di qualche anno fa ha

evidenziato nei linfociti umani e nei PMN la presenza del sistema RAS (34; 35). Questi dati uniti ad

altri in letteratura suggeriscono che tale sistema può essere una importante fonte di regolazione

della risposta immunitaria e pertanto bersaglio farmacologico in diverse patologie che coinvolgono

il sistema immunitario. D’altra parte è ben noto l’effetto positivo sulle patologie cardiovascolari del

trattamento sia con ACE-inibitori che antagonisti del recettore AT1.

A nostro parere, l'osservazione che Ang II possa essere in grado di modulare la funzione Treg senza

influire sulla funzione CD4+ è indicativo di un ruolo di modulazione di questa sottopopolazione di

linfociti T da parte dell’Ang II e di un ruolo chiave di questo sottopopolazione altamente

specializzata nell’aterosclerosi. In particolare, considerando il ruolo funzionale di Treg (inibizione

della proliferazione Teff), i dati presenti potrebbero fare luce sulla possibilità di modulare la

progressione dell'aterosclerosi, che è ritenuta una malattia infiammatoria mediata principalmente da

105

un’alterata funzionalità dei linfociti T. E' infatti ben noto che la progressione della malattia è

strettamente legata alla risposta Th1 e che le Treg sono in grado di contrastare l'espansione delle

cellule T. I dati del presente studio suggeriscono una sensibilità preferenziale delle Treg all’Ang II,

che a sua volta rappresenterebbe un meccanismo completamente nuovo attraverso il quale questo

peptide esercita i suoi effetti. La differente sensibilità dei sottotipi di linfociti a questo peptide,

evidenziata dalla mancanza di effetto sulla proliferazione delle CD4+ e una modulazione della

capacità soppressoria delle Treg, suggerisce inoltre la possibilità di poter agire selettivamente su

alcune funzioni del sistema immune senza interferire con altre e questo renderebbe l’approccio

terapeutico mirato e selettivo.

I risultati di questo studio inoltre mostrano che l’Ang II è in grado di aumentare la capacità

soppressoria delle Treg anche attraverso la modulazione della produzione di citochine tipiche di

queste cellule, ancora una volta in maniera preferenziale rispetto alle CD4 totali. Infatti,

l’incubazione delle Treg e non delle Teff induce una maggiore espressione genica del TGF-β.

Restano tuttavia dei dubbi che meritano di essere approfonditi perché mentre TGF-β è modulato

nelle Treg, l’espressione di IL-10 è sensibile all’Ang II solo nelle Teff, confermando ancora una

volta un’azione preferenziale su sottotipi cellulari.

L’aumento della produzione di mRNA da parte delle Treg è anche direttamente legata al recettore

di tipo 1, come dimostrato dal fatto che la preincubazione di 1h delle cellule con candesartan

(antagonista AT1R) riporta i valori al controllo; risultato non osservato invece con la pre-

incubazione delle Treg con PD1,2,3 (anatagonista dell’AT2R).

Questi risultati sarebbero di rilevante importante considerando il significato clinico ben noto di

modulazione dell’Ang II e degli effetti indotti attraverso la modulazione dei loro recettori (AT1R in

particolare) e offrirebbe nuovi possibili approcci terapeutici nelle malattie infiammatorie note per il

coinvolgimento delle Treg in generale, e in particolare nelle malattie cardiovascolari.

106


Rimangono tuttavia ancora ulteriori esperimenti da condurre relativamente alla funzionalità delle

Treg e ad un effetto specifico dell’Ang II sulla loro capacità soppressiva. Inoltre, sarebbe necessario

confermare i dati sull’aumento dell’espressione genica del TGF-β conducendo esperimenti al fine di

valutare se anche l’espressione della proteina è aumentata dall’incubazione con angiotensina e se il

candersartan è in grado di modulare quest’effetto. Questi esperimenti potrebbero essere condotti sia

mediante analisi citofluorimetrica utilizzando un anticorpo diretto contro il TGF-β, metodica già

messa a punto nel nostro laboratorio, oppure utilizzando la classica metodica ELISA mediante la

misurazione dei livelli di questa citochina nei surnatanti di cellule messe in coltura.

Questi risultati sarebbero di rilevante importante considerando il significato clinico ben noto di

modulazione dell’Ang II e degli effetti indotti attraverso la modulazione dei loro recettori (AT1R in

particolare) e offrirebbe nuovi possibili approcci terapeutici nelle malattie infiammatorie note per il

coinvolgimento delle Treg in generale, e in particolare nelle malattie cardiovascolari.


FoxP3 mRNA (2-∆∆∆∆ct

)

Angiotensina II (µM)

0 0.001 0.01 0.1 1

TEFF 7.5±1.6x10-6 7.6±9.6x10-6 5.9±9.5x10-6 6.0±1.0x10-6 4.1±5.9x10-6

TREG 5.1±4.5x10-4 1.5±2.0x10-4 1.2±1.21x10-4 4.2±1.1x10-5 3.7±4.3x10-4

Tabella 1. Valutazione dell’espressione genica del FoxP3 mediante Real Time PCR. Le Teff e le Treg purificate mediante sorting immunomagnetico sono messe in coltura per 24 h in presenza di concentrazioni crescenti di angiotensina II (0.001- 1 µM). I dati sono espressi come media±DS di n= 9.

108

PHA 10 µg/ml

CTRL CD 10 µM PD 10 µM

TEFF 74,30±13,55 75,70±8,75 75,97±10,37

PHA 10 µg/ml

Angiotensina II (µM)

0 0.001 0.01 0.1 1

TEFF 58.8±12.8 47.4±25.1 47.5±24.8 51.6±18.9 53.9±18.3

Tabella 2. Valutazione dell’effetto della stimolazione con Ang II sulla proliferazione delle Teff indotta da PHA. Le Teff purificate mediante sorting immunomagnetico sono marcate con CFSE (1 µM), attivate con PHA (10 µg/ml) in presenza o meno di concentrazioni crescenti di angiotensina II (0.001- 1 µM), lasciate in coltura per 5 giorni e successivamente analizzate mediante analisi citofluorimetrica. I dati sono espressi come media±DS della percentuale (%) di cellule CFSElow di n= 6-3.

Tabella 3. Valutazione dell’effetto di antagonisti per i recettori per Ang II sulla proliferazione delle Teff indotta da PHA. Le Teff purificate mediante sorting immunomagnetico sono marcate con CFSE (1 µM), attivate con PHA (10 µg/ml) in presenza o meno di candesartan (CD) o PD 123319 (PD) analizzate mediante analisi citofluorimetrica. I dati sono espressi come media±DS della percentuale (%) di cellule CFSElow di n= 6-3.

109

mRNA (2-Dct

)

TGF-β IL-10

TE 9.8±1.8x10-5 5.3±5.3x10-7 A 0.001 5.0±2.1x10-6 2.0±1.4x10-6 A 0.01 3.5±3.4x10-6 1.3±4.6x10-7

A 1 6.9±4.3x10-6 3.0±3.5x10-7

Tabella 4. Valutazione degli effetti indotti dalla stimolazione con Ang II sull’espressione genica delle citochine TGF-β e IL-10 nelle Teff. Le Teff purificate mediante sorting immunomagnetico sono messe in coltura in condizioni basali e dopo trattamento con concentrazioni crescenti di angiotensina II (0.001 - 1 µM) per 24 h e successivamente analizzate mediante Real Time PCR PCR. I dati sono espressi come media±DS di n= 9-3.

g/m

l

µµµµ

PHA

10

0.00

1

0.01

0.

1 1 5

0

50

100

150

Angiotensin II (µµµµM)

% p

roli

fera

tio

n C

D4

+

0

2.0×10 -6

4.0×10 -6

6.0×10 -6

8.0×10 -6

0

1

2

3

4

AT

1R

mR

NA

(2

- ∆∆ ∆∆C

t )

% C

D4

+ AT

1 R


Figura 1. Valutazione dell’espressione genica e proteica di AT1R nelle CD4

+. La figura mette a confronto

l’espressione genica (colonna bianca) e proteica (% cellule positive; colonna grigia) dell’AT1R nelle CD4+. I dati sono espressi come media ± SD di n = 7-5.

Figura 2. Effetto della stimolazione con Ang II sulla proliferazione delle CD4

+ indotta da PHA.

Effetto della stimolazione con concentrazioni crescenti di ang II (0,001 – 50 µM) sulla proliferazione delle CD4+ indotta da PHA 10 µg/ml mediante analisi citofluorimetrica dopo marcatura delle cellule con CFSE. I dati sono espressi come media ± SD di n = 6.

PHA

10

mg/

ml

0.00

1

0.01

0.1 1 5

0

50

100

150

200


INF

- γγ γγ (

pg

/ml)

(% C

TR

L)

PHA

10

mg/

ml

0.00

1

0.01

0.1 1 5

0

50

100

150

200

Angiotensin II (µµµµM)IL

-4 (

pg

/ml)

(% C

TR

L)

A B

Figura 3. Valutazione dell’espressione genica dell’INF-γ e dell’IL-4 nelle CD4+ isolate mediante sorting

immunomagnetico. Effetto della stimolazione con concentrazioni crescenti di Ang II (0.001 – 5 µM) sulla produzione di citochine INF-γ (pannello A) e IL-4 (pannello B) da parte delle CD4+ dopo stimolazione con PHA 10 µg/ml. I dati rappresentati come percentuale (%) rispetto alla PHA sono espressi come media ± SD; n = 4.

Teff Treg0

2.0×10 -5

4.0×10 -5

6.0×10 -5

8.0×10 -5

1.0×10 -4

1.2×10 -4

**

AT

1R

mR

NA

(2

-DC

t )

Figura 4. Valutazione dell’espressione genica di AT1R

nelle sottopopolazioni linfocitarie. Le Teff e le Treg appena isolate mediante sorting immunomagnetico e successivamente processate mediante Real Time PCR. I dati sono espressi come media ± SD di n = 7; ** P < 0,01 vs Teff.

lo

CD

127

hi+

CD

25

+

CD

127

+

CD

25

hi

CD

127

-

CD

25

0

2

4

6

**

% c

ellu

le p

osi

tiv

e A

T1R

lo

CD

127

hi+

CD

25

+

CD

127

+

CD

25

hi

CD

127

-

CD

25

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

**

MF

I A

T1R

A B

Figura 5. Valutazione citofluorimetrica dell’espressione di membrana di AT1R nei tre fenotipi cellulari. Pannello A: valutazione della % di cellule positive all’AT1R. I dati sono espressi come media ± SD di n = 6; ** P < 0.01 vs CD25+CD127lo. Pannello B: valutazione dell’MFI di AT1R. I dati sono espressi come media ± SD di n = 4; ** P < 0.01 vs CD25-CD127hi.

114

TR

0,00

1

0,01 1

0

5.0×10 -5

1.0×10 -4

1.5×10 -4

2.0×10 -4

*

*

*


mR

NA

TG

F-ββ ββ

(2

-∆∆ ∆∆ct

)

TR

0,00

1

0,01 1

0

1

2

3

**

**


mR

NA

TG

F-ββ ββ

(2

-∆∆ ∆∆ct

)

(rati

ovs

CT

RL

)

Figura 6. Valutazione dell’espressione genica del TGF-β nelle Treg isolate. Effetto della stimolazione con concentrazioni crescenti di Ang II (0.001 – 1 µM; 24 h) sui livelli mRNA del TGF-β nelle Treg purificate mediante sorting immunomgnetico. Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di real time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media ± SD; n = 13-3. *=P<0.05 vs Treg; **=P<0.005 vs Treg.

A B

115

0

5.0×10 -5

1.0×10 -4

1.5×10 -4

2.0×10 -4

2.5×10 -4Candesartan 10 µµµµM

0.001 0.01 1

Angiotensina II (µµµµM)

#

PD 123,319 10 µµµµM

mR

NA

TG

F- ββ ββ

(2

-∆∆ ∆∆ct

)

0

1

2

3

4Candesartan 10 µµµµM

0.001 0.01 1


#

PD 123,319 10 µµµµM

mR

NA

TG

F- ββ ββ

(2

-∆∆ ∆∆ct

)

(TR

, ra

tio

vs

CT

RL

)

Figura 7. Valutazione del trattamento con antagonisti dell’angiotensina II sull’espressione genica del TGF-β

nelle Treg isolate. Le Treg isolate sono pre-trattate per 1 h con gli antagonisti candesartan (10 µM) o PD123,319 (10 µM) e successivamente incubate per 24 h con angiotensina II (0.001 – 1 µM) per la successiva valutazione mediante Real Time PCR dei livelli di mRNA del TGF-β. Pannello A: grafico relativo ai valori assoluti ottenuti dopo l’analisi di real time PCR. Pannello B: grafico relativo agli stessi dati elaborati ed espressi come percentuale (%) del controllo. I dati sono espressi come media ± SD; n = 4. #=P<0.05 vs Ang II 0.001 µM.

A B

116

TR

0,00

1

0,01 1

0

1

2

3

4

*


mR

NA

IL

-10

(2

-∆∆ ∆∆ct

)

(rati

ovs

CT

RL

)

0

1

2

3

4

Candesartan 10 µµµµM

0,001 0,01


#

PD 123,319 10 µµµµM

mR

NA

IL

-10

(2

-∆∆ ∆∆ct

)

(TR

, ra

tio

vs

CT

RL

)

Figura 8. Valutazione del trattamento con antagonisti dell’angiotensina sull’espressione genica dell’IL-10 nelle

Treg isolate. Pannello A: effetto della stimolazione con concentrazioni crescenti di Ang II (0.001 – 1 µM; 24 h) sui livelli mRNA del TGF-β nelle Treg purificate mediante sorting immunomgnetico. Pannello B: pre-trattamento di 1 h delle cellule con candesartan (10 µM) o PD 123,319 (10 µM) e successivamente incubate per 24 h con angiotensina II (0.001 – 1 µM). I dati rappresentati come percentuale (%) del controllo, sono espressi come media ± SD di n = 4. *=P < 0,05 vs Treg; #= P < 0,05 vs Ang II 0.001 µM.

A B

40

60

80

100

120

+ + + + + + + + Teff

- + + + + + + + Treg

+ + + + + + + + PHA

- - + - - - - - Ang II 0,001 µM - - - + - - - - Ang II 0,01 µM

- - - - + - - - Ang II 0,1 µM

- - - - - + - - Ang II 1 µM

#

**

% i

nib

izio

ne

dell

a p

ro

life

ra

zio

ne

Figura 9. Valutazione dell’inibizione della proliferazione delle Teff indotta

da PHA da parte delle Treg. Le Teff sono incubate da sole (rettangolo bianco) o insieme alle Treg (colonna nera) in presenza di PHA (10 µg/ml). Le colonne grigio chiaro rappresentano la cocoltura Teff/Treg in presenza di PHA e pre-trattate per 1 h con concentrazioni crescenti di angiotensina II (0,001-1 µM). I dati sono espressi come media ± SD di n = 11-7. **=P < 0,005 vs TE+PHA; #= P < 0,05 vs TETR+PHA.

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