INDICE

ABBREVIAZIONI…………………………………………………………………..3

SOMMARIO………………………………………………………………………...9

SUMMARY…………………………………………………………………………13

1 INTRODUZIONE…………………………………………………………….. 17

1.1 Il citomegalovirus umano (HCMV)……………………………………... 17

1.2 Struttura…………………………………………………………………... 18

1.3 Ciclo replicativo…………………………………………………………… 22

1.4 Fasi di maturazione e gemmazione del virione di HCMV………………. 25

1.5 Il tegumento……………………………………………………………… 28

1.6 Ruolo delle glicoproteine nel ciclo di replicazione……………………… 34

1.7 Il trafficking delle glicoproteine lungo il pathway endocitico e le molecole trasportatrici……………………………………………………. 38

1.8 La glicoproteina B (UL55)……………………………………………….. 42

1.9 Proteine del pathway dei multivesicular body coinvolte nella gemmazione di virus dotati di envelope…………………………………. 45

1.10 Ruolo dei multivesicular body nella gemmazione di virus a DNA……. 54

2 SCOPO………………………………………………………………………… 57

3 MATERIALI E METODI……………………………………………………….59

3.1 Linee cellulari……………………………………………………………… 59

3.2 Ceppi virali………………………………………………………………… 60

3.3 Plasmidi……………………………………………………………………. 60

3.4 Oligonucleotidi innesco………………………………………………….. 64

3.5 Tecniche di biologia molecolare…………………………………………. 66

3.5.1 Purificazione del DNA plasmidico………………………………………………… 66 3.5.2 Restrizioni enzimatiche……………………………………………………………. 68 3.5.3 Tecniche di clonaggio……………………………………………………………….68 3.5.4 Reazione di amplificazione a catena della polimerasi……………………………...70 3.5.5 Competenza e trasformazione batterica…………………………………………... 71 3.5.6 Mutagenesi sito specifica……………………………………………………………72 3.5.7 Sequenziamento dei plasmidi e purificazione delle sequenze……………………. 73 3.5.8 BAC mutagenesi……………………………………………………………………. 74

3.6 Tecniche di biologia cellulare……………………………………………... 76

3.6.1 Tecniche di trasfezione……………………………………………………………… 76 3.6.2 Trasduzione delle cellule HFF………………………………………………………78 3.6.3 Infezione delle colture cellulari con HCMV………………………………………. 79 3.6.4 Lisi cellulare…………………………………………………………………………79 3.6.5 Immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione……………………………..80 3.6.6 SDS-gel elettroforesi………………………………………………………………... 80 3.6.7 Immunoblotting…………………………………………………………………… 81 3.6.8 Saggi di immunofluorescenza indiretta…………………………………………… 82

4 RISULTATI…………………………………………………………………….. 85

4.1 Ottenimento dei costrutti esprimenti l’omologo della gB di HSV-1 in HCMV (UL55) in forma wt e in una forma parzialmente tronca a livello della coda citoplasmatica………………………………………………….. 85

4.2 UL55 è ubiquitinata in cellule trasfettate ed infettate…………………. 86

4.3 UL55 colocalizza con le membrane dei MVB ed il suo trafficking intracellulare richiede la corretta biogenesi dei MVB……………………. 89

4.4 Le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 sono coinvolte nell’ubiquitinazione e degradazione di UL55 ed interagiscono con la glicoproteina attraverso il suo motivo PPSY……………………………... 95

4.5 UL55 mostra una differente localizzazione rispetto a UL55 e UL55 in cellule trasfettate……………………………………………….

PPSA wt

833 99

4.6 UL55 e la forma wt in presenza di Vps4 rilocalizzano a livello delle membrane degli endosomi precoci………………………………….

PPSA E228Q

100

4.7 UL55 segue la via dei MVB/lisosomi…………………………………….. 101

4.8 Localizzazione dei mutanti di UL55 nel contesto dell’infezione virale… 102

4.9 Ruolo delle deubiquitinasi AMSH e UBPY……………………………… 104

4.10 UL55, ma non UL55 , interagisce con Tsg101………………………...833 105

4.11 La proteina dei MVB Tsg101 è reclutata all’assembly compartment…... 111

4.12 Costruzione di virus ricombinanti mediante tecnologia BAC………… 114

5 DISCUSSIONE………………………………………………………………….117

6 BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………….. 129

ABBREVIAZIONI

AA aminoacido/i

AAA ATPase associated with various cellular activities

AC assembly complex o assembly compartment

Ab anticorpo

AC-LL acidic cluster-dileucine signal

AIP1 ALG-2 interacting protein 1

AIP4 atrophin-1 interacting protein 4

Alix ALG-2 interacting protein x

Amp ampicillina

AMSH SH3 domain of STAM

AP adaptor protein

Ara arabinosio

ATP adenosina trifosfato

BAC bacterial artificial chromosome

pb paia di basi

BSA albumina di siero bovino

CAF cloramfenicolo

CHMP charged multivesicular body protein

CC coiled-coil

CCV clathrin coated vescicles

CKII casein kinase-II

co-IP co-immunoprecipitazione

CPD carbossipeptidasi D

DB dense body

DLD Disintegin-Like Domain

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DNA acido desossiribonucleico

D.O. densità ottica

d.p.i. day post-infection

DUB de-ubiquitinating enzyme

E early, precoce

EBV virus di Epstein-Barr

EDTA acido etilendiamminotetracetico

EE early endosome

EEA-1 early endosomal antigen-1

EIAV virus dell’anemia infettiva equina

ERC endocytic recycling compartment

ESCRT endosomal sorting complex required for transport

EGFR epidermal growth factor receptor

FBS fetal bovine serum

FCS fetal calf serum

FITC isotiocianato di fluoresceina

g glicoproteina

GAT GGA and TOM

gc glycoprotein complex

GCV Ganciclovir [2-amino-9-(1,3-dihydroxy

propan-2 yloxymethyl)-3-H-purin-6-one]

GFP green fluorescent protein

GGA ADP-rybosilation factor(ARF)-dependent clathrin adaptor

GLUE GRAM-like ubiquitin binding in EAP45

GPCR recettori accoppiati a proteina G

Grp glucose regulated protein

h ore

HA emoagglutinina

HBV virus dell’epatite B

HCMV citomegalovirus umano

HECT homologous to E6-AP C terminus

HFF human foreskin fibroblasts

HHV human herpesvirus

HIV-1 virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1

h.p.i. hours post-infection

HRP horseradish peroxidase

Hrs hepatocyte growth factor-regulated tyrosine

kinase substrate

HSV herpes simplex virus

IE immediate early, precocissimo

Ig immunoglobuline

ILV vescicole intraluminali

IP immunoprecipitazione

IF immunofluorescenza

Kan kanamicina

kb kilobasi

kDa kiloDalton

L late, tardivo

LAMP-1 lysosome associated membrane protein-1

LB loading buffer

LB-Medium Luria Bertani-Medium

LE late endosome

LTP large tegument protein

LTPbp large tegument protein binding protein

LTR long terminal repeat

MAb anticorpo monoclonale

MCMV citomegalovirus murino

MCP major capsid protein

mCP minor capsid protein

MCR5 human embryonic lung fibroblast

MEM Eagle’s minimum essential medium

µg microgrammi, 10-6 g

MIEP major IE promoter enhancer

µl microlitri, 10-6 litri

m.o.i. molteplicità d’infezione

MoMLV virus della leucemia murina di Moloni

MPR mannose 6-phosphate receptor

MTOC microtubule organizing center

MVB multivesicular body

Nedd4 neuronal precursor cell-expressed developmentally

down-regulated-4

ng nanogrammi, 10-9 g

NIEP non-infectious enveloped particle

nm nanometri, 10-9 m

NTP nucleotide trifosfato

ORF open reading frame

PAb anticorpo policlonale

PACS-1 phosphofurin acid cluster sorting protein-1

PBS phosphate buffer saline (tampone fosfato)

PBS-Tween 0,1% PBS addizionato di Tween 20 0,1%

PCR polymerase chain reaction

PFA paraformaldeide

PFU unità formanti placca

PI fosfatidilinositolo

PI(3)P fosfatidilinositolo 3-fosfato

PIP3 phosphadtidylinositol (3,4,5)-trisphosphate

Plk polo-like kinase

pp fosfoproteina

PPxY Pro-Pro-x-Tyr

PRV pseudorabies virus

P(T/S)AP Pro-Thr/Ser-Ala-Pro

p/v peso-volume

PVDF polivinilidendifluoride

RE reticolo endoplasmatico

RNA acido ribonucleico

rpm rivoluzioni per minuto

RSV virus del sarcoma di Rous

SB steadiness box

SH3 src homology-3

SDS dodecilsolfato di sodio

SDS-PAGE SDS-Poliacrilammidegelelettroforesi

siRNA small interfering RNA

SIV virus dell’immunodeficienza nella scimmia

STAM signal transducing adaptor molecule

TOM target of myb1

TBE trisborato EDTA

TGN trans-Golgi network

TK timidina chinasi

TLR toll-like receptor

TM transmembranario/a

Tsg101 tumor susceptibiliy gene 101

Ubi ubiquitina

UBP ubiquitin isopeptidase

UBPY ubiquitin-specific processing protease Y

UEV ubiquitin E2 variant

UIM ubiquitin-interacting motif

UL unique long

US unique short

USP ubiquitin-specific protease

UV luce ultravioletta

Vps vacuolar protein sorting

v/v volume-volume

VZV virus della Varicella Zoster

YPxL Tyr-Pro-x-Leu

VHS Vps27, Hrs, STAM

VSV virus della stomatite vescicolare

WB western blotting

wt wild-type

WW triptofano-triptofano

SOMMARIO

Il sistema endosomiale delle cellule eucariotiche è una complessa rete di

compartimenti membranosi che coordinano il trasporto delle proteine tra la

membrana plasmatica, il trans-Golgi network (TGN) ed i lisosomi. Un ruolo

centrale a questo livello è svolto da un organello identificato con il termine

multivesicular body (MVB). Numerose proteine coinvolte nella biogenesi di

questo pathway sono essenziali per la gemmazione di virus ad RNA dotati di

envelope come retrovirus (Göttlinger et al., 1991), rhabdovirus, filovirus (Strack

et al., 2000), arenavirus e paramyxovirus (Strack et al., 2003). Più recentemente è

stato chiarito che anche alcuni virus a DNA dotati di envelope, ed in particolare

l’herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) (Calistri et al., 2007; Crump et al., 2007),

il virus dell’epatite B (HBV) (Lambert et al., 2007; Watanabe et al., 2007),

l’herpes virus umano di tipo 6 (HHV-6) (Mori et al., 2008) ed il citomegalovirus

umano (HCMV) (Tandom et al., 2009), sfruttano le membrane dei MVB per

assemblaggio e gemmazione. La teoria attualmente più accreditata riguardo al

processo di acquisizione del pericapside ed al meccanismo di gemmazione degli

herpesvirus è la teoria del doppio envelopment in base alla quale il virione

acquisisce a livello della membrana nucleare interna un envelope primario, che

viene perso per gemmazione dalla membrana nucleare esterna. Il virione acquisce,

infine, l’envelope secondario e definitivo a livello di organelli intracitoplasmatici

di natura membranosa. La morfogenesi di HCMV è completata in un

compartimento perinucleare che il virus forma durante l’infezione noto come

assembly complex o assembly compartment (AC).

Questo progetto nasce dalle evidenze messe in luce nel nostro gruppo di ricerca

che dimostrano come la glicoproteina gB di HSV-1 svolga un ruolo centrale nel

permettere al virus di sfruttare il pathway dei MVB durante le fasi finali del

proprio ciclo replicativo. La glicoproteina, infatti, colocalizza con noti marcatori

dei MVB ed il suo traffico intracellulare e maturazione richiedono la corretta

biogenesi di questi organelli. Inoltre, gB è ubiquitinata a livello della coda C-

terminale dove si localizzano i residui coinvolti in endocitosi e trafficking

intracellulare (Calistri et al., 2007).

Partendo dal presupposto che gB è una delle glicoproteine più conservate tra gli

herpesvirus, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di analizzare se anche

nel caso di altri virus appartenenti alla famiglia Herpesviridae, che sembrano

utilizzare i MVB per la propria maturazione e/o gemmazione, questa glicoproteina

rappresenti uno degli anelli di congiunzione tra virus e pathway cellulare. In

particolare, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla gB di HCMV (UL55),

essendo le evidenze a sostegno del ruolo dei MVB nel ciclo replicativo di questo

virus ancora contraddittorie (Fraile-Ramos et al., 2007; Tandom et al., 2009).

Mentre normalmente questa glicoproteina localizza a livello dell’AC (Sanchez at

al., 2000), abbiamo dimostrato attraverso saggi di immunofluorescenza (IF) che,

in cellule nelle quali la biogenesi dei MVB viene bloccata, gB rimane dispersa nel

citoplasma delle cellule infettate. In cellule trasfettate, invece, il blocco della

biogenesi di questo pathway ne determina l’accumulo sia a livello intracellulare

sia in compartimenti membranosi e la rilocalizzazione a livello di siti positivi per

EEA-1 (early endosomal antigen-1), un marcatore degli endosomi precoci. Questi

dati suggeriscono il coinvolgimento dei MVB e la necessità della loro corretta

biogenesi nel trafficking anche della gB di HCMV.

Inoltre, i nostri dati mostrano che UL55, ma non altre glicoproteine di HCMV,

quali UL75 (gH), è ubiquitinata sia in cellule infettate sia in cellule trasfettate con

costrutti che mediano la sua espressione. Significativamente, abbiamo osservato

che UL55 presenta un sequenza PPSY, reminiscente del motivo PPxY, sequenza

consenso che media l’interazione con proteine caratterizzate da domini WW, quali

le ubiquitino ligasi E3 della famiglia Nedd4 (Strack et al., 2000). Infatti, siamo

stati in grado di dimostrare che le ubiquitino ligasi di questa famiglia, che sono

implicate nella biogenesi dei MVB (Staub et al., 1997), interagiscono fisicamente

con UL55, proprio attraverso il motivo PPSY, e sono coinvolte nella sua

ubiquitinazione e nella sua degradazione lisosomiale, almeno in condizioni di

over-espressione. In particolare abbiamo osservato che: i) quando sovraespresse le

ubiquitino ligasi portano ad una significativa riduzione dei livelli di UL55 in

cellule co-trasfettate con il costrutto esprimente la glicoproteina virale; ii) almeno

in condizioni di sovraspressione, UL55 si accumula nelle cellule in presenza

dell’inibitore dei lisosomi bafilomicina.

Il complesso ruolo giocato dall’ubiquitinazione nel trafficking di UL55 è stato

ulteriormente dimostrato indagando la funzione svolta, a questo livello, dalle due

de-ubiquitinasi AMSH e UBPY, entrambe attive a livello dei MVB (Clague and

Urbè, 2006). Coerentemente al modello prevalente in letteratura (Welchman et al.,

2005), i nostri risultati suggeriscono che AMSH sia coinvolta nella

deubiquitinazione di UL55 al fine di favorire il suo reciclo, mentre UBPY la

deubiquitini per permetterne l’incorporazione nei MVB.

A dimostrazione ulteriore del coinvolgimento dei MVB nel destino intracellulare

di UL55, quest’ultima, ma non gB di HSV-1 nè gB del virus della pseudorabbia

(UL27), interagisce anche con Tsg101, un’altra proteina fondamentale per la

biogenesi dell’organello cellulare. È noto che le proteine che interagicono con tale

componente dei MVB contengono un dominio aminoacidico ricco in proline di

tipo P(T/S)AP. UL55 non contiene sequenze consenso sovrapponibili a tale

motivo e i nostri dati permettono di escludere che il legame sia mediato dalle

ubiquitino ligasi Nedd4 o da alcune proteine adattatrici, che reclutano a livello

endosomiale e del TGN proteine ubiquitinate destinate ai MVB (Hrs, GGA, Tom).

Abbiamo, invece, dimostrato che il legame tra UL55 e Tsg101 è mediato dalla

coda citoplasmatica della glicoproteina e dal dominio N-terminale UEV (ubiquitin

E2 variant) di Tsg101. Mutanti di Tsg101 a livello del dominio UEV che non

legano più l’ubiquitina o L-domain di tipo P(T/S)AP, invece, continuano ad

interagire con UL55. Infine saggi di IF in cellule infettate hanno messo in luce che

la proteina Tsg101 è reclutata all’AC. Ulteriori esperimenti chiariranno il

meccanismo molecolare alla base di questa interazione.

Consapevoli che i dati ottenuti, pur indicando un ruolo chiaro per i MVB nel

trafficking della gB di HCMV, erano stati ottenuti principalmente in cellule

trasfettate, abbiamo voluto analizzare la rilevanza funzionale e biologica dei nostri

risultati ottenendo, mediante mutagenesi basate sulla strategia BAC (bacterial

artificial chromosome), virus ricombinanti caratterizzati da specifiche mutazioni a

livello di UL55 o dalla sua completa delezione. L’analisi di questi mutanti in

termini di crescita, localizzazione intracellulare di specifiche proteine virali e/o

cellulari (saggi di IF) e maturazione/gemmazione dei virioni (saggi di microscopia

elettronica) chiariranno il ruolo delle interazioni tra UL55 e le proteine dei MVB

nel ciclo replicativo di HCMV.

Nel complesso fino a questo momento i nostri dati mostrano che UL55, come la

gB di HSV-1, è una delle proteine chiave che associa envelopment e gemmazione

virali al pathway dei MVB.

SUMMARY

The eucaryotic endosomal system is a complex network of vesicles and organelles

surrounded by membranes which coordinates protein transport between the

plasma membrane, the trans-Golgi network (TGN) and the lysosomes. A central

role at this level is played by an organelle named multivesicular body (MVB).

Several proteins involved in the MVB biogenesis are essential for budding of

RNA-enveloped viruses, like retroviruses (Göttlinger et al., 1991), rhabdoviruses,

filoviruses (Strack et al., 2000), arenaviruses and paramyxovirus (Strack et al.,

2003). More recently it has been clarified that also some DNA-enveloped viruses,

and in particular Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) (Calistri et al., 2007;

Crump et al., 2007), Hepatitis B Virus (HBV) (Lambert et al., 2007; Watanabe et

al., 2007), Human Herpes Virus type 6 (HHV-6) (Mori et al., 2008) and Human

Cytomegalovirus (HCMV) (Tandom et al., 2009), exploit the MVB membranes

for their assembly and budding. The more accredited view concerning

herpesviruses envelopment and budding is the ‘double envelopment theory’,

envisioning that virion acquires at the level of the inner leaflet of the nuclear

membrane a primary envelope, that it is lost by budding from the outer nuclear

membrane. Finally, virions acquire the secondary and final envelope at the level

of intracytoplasmic membranous organelles. HCMV morphogenesis is completed

in a virally induced perinuclear compartment, referred as ´assembly compartment’

or ‘assembly complex’ (AC).

This project moves from the data obtained in our laboratory regarding HSV-1 gB

as one of the protein linking the virus to the MVB pathway. Indeed, the

glycoprotein colocalizes with well-known MVB markers and its intracellular

trafficking and maturation require the correct biogenesis of these organelles.

Furthermore, gB is ubiquitinated in the C-terminal tail at the level of residues

involved in endocytosis and trafficking between endosomes, TGN and lysosomes

(Calistri et al., 2007).

The aim of this work was to contribute to elucidate whether other viruses of the

Herpesviridae family hijack the same cellular pathway and whether the HSV-1

gB behaviour is conserved among some glycoprotein homologs. In particulare, we

decided to focalized our attention on HCMV gB (UL55). By immunofluorescence

assays (IF) we observed that the MVB block results in the gB accumulation both

in the cytoplasm and in membrane compartments and in the gB relocalization at

the level of intracytoplasmic enlarged vesicles positive for the endosomial marker

EEA-1, while in infected cells the glycoprotein recruitment to the AC is impaired.

Therefore, these data suggest that, like for HSV-1 gB, also UL55 intracellular

trafficking requires a functional MVB biogenesis. Moreover, in support to a role

for MVBs/lysosomes in gB fate, we were able to show that, in transfected cells,

the glycoprotein accumulates in the presence of the lysosome inhibitor

bafilomycin. UL55 contains a PPxY domain, that matches the consensus sequence

for ligands recognized by the E3 ubiquitin ligases of the Nedd4 family. Our

results show that UL55, but not UL75 (gH), is ubiquitinated both in infected and

transfected cells and that the Nedd4-like ubiquitin ligases specifically interact

with HCMV gB through its PPSY motif and are involved in its ubiquitination and

lysosomial degradation.

We also analyzed the AMSH and UBPY role in UL55 deubiquitination.

Consistently to the model reported in literature (Welchman et al., 2005), our

results suggest that AMSH causes the UL55 deubiquitination for its recycling,

while UBPY deubiquitinates it to permit its MVB incorporation.

As a further evidence of the MVB involvement in the UL55 intracellular fate the

HCMV glycoprotein, but not HSV-1 gB nor the Pseudorabies Virus gB (UL27),

interacts also with another protein essential for the MVB biogenesis, Tsg101.

From the literature it is known that proteins interacting with this MVB component

contain a P(T/S)AP L-domain. Since UL55 does not contain such a consensus

sequence, we investigated the possible mechanism for this interaction. We

excluded that the binding could be mediated by the ubiquitin ligases Nedd4-like

or other adaptor proteins recruiting at the endosomes or at the TGN ubiquitinated

cargoes addressed to the MVBs (Hrs, GGAs, Toms). Moreover, we clarified that

the interaction between UL55 and Tsg101 depends on the glycoprotein

cytoplasmic tail and the N-terminal UEV (ubiquitin E2 variant) domain of

Tsg101. On the other hand, Tsg101 mutants in the UEV that do not interact with

the ubiquitin nor with the P(T/S)AP L-domain of HIV-1 Gag p6 domain, continue

to co-immunoprecipitate with UL55. Finally, confocal miscroscopy highlighted

that Tsg101 is recruited to the AC during the infection. Further experiments will

shed light on the molecular mechanism needed for this interaction.

To move our UL55 characterization toward a functional and biological analysis,

we built, by employing BAC mutagenesis, recombinant viruses carrying gB

specific mutations or lacking the glycoprotein coding sequence. The analysis of

these mutants in terms of viral growth, protein localization (analyzed by IF) and

virion maturation and egress (analyzed by electron microscopy assays) will clarify

the role of the interactions between UL55 and MVB proteins for the HCMV life

cycle.

Overall, our data point out to HCMV gB, in a simil way to HSV-1 gB, as the key

protein that links HCMV envelopment-egress to the MVB pathway.

__________________________________________________________________Introduzione

1 INTRODUZIONE

1.1 Il citomegalovirus umano (HCMV)

Il citomegalovirus umano (HCMV) o herpesvirus umano di tipo 5 (HHV-5) è il

più grande membro della famiglia Herpesviridae ed uno dei patogeni umani di

maggiori dimensioni.

La famiglia comprende complessivamente più di 120 membri, ampiamente

distribuiti in natura e caratterizzati dalla capacità di provocare infezioni che, dopo

l’esaurimento della fase clinica conseguente all’infezione primaria, si mantengono

allo stato latente per moltissimi anni o per tutta la vita. Periodicamente il virus

latente può riattivarsi spontaneamente o in seguito ad una varietà di stimoli non

ancora del tutto chiariti (stress, radiazioni U.V., traumi nel sito originario di

infezione, ipertermia, diminuzione dell’immunità cellulo-mediata), con

ricomparsa o meno di manifestazioni cliniche evidenti. Gli herpesvirus sono

suddivisi in tre sottofamiglie: α Herpesviridae, β Herpesviridae e γ Herpesviridae

(Roizman et al., 1981).

L’uomo è ospite naturale di 8 membri:

α herpesvirus: l’herpes simplex virus di tipo 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) e il

virus della Varicella Zoster (VZV);

β herpesvirus: HCMV e gli herpesvirus umani di tipo 6 e 7 (HHV-6,

HHV-7) (Roseolovirus);

γ herpesvirus: l’Epstein-Barr virus (EBV) e l’herpesvirus umano di tipo 8

(HHV-8).

L’HCMV è un patogeno umano ubiquitario ed è classificato come β herpesvirus

in base alle sue proprietà biologiche e alla struttura del genoma virale. L’analisi

comparativa della sequenza genomica ha portato alla correlazione e

classificazione nella stessa sottofamiglia anche dei virus umani HHV-6A, HHV-

6B e HHV-7 e tra i non umani del citomegalovirus murino (MCMV) e del

Proboscivirus (EIHV-1). I CMV non umani differiscono in termini di struttura

genomica e non è stato riportato causino patologie nell’uomo.

I β herpesvirus sono caratterizzati complessivamante dalla capacità di infettare

uno stretto spettro d’ospite, da un lungo ciclo riproduttivo e da una lenta crescita

in coltura.

17

_______________________________________________________________________________

L’infezione da HCMV decorre per lo più in maniera asintomatica in ospiti

immunocompetenti. Tuttavia è la principale causa virale di difetti alla nascita in

neonati con infezione congenita e la maggiore causa di gravi manifestazioni e

morte in pazienti immunocompromessi (Reddehase, 2006). La trasmissione può

avvenire con il contatto diretto con sangue e secrezioni contaminate, dal trapianto

di tessuti infetti e in rapporti sessuali. Durante la gravidanza, soprattutto nel primo

trimestre di gestazione, l'infezione primaria può causare la trasmissione trans-

placentare con possibilità di aborto e gravi danni al feto, frequenti in donne

sieropositive.

I meccanismi patogenetici alla base dell’infezione da HCMV non sono

attualmente del tutto chiariti. L’infezione primaria è caratterizzata da un alto

livello di replicazione virale in monociti e linfociti, in cui induce un caratteristico

effetto citopatico con la formazione di inclusioni citoplasmatiche e nucleari e la

distruzione del citoscheletro con conseguente ingrossamento della cellula

(citomagalia). Dopo la fase litica il virus rimane in latenza nel sangue periferico,

nell’epitelio dei tubuli renali e nell’epitelio delle ghiandole salivari. Antigeni e

acidi nucleici virali sono rilevabili in epiteli, endoteli, macrofagi e cellule

dendritiche, che sono nell’uomo le cellule ospiti dell’infezione. L’infezione

primaria acuta può portare a sintomi quali una sindrome simil-mononucleasica

con febbre, affaticamento e linfocitosi. La riattivazione virale è accompagnata da

un’infezione virale produttiva, che può determinare danni severi a carico di vari

organi come i polmoni (pneumonia), il sistema nervoso (encefaliti), la retina

(retiniti) e il sistema gastro-intestinale (coliti). L’infezione persistente può portare

a malattie di carattere proliferativo come l’aterosclerosi e il cancro gastro-

intestinale (Reddehase, 2006). La risposta T-citotossica è critica per il controllo

della repicazione virale. Per questo la terapia immunosoppressiva, necessaria per

prevenire il rigetto mediato dalle cellule T dopo il trapianto di organi solidi,

incrementa la suscettiblità all’infezione da HMCV.

1.2 St uttura r

L’HCMV umano, come gli altri herpesvirus, è un virus molto complesso di circa

150-200 nm in diametro e costituito da un genoma virale a DNA lineare a doppio

filamento di 235 Kb lungo 6655--6688 nnmm e con un contenuto di GC del 58%. Il

18

_________________________________________________________________Introduzione

filamento di DNA consiste di due componenti covalentemente legati, chiamati L

(long) e S (short). Ciascun componente è formato da sequenze uniche, circondate

alle estremità da sequenze ripetute (repeats) invertite contenenti segnali cis-acting

coinvolti nel cleavage e nel packaging dei genomi della progenie virale. Le

repeats del componente L sono chiamate ab e a’b’, mentre qualle delle S sono

chiamate a’c’ e ca (Davison and Wilkie, 1981).

ccaaSSbb’’aa’’mmcc’’ aallaann bb

Figura 1.2.1 Struttura del genoma di HCMV aL e aS sono le sequenze terminali uniche ripetute, mentre am e an sono sequenze

terminali ripetute presenti in una o più copie, o in zero o più copie

rispettivamente. La lunghezza della sequenza a varia da ceppo a ceppo in un

intervallo dalle 700 alle 900 pb. I componenti L e S possono essere invertiti l’uno

rispetto all’altro, dando origine a quattro isomeri equimolari ed indipendenti

designati come P (prototype), IL (inversion of the L component), IS (inversion of

the S component) e ISL (inversion of both S and L component).

HCMV è in grado di codificare più di 200 proteine (Becker et al., 1968), di cui 70

sono conservate nel genoma di tutti i β herpesvirus. Tra i più importanti geni

conservati vi sono i geni precocissimi maggiori UL122 e UL123, coinvolti nella

regolazione dell’espressione genica, i geni precocissimi minori UL36 e UL37 che

codificano soppressori della morte cellulare, i geni regolatori precoci UL112-

UL113 e i trascritti della latenza. Il fatto che molti prodotti genici siano conservati

in tutta la famiglia Herpesviridae spiega le comuni modalità di replicazione virale.

Il ceppo di laboratorio AD169 contiene circa 150 ORF codificanti proteine, di cui

41 essenziali, 88 non essenziali e 27 in grado di aumentare la capacità replicativa

del virus nei fibroblasti (Shenk et al., 2003). Nel virione il DNA è impacchettato a

forma di toroide e va a costituire il core. Dopo l’ingresso del virus nelle cellule, in

assenza di sintesi proteica, le porzioni terminali del genoma sono probabilmente

in stretta prossimità, o addirittura legate insieme in forma di DNA circolare. Come

per gli altri membri della famiglia, il virione consiste di quattro elementi (Figura

1.2.2):

a) un core icosaedrico elettron-opaco, noto anche come nucleocapside;

19

_______________________________________________________________________________

b) un capside circondante il core, in cui le proteine virali formano 162

capsomeri (150 esoni e 12 pentoni), che arrangiano in una struttura

icosaedrica di 125 nm. Le 6 proteine che lo compongono sono: la proteina

capsidica maggiore (MCP) prodotto del gene UL86, la proteina capsidica

minore (mCP o TR11) codificata dal gene UL85, la proteina che lega la

proteina capsidica minore (TR12 o mC-BP, UL46), la più piccola proteina

capsidica (SCP, UL48-UL49), la proteina PORT (UL104), che costituisce

uno speciale pentone usato per la scapsidazione del DNA virale e UL80,

che è coinvolta nell’assemblaggio del capside.

c) uno strato proteico amorfo circondante il capside, il tegumento o matrice,

costituito da almeno 35 proteine virali (Kalejta, 2008; Tabella 1.2.1),

alcune proteine cellulari e molecole di RNA;

d) un rivestimento esterno detto pericapside o envelope lipidico, che

incorpora le glicoproteine virali (almeno 20) e alcuni componenti cellulari

(Mocarski et al., 2007, Tabella 1.2.1).

Figura 1.2.2 HCMV umano e principali strutture che lo costituiscono (Rechke et al., 1997). Le cellule infettate da HCMV generano tre tipi di particelle virali: l’1% è

costituito da progenie infettiva matura, mentre il 99% consiste di virioni non

infettivi, comprendenti particelle provviste di envelope non infettive (non-

infectious enveloped particles, NIEP) e per più del 50% da corpi densi (dense

bodies, DB). La quantità reciproca di questi tre differenti tipi di particelle dipende

dal ceppo virale e dalla molteplicità d’infezione (m.o.i.) (Reddehase, 2006;

Mocarski et al., 2007). I tre tipi di particelle possono essere separati sulla base di

differenze fisiche per sedimentazione in gradiente di densità. Le NIEP sono

composte dalle stesse proteine virali dei virioni infettivi e possiedono un capside,

ma mancano del DNA virale. In microscopia elettronica possono essere distinte

20

_________________________________________________________________Introduzione

dalle particelle infettive per la mancanza di un core di DNA elettron-denso

(Reddehase, 2006). I DB sono particelle più eterogenee per dimensioni provviste

di tegumento e envelope ma mancanti del DNA virale e del capside e, pertanto,

non replicative ma competenti per la fusione. Essi hanno una composizione

differente per contenuto di proteine del tegumento, con una prevalenza della

proteina pp65 (UL83) (Figura 1.2.3; Irmiere and Gibson, 1983; Streblow et al.,

2006).

Figura 1.2.3 Microscopia elettronica di virioni di HCMV e DB. Ingrandimento 8400X. (Varnum et al., 2004).

Viral protein HCMV ORF Viral protein HCMV ORF Viral protein HCMV ORF

Capsid UL46 (mC-BP) Glycoproteins RL10 Transcription- IRS1

UL48-49 (SCP) TRL14 replication TRS1

UL80 UL4 (gp48) Machinery US3

UL85 (mCP) UL5 UL36

UL86 (MCP) UL22A UL37

UL104 (PORT) UL33 UL44

Tegument UL23 UL38 UL45

UL24 UL41A UL51

UL25 UL50 UL54

UL26 UL55 (gB) UL57

UL32 (pp150) UL73 (gN) UL69

UL47 (LTPbp) UL74 (gO) UL72

UL48 (LTP) UL75 (gH) UL84

UL50 UL77 UL89

UL53 UL93 UL97

UL71 UL100 (gM) UL122 (IE1)

UL76 UL115 (gL) UL123(IE2)

UL82 (pp71) UL119 Uncharacterized UL35

UL83 (pp65) UL132 UL79

UL94 US27 UL88

UL99 (pp28) US28 UL96

US22 TRL10 UL103

US23 TRL12 UL112

US24

Tabella 1.2.1 Proteine codificate da HCMV (Reddehase, 2006).

21

_______________________________________________________________________________

1.3 Ciclo replicativo

Sono noti diversi ceppi di HCMV: AD169, Towne, Davis, Toledo e Merilyn. Il

virus replica in molti diversi tipi cellulari nell’uomo e in particolare cellule

endoteliali ed epiteliali, fibroblasti e cellule muscolari liscie (Sinzger et al., 2008).

Tuttavia la maggior parte dei ceppi di laboratorio ha perso la capacità di infettare

cellule diverse dai fibroblasti, per cui gli studi classicamente sono effettuati in

fibroblasti primari o secondari, un tipo di cellule stromali derivate da ogni tipo di

tessuto. La replicazione in cellule diverse richiede l’utilizzo di ceppi virali che

mantengano le caratteristiche di isolati clinici. Differenze geniche e nella modalità

di replicazione sono iniziate ad emergere usando diversi tipi di cellule primarie

come cellule vascolari endoteliali, cellule mieloidi (macrofagi e cellule

dendritiche) e cellule epiteliali della retina. Il seguente paragrafo descrive il ciclo

replicativo di HCMV nei fibroblasti.

Rispetto agli α herpesvirus, i β herpesvirus replicano molto più lentamente. Il

HCMV richiede 48-72 ore per completare il ciclo replicativo (Mocarski et al.,

2007). L’infezione inizia con l’interazione di componenti virali con la superficie

cellulare (WuDunn and Spear, 1989); la fusione del pericapside con la membrana

consente l'ingresso del virus nella cellula. I due eventi iniziali, ossia l'attacco alla

superficie cellulare e la fusione pH indipendente del pericapside virale con la

membrana plasmatica, coinvolgono l’envelope virale e le sue glicoproteine

(Isaacson and Compton, 1993). Una volta penetrato nella cellula, il capside,

privato del rivestimento esterno, è trasportato ai nucleopori, dove il DNA è

rilasciato nel nucleo, grazie all’intervento di alcune proteine virali (Batterson et

al., 1983). Probabilmente sono i microtubuli del citoscheletro a mediare il

trasporto dei capsidi fino ai nucleopori (Döhner and Sodeik, 2004). Alcune

proteine del tegumento, inclusa pp65, sono traslocate al nucleo (Kalejta, 2009). Il

DNA si accumula nel nucleo, dove avvengono la trascrizione, la replicazione e

l’assemblaggio di nuovi capsidi. Appena l’acido nucleico vi è penetrato, anche in

assenza di sintesi proteica, la RNA polimerasi II dell’ospite, in associazione con

altre proteine cellulari e con proteine virali, trascrive alcuni geni virali (geni α o

immediate early, IE), producendo una serie di proteine dette precocissime. La

sintesi delle proteine di tutti gli herpesvirus è rigidamente controllata e coordinata,

in modo tale che le proteine abbiano la stessa cinetica e le stesse esigenze di

22

_________________________________________________________________Introduzione

sintesi. I gruppi proteici sono trascritti in modo sequenziale con effetto a cascata.

Come avviene per altri virus a DNA è possibile distinguere tre categorie di geni, a

loro volta divisi in sottoclassi, a cui corrispondono tre tipi diversi di proteine:

1) I geni α o precocissimi (IE), che mappano in diversi siti in UL o US e nelle

regioni IRS oTRS e sono i primi ad essere espressi immediatamente dopo l’entrata

e senza che siano richiesti altri geni. La loro principale funzione è l’attivazione

della trascrizione dei geni precoci, ma alcune proteine precocissime intervengono

anche in alcune fasi finali della replicazione virale. La maggior parte dei geni

precocissimi subisce splicing, mentre i precoci e i tardivi rimangono unspliced.

Sono state mappate nel genoma di HCMV quattro regioni di geni IE: UL36 e

UL37, IE1 e IE2 (UL122 e UL123), TRS1 e IRS1, e US3. Ognuna di queste

codifica diversi trascritti e proteine. IE1 (p72) e IE2 (p86) sono altamente

conservati nei β herpesvirus. Oltre a regolare l’espressione genica, IE1 sopprime il

signaling di STAT (signal transducer and activator of transcription), che attiva

l’interferone (IFN), mentre IE2 induce l’arresto del ciclo cellulare.

2) I geni β o precoci (early, E), che non sono espressi in assenza di proteine α

attive. La loro espressione inizia 6 ore dall’infezione e continua fino a 18-24 ore.

Funzionano principalmente nella replicazione del DNA, nella produzione di

substrati per la sintesi del DNA e nella maturazione del capside (Mocarski et al.,

2007). Gli herpesvirus hanno la peculiarità di possedere una alto numero di geni

in grado di codificare autonomamente enzimi e proteine necessari alla loro

replicazione, come enzimi per il metabolismo degli acidi nucleici (timidilato

sintetasi, dUTPasi, ribonucleotide reduttasi), enzimi per la relicazione (DNA

polimerasi, elicasi, primasi) e protein-chinasi. Complessivamnte almeno 23 geni

β sono essenziali per la replicazione, altri invece non sono indispensabili ma

intervengono nella modulazione delle risposte cellulari e dell’ospite all’infezione.

I geni β sono ulteriormente classificati in β1 e le β2, in base ai tempi di

attivazione e repressione trascizionali. I β1 comprendono il gene UL112-UL113,

che codifica 4 fosfoproteine (pp34, pp42, pp50, pp84) risultato di uno splicing

alternativo e che formano un complesso che contribuisce a iniziare la replicazione

del DNA. Tra i β2 vi è UL54 che codifica per la DNA polimerasi. La DNA

polimerasi UL54 è il target degli attuali farmaci anti-HCMV approvati. Consiste

di 8 domini catalitici (Wong et al., 1988) ed è caratterizzata, grazie al suo dominio

23

_______________________________________________________________________________

esonucleasico e alla funzione di proofreading, da un basso tasso di errore

(2x108/pb) (Dressman et al., 1997).

Altre proteine espresse a partire da geni β comprendono:

la proteina polimerasica accessoria (UL44), la single stranded DNA binding

protein (UL57), le tre subunità del helicase-primase complex (UL70, UL102 e

UL105) (Mercorelli et al., 2008), UL4, che codifica la glicoproteina dell’envelope

gp48 la cui funzione non è nota e molte proteine del tegumento (pp65, pp150,

pp71, pp48). Un importante prodotto di un gene β è UL69, l’omologo di ICP27 di

HSV-1, che, similmente a quest’ultimo, lega il RNA ed è traslocato dal

citoplasma al nucleo, contribuendo alla regolazione del trasporto del RNA.

Il passaggio dalla fase precoce a quella tardiva avviene dalle 24 alle 36 ore

dall’infezione, mentre i massimi livelli di rilascio virale iniziano tra le 72 e le 96

ore.

3) I geni γ o tardivi (late, L), che per la maggior parte codificano componenti

strutturali del virus, come le glicoproteine o le proteine del capside (Mocarski et

al., 2007). Sono divisi in due gruppi: γ1 e γ2. La loro espressione, soprattutto dei

geni γ2, è inibita bloccando la sintesi del DNA.

La regolazione della trascrizione genica degli herpesvirus è un fenomeno molto

complesso, non ancora totalmente compreso e basato su una serie di eventi

rigidamente controllati. Essa si verifica a più livelli:

a) trascrizionale, grazie all’interazione tra sequenze agenti in cis del genoma

virale e fattori trascrizionali sia cellulari che virali che formano il complesso di

inizio trascrizione insieme alla RNA polimerasi II. Nel genoma di HCMV sono

presenti diverse regioni con questa funzione attive a diversi tempi nel corso

dell’infezione. Tra queste le meglio caratterizzate sono:

il major intermediate-early promoter enhancer (MIEP), una larga

porzione genomica di più di 1 Kb che controlla la trascrizione dei geni IE1

e IE2 subito dopo l’entry, ma che potrebbe avere un ruolo anche nella

latenza e nella riattivazione. Infatti potrebbe funzionare da origine di

replicazione nella latenza per mantenere il genoma in cellule progenitrici

ematopoietiche in attiva divisione. Alcune proteine del tegumento

influenzano le prime fasi dell’infezione regolando l’attività di MIEP. Tra

24

_________________________________________________________________Introduzione

queste principalmente pp71, ma anche UL26 o altre vie di trasduzione del

segnale attivate dal virus o da altri fattori (ad esempio fattori di crescita);

il minor enhancer promoter che controlla la trascizione del gene IE US3,

particolarmanete forte in cellule differenziate e represso nelle cellule non

differenziate.

b) post-trascrizionale, mediante il processamento degli mRNA ed il loro trasporto

dal nucleo al citoplasma.

c) traduzionale, per interazione degli mRNA con proteine cellulari e virali.

La replicazione del genoma di HCMV avviene secondo un meccanismo a "cerchio

rotante", con conseguente formazione di concatameri (Sears and Roizman, 1990).

Le origini di replicazione del genoma di HCMV vengono definite come quelle

sequenze necessarie in un frammento di DNA virale affinché esso, una volta

trasfettato in cellule permissive, possa essere amplificato ad opera della DNA

polimerasi virale. Il DNA concatamerico virale neosintetizzato è stabilizzato da

proteine virali e viene scisso in corrispondenza di sequenze di riconoscimento

specifiche; si ottengono così genomi di lunghezza completa ad estremità libere.

Anche il processo di assemblaggio del capside è comune a quello degli altri

herpesvirus ed inizia con la formazione di un procapside grazie a 6 conservate

proteine capsidiche: MCP, TR11, TR12, SCP, PORT e UL80. Una volta che la

sintesi del DNA è completa, i genomi vengono inseriti nei capsidi preformati

(packaging). 10 proteine virali intervengono in questa fase e tra queste UL93,

UL51, UL52 UL77, UL104, ma anche la proteina chinasi VPK (UL97) e alcune

chinasi cellulari. Una volta che il packaging del DNA è completo, i nucleocapsidi

sono traslocati attraverso la membrana nucleare nel citoplasma, dove hanno luogo

le fasi maturative finali.

1.4 Fasi di maturazione e gemmazione del virione di HCMV

Il processo di acquisizione del pericapside ed il meccanismo di gemmazione della

particella virale dalla cellula ospite rimangono le fasi più controverse del ciclo

replicativo degli herpesvirus. Per quanto riguarda la maturazione del virione e

l’uscita dalla cellula ospite sono stati proposti negli anni modelli alternativi, ma

attualmente il modello di envelopment a due tappe risulta quello più largamente

accettato. Questo modello prevede che il virione presente nello spazio

25

_______________________________________________________________________________

periplasmatico e che ha acquisito l’envelope “primario” a livello della membrana

nucleare interna fonda con la membrana nucleare esterna con conseguente perdita

dell’envelope “primario” e rilascio del capside nel citoplasma. Secondo questa

teoria l’assemblaggio delle proteine del tegumento e delle glicoproteine virali

avverrebbe in compartimenti citoplasmatici non esattamente identificati ma

comprendenti probabilmente membrane di diversa origine ed in particolare

compartimenti endosomiali e le vescicole del trans-Golgi network (TGN)

(Stackpole, 1969; Jones and Grose, 1988; Zhu et al., 1995; Skepper et al., 2001;

Mettenleiter, 2002; 2004; 2006). La teoria del two-step envelopment è stata

recentemente supportata sia da studi di microscopia elettronica sia di carattere

biochimico condotti su virioni isolati dallo spazio perinucleare e dal citoplasma.

Tali analisi hanno, infatti, evidenziato diversità in contenuto proteico, morfologia

e composizione lipidica del pericapside fra le particelle virali presenti nei due

compartimenti cellulari durante l’infezione e che componenti delle particelle con

envelope primario sono assenti nei virioni maturi (Van Genderen et al., 1994;

Granzow et al., 2001).

Figura 1.4.1 Ciclo replicativo di HCMV. Sono schematizzate le fasi di ingresso, replicazione e

trascrizione del genoma virale, maturazione ed uscita del virus dalla cellula ospite con il modello

attualmente più accreditato del “envelopment a due tappe” (Mocarski et al., 2001).

26

_________________________________________________________________Introduzione

Per HCMV acquisizione del tegumento ed envelopment secondario avvengono in

un caratteristico compartimento che si forma durante l’infezione, localizzato a

ridosso del nucleo e noto come assembly complex o assembly compartment (AC)

(Figura 1.4.2). L’AC è una larga struttura circolare generalmente presente una per

ogni cellula infettata anche in sincizi contenenti più di 10 nuclei, strettamente

associata al nucleo e al microtubule organizing center (MTOC). Questo

compartimento è stato osservato in fibroblasti primari, cellule endoteliali e cellule

muscolari liscie. Il nucleo in parte va ad avvolgere l’AC e assume pertanto una

forma simile a quella di un rene. Nell’AC i nucleocapsidi provvisti di tegumento

gemmano all’interno di vescicole di origine cellulare contenenti le glicoproteine

virali. Le vescicole contenenti i virioni sono poi trasportate alla membrana

plasmatica e rilasciate dalla cellula in seguito alla fusione della membrana delle

vescicole con la membrana plasmatica (esocitosi) (Mocarski et al., 2007).

Evidenze di microscopia elettronica indicano che l’AC è formato da anelli

concentrici di vescicole originate da differenti compartimenti appartenenti al

pathway biosintetico-secretorio, come l’apparato del Golgi, TGN e gli EE

(endosomi precoci) (Das et al., 2007). La formazione dell’AC è dipendente

dall’espressione di una o più proteine virali tardive. In questo compartimento sono

reclutate molte proteine del tegumento (pp28, pp150), proteine dell’envelope

(gM/gN, gB), ma anche proteine non strutturali e proteine cellulari: golgina-97,

EEA-1 (early endosomal antigen-1), mannosidasi-II, GM130, p230, Bip/Grp78

(glucose regulated protein 78). La sua formazione, pertanto, è un processo

dinamico e determina un progressivo rimodellamento e una profonda

riorganizzazione del citoplasma delle cellule infettate. Gaspar e Shenk hanno

evidenziato che la proteina Chk2 (checkpoint kinase 2) che controlla il ciclo

cellulare e normalmente espressa nel nucleo, rilocalizza a livello dell’AC durante

l’infezione (Gaspar and Shenk, 2006). Il modello di Pellet riguardo la

composizione e la struttura dell’AC prevede che le vescicole degli EE siano

trasportate nel centro dell’AC, positivo per marker degli EE come EEA-1, e che

intorno a questa area centrale si disponga un anello intermedio contenente le

membrane del TGN, circondato a sua volta da componenti dell’apparato del

Golgi. Componenti del reticolo endoplasmatico (RE) rimangono, invece, al di

fuori dell’AC (Das et al., 2007, Figura 1.4.2).

27

_______________________________________________________________________________

Figura 1.4.2 Struttura dell’assembly complex di HCMV secondo il modello di Pellet (Das et

al., 2007).

1.5 Il tegumen o t

Il tegumento o matrice è definito come la regione localizzata tra il capside e il

pericapside e comprende un elevato numero di proteine virali, proteine cellulari e

anche molecole di RNA virali e cellulari. Delle 71 proteine virali inglobate nei

virioni infettivi più di metà sono proteine del tegumento. Alcune proteine del

tegumento sono uniche per i β herpesvirus, altre sono omologhe a proteine degli

α herpesvirus. La sua acquisizione è un processo molto complesso che richiede il

reclutamento e l’interazione tra molte proteine virali, similmente a quanto

descritto per HSV-1 (Mettenleiter, 2004). Inoltre, studi recenti hanno sottolineato

come questa componente strutturale, per lungo tempo considerata una struttura

amorfa, sia, invece, fondamentale per l’integrità della particella virale, in quanto

risultato di una complessa rete di interazioni proteina-proteina (Mettenleiter,

2002). Il tegumento presenta, infatti, una complessa e strutturata organizzazione e

può essere suddiviso in due strati: lo strato più interno (inner tegument) e quello

più esterno (outer tegument). Le proteine dello strato più interno interagiscono

fortemente con le proteine del capside, mentre quelle dello strato esterno giocano

28

_________________________________________________________________Introduzione

un importante ruolo per le loro interazioni con le porzioni citoplasmtiche delle

glicoproteine del pericapside. Queste interazioni sono importanti per

l’acquisizione dell’envelope finale e assicurano l’integità della particella virale.

Negli ultimi anni, però, sono emerse molteplici altre funzioni delle proteine del

tegumento: regolazione dell’espressione genica, evasione del sistema immunitario

(Scalzo et al., 2007), rilascio del DNA virale nel nucleo (Bechtel and Shenk

2002), inizio e regolazione del ciclo replicativo virale (Bresnahan and Shenk

2000), Hurley, 2008), morfogenesi e arresto del ciclo cellulare. La maggior parte

delle proteine del tegumento sono fosforilate e altamente immunogeniche. La loro

fosforilazione potrebbe facilitare la loro associazione stabile e l’incorporazione

nel virione.

In base alla loro principale funzione possiamo classificare le proteine del

tegumento come segue (Kalejta, 2008):

o Entrata: UL48 e UL47

o Espressione genica: pp71, ppUL35, ppUL69

o Evasione della risposta immune: pp65, pIRS1/pTRS1

o Assemblaggio e uscita: ppUL97, pp150, pp28

o Entrata

La large tegument protein (LTP, UL48), poli-proteina dello strato interno del

tegumento, è il prodotto genico di maggiori dimensioni codificato dal genoma di

HCMV (253 kDa) e per questo è anche chiamata high molecular weight protein. È

ampiamente conservata nella famiglia Herpesviridae (Chee et al., 1990), ma

rispetto ai dati riportati in letteratura sul suo omologo in HSV-1 UL36 la precisa

funzione di UL48 rimane controversa. Sembra essenziale per la replicazione virale

(Shenk et al., 2003). Interagisce con MCP, UL47 e UL69 (Shenk and Bechtel,

2002) e con la proteina del RE p180 (Ogawa-Goto, 2002). Come per UL36, anche

il processamento proteolitico dell’estremità N-terminale di UL48 produce un

enzima ad attività deubiquitinasica (DUB domain) (Wang et al., 2006). Possibili

ruoli di questo dominio potrebbero essere deubiquitinare le proteine virali per

prevenirne la degradazione nel proteosoma e favorire l’assemblaggio dei virioni, o

promuovere l’interazione della particella virale con le proteine coinvolte nel

pathway di secrezione dei multivesicular body (MVB) (Kattenhorn et al., 2005;

Schlieker et al., 2005; Kalejta, 2008).

29

_______________________________________________________________________________

La LTP binding protein (LTPbp, UL47), che interagisce con MCP, UL69 e UL48.

Aumenta traduzione e stabilità di UL48 e la sua delezione comporta accumulo

intracitoplasmatico di nucleocapsidi, perdita di infettività e della capacità di

diffusione cellula-cellula e difetti di crescita virale. Potrebbe avere un ruolo simile

a quello dell’omologo negli α herpesvirus UL37 nella scapsidazione, nel trasporto

intracellulare durante la morfogenesi, nell’assemblaggio del tegumento e

nell’envelopment secondario.

o Espressione genica

pp71 (UL82), fosfoproteina di 71 KDa con funzione di transattivatore virale,

stimolando l’enhancer MIEP, in maniera più efficiente se in complesso con la

proteina del tegumento UL35. È, pertanto, usata anche in vitro per incrementare

l’efficienza di trasfezione del DNA virale. La sua delezione comporta severi

difetti della crescita virale. Tra i meccanismi con cui attiva l’espressione genica vi

è il suo legame nel nucleo con la proteina Daxx, che, reclutata a livello dei

promotori da vari fattori di trascrizione, funziona da repressore trascrizionale.

Inoltre, pp71 promuove anche, attraverso la degradazione dei soppressori tumorali

della famiglia Rb (retinoblastoma), la progressione dalla fase Go alla S.

ppUL35, trascritta nelle due forme UL35 e UL35a. La prima rappresenta la forma

incorporata nel tegumento di virioni e DB, mentre la seconda rappresenta gli

ultimi 193 aminoacidi dell’estremità C-terminale del trascritto completo.

Entrambe le forme interagiscono con pp71, accelerando l’inizio della trascrizione

dei geni IE. Nell’assemblaggio promuove l’uscita dal nucleo insieme ai capsidi di

pp71 e pp65 e la loro incorporazione nel tegumento.

ppUL69, fosfoproteina nucleare precoce (Bresnahan and Shenk, 2000) coinvolta

nell'induzione dell’arresto del ciclo cellulare nella fase G1 (Lu and Shenk 1999),

nella transattivazione dell’espressione dei geni IE (Winkler et al., 1994) e

nell’esporto di RNA nucleari unspliced verso il citoplasma. La sua delezione

causa un ritardo della crescita virale nei fibroblasti. Forma un complesso con le

proteine del tegumento UL47, UL48, MCP (Bechtel and Shenk, 2002) e pp65

(Chevillotte et al., 2009).

30

_________________________________________________________________Introduzione

o Evasione della risposta immune

pp65 (UL83), la più abbondante (15% in abbondanza) proteina del tegumento,

(Irmiere and Gibson, 1983) e l’antigene rilevato nei saggi di antigenemia. A valle

della fusione è trasportata nel nucleo. È coinvolta nell’evasione della risposta

immunitaria adattativa ed innata (Arnon et al., 2005; Gilbert et al., 1996) grazie

alla sua attività chinasica, che previene la presentazione al MHC-I di varie

proteine IE. Attenua anche la risposta all’IFN. La sua capacità di fosforilare le

proteine è determinata da un’attività endogena (Yao et al., 2001; Kalejta, 2009)

e/o dalla sua interazione con chinasi cellulari o con la chinasi virale ppUL97

(Gallina et al., 1999; Kamil and Coen, 2007). Non è essenziale per la replicazione

nei fibroblasti, ma lo è per la formazione dei DB. La sua delezione compromette

l’incorporazione di ppUL69 e ppUL97 e parzialmente di UL25 (Chevillotte et al.,

2009).

pIRS1 e pTRS1, proteine precoci espresse all’interno della famiglia genica US22,

che comprende in tutto 12 prodotti genici, 9 dei quali codificano proteine del

tegumento (UL23, UL24, UL36, UL43, US22, US23, US24, IRS1 e TRS1). Non è

noto se i restanti 3 componenti della famiglia (UL28, UL29, e US26) siano

proteine strutturali, ma sono coinvolte nella replicazione del DNA virale. pIRS1 e

pTRS1 bloccano la sintesi proteica virale, prevenendo la fosforilazione di fattori

cellulari coinvolti nella sintesi proteica e della RNAsi L, che sono attivati come

risposta antivirale dell’immunità innata. La delezione di TRS1 determina

l’alterazione dell’accumulo del DNA virale nel nucleo e del packaging.

o Assemblaggio e uscita

La protein chinasi VPK o pp97 (UL97), proteina precoce localizzata nel nucleo

(van Zeijl et al., 1997) con capacità di autofosforilarsi e di fosforilare altre

proteine virali e cellulari (Kawaguchi and Kato, 2003; Michel at al, 1998; Krosky

et al., 2003; Marschall et al., 2005; Hume et al., 2008). Fosforila, e quindi attiva,

anche il farmaco antivirale Ganciclovir (GCV) (Sullivan et al., 1992). Interagisce

con pp65 (Kamil and Coen 2007), che è necessaria per la sua incorporazione nelle

particelle virali (Chevillotte et al., 2009). Mutazioni a suo carico, come e anzi più

frequentamente che per la polimerasi pp54, sono associati alla farmaco-resistenza.

Circa il 90% dei casi di resistenza al GCV sono attribuiti ad alterazione di pp97

(Chou, 2001). Possiede una’attività chinasica ciclina dipendente che stimola la

31

_______________________________________________________________________________

progressione del ciclo cellulare, legando e fosforilando la proteina Rb. La sua

inattivazione porta alla formazione di inclusioni nucleari che consistono

principalmente di pp65 e pUL25 e a difetti di assemblaggio e uscita.

pp150 (UL32), grossa fosfoproteina altamente immunogenica. È la seconda

proteina del tegumento per abbondanza e lega la superficie del capside assemblato

ed in particolare la MCP, contribuendo all’esatta localizzazione e alla stabilità dei

nucleocapsidi. Questa associazione inizia nel nucleo e prosegue nel sito di

assemblaggio del virione a livello delle inclusioni citoplasmatiche dove pp150

accumula e dove svolge una funzione chiave nelle fasi finale della maturazione

virale. Recentemente è stato dimostrato che pp150 interagisce con le proteine del

capside UL46, UL85 e UL80.5 e quelle del tegumento UL48, TRS1, UL69,

UL97, UL25 e US22 (Moorman et al., 2009).

pp28 (UL99), fosfoproteina altamente immunogenica, che prende contatto con

l’envelope virale e con le membrane cellulari attraverso la miristilazione della

Gly2 e viene esposta al lato citosolico della membrana in seguito a fusione

dell'evelope virale. Sia il residuo miristilato sia un cluster acido (AA 44-59) sono

richiesti per la sua corretta localizzazione e incorporazione nei virioni. La sua

delezione causa un completo blocco della maturazione virale con l’accumulo nel

citoplasma di capsidi rivestiti dal tegumento e di altre di proteine del tegumento e

glicoproteine nell’AC.

Altre proteine del tegumento comprendono:

UL71, proteina strutturale precoce (Varnum et al., 2004) di circa 48 kDa, omologa

alla proteina UL51 degli α herpesvirus (Bankier et al., 1991; Baumeister et al.,

1995; Lenk et al., 1997) e a BSRF1 del EBV (Johannsen et al., 2004). Non è

essenziale per la replicazione virale (Dunn et al., 2003), sebbene l’introduzione di

un codone di stop al N-terminale determini l’accumulo di nucleocapsidi privi di

envelope nel citoplasma delle cellule infettate, una diminuzione del titolo virale

rilasciato a livello extracellulare e difetti nella diffusione cellula-cellula. I primi

34 aminoacidi all’astremità N-terminale comprendenti due siti di palmitoilazione

costituiscono il segnale di co-localizzazione con le membrane del TGN. Viene

reclutata all’AC a precoci e tardivi stadi di infezione ma distribuisce in tutto l’AC,

diversamente da altre proteine virali (pp28, pp150, gB) che accumulano

32

_________________________________________________________________Introduzione

nell’anello dell’AC positivo per le particelle virali infettive (comunicazione orale

Daniela Fischer e Jens von Einem).

ppUL25, proteina di 85 kDa non essenziale e altamente immunogenica, la cui

funzione nella morfogenesi virale rimane ancora da chiarire. È reclutata all’AC

dove colocalizza con pp28 (Battista et al., 1999) ed è incorporata nel virione in

forma fosforilata (Battista et al., 1999). La sua fosforilazione potrebbe dipendere

da pp65, direttamente o dalle chinasi associate a pp65 pUL97 e Plk1.

UL26, componente minore del tegumento, membro della famiglia US22, richiesta

per la replicazione virale. Virus mutati in questa proteina precoce presentano una

minore sintesi dei geni IE e decrementata stabilità di pp28, dovuta all’alterazione

dello stato di fosforilazione di questa proteina e forse di altre proteine del

tegumento.

UL45, proteina precoce che accumula solo dopo la replicazione del DNA virale e

presenta una significativa omologia con la subunità maggiore della ribonucleotide

reduttasi, sebbene manchi di residui con attività catalitica. La sua funzione non è

ancora stata elucidata, ma mutanti virali in questa proteina hanno difetti di crescita

soprattutto ad alte m.o.i..

UL76, proteina tardiva strutturale non essenziale che nel nucleo regola

l’espressione genica virale.

UL94, componente essenziale del virione, espressa nel nucleo a tardi tempi di

infezione come dimero associato da ponti di solfuro. La sua funzione non è chiara

ma contiene un dominio di legame al DNA.

US24, proteina precoce non essenziale la cui delezione causa difetti della crescita

virale con la riduzione dell’espressione di pp28 e in misura minore di UL44.

UL36 e UL38, coinvolte nell’inibizione dell’apoptosi.

Componenti minori del tegumento comprendono:

UL44 (fattore di processività della DNA polimerasi), UL51 e UL89 (componenti

della terminasi), UL54 (DNA polimerasi), UL57 (single-stranded DNA binding

protein), UL72 (omologo della dUTPasi), UL79, UL84 (coinvolta nella

replicazione del DNA), UL88, UL96, UL103, UL104 (PORT) e UL112.

33

_______________________________________________________________________________

1.6 Ruolo delle glicoproteine nel ciclo di replicazione

L’ingresso del virione nella cellula bersaglio richiede l’interazione tra varie

glicoproteine virali ed i recettori cellulari presenti sulla membrana citoplasmatica.

Sia l'attacco di HCMV alla superficie cellulare sia la successiva fusione

dell’envelope con la membrana citoplasmatica sono eventi mediati dalle

glicoproteine virali. L'envelope degli herpesvirus ha una composizione proteica

complessa che ha reso difficile lo studio di questi meccanismi. HCMV codifica

più di 50 proteine potenzialmente glicosilate o contenenti domini

transmembranari (TM). Le glicoproteine di HCMV assemblano in tre complessi,

tutti fondamentali per l'ingresso del virus nelle cellule bersaglio d'infezione:

gcI (glycoprotein complex I), che contiene omodimeri di gB

(UL55);

gcII che contiene gM/gN (UL100/UL73), complesso necessario nella

fase di entrata, diversamente da quello che accade per altri herpesvirus;

gcIII che contiene gH/gL (UL75/UL115) (in alcuni complessi con

gO (UL74) e con UL128, UL130 e UL131, ma che sembrano necessarie

per la fusione solo in particolari ospiti cellulari).

L’ingresso prevede vari eventi sequenziali:

attacco mediato dal legame con specifici recettori cellulari

fusione dell’envelope con la membrana cellulare

penetrazione e rilascio dei nucleocapsidi nel citoplasma

associazione del nucleocapside coi pori nucleari

rilascio del genoma virale nel nucleo

Attacco

L’attacco della particella virale alla superficie cellulare è mediato dal legame di

gB e del complesso gM/gN ai proteoglicani di eparansolfato. L’eparansolfato è un

glicosaminoglicano ampiamente diffuso, relativamente conservato nel pathway di

entrata di molti herpesvirus e che permette al virus di legare molti tipi cellulari,

anche quelli dove il virus non replica attivamente. Altre molecole riconosciute

sono il dermatansolfato e il condroitinsolfato, che vengono legate da alcuni

domini di gB (Herold et al., 1991; 1994).

gM (UL100, 42 KDa) è la proteina più abbondante dell’envelope virale (5 volte

più abbondante di gB) e costituisce il 10% dell’intera massa virale. E’ una

34

_________________________________________________________________Introduzione

glicoproteina N-glicosilata di tipo III con 7 domini TM, non conservata rispetto

agli altri herpesvirus. gM richiede gN (UL73) per essere reclutata nel RE dove le

due proteine interagiscono. Il complesso è necessario per la corretta formazione

del virus maturo. Poiché il livello di gN è solo l’1% rispetto a quello di gM,

questo implica che quest’ultima sia presente in larga maggioranza in forma libera,

non legata nel complesso gM/gN. gM contiene nella coda il motivo ricco di

tirosine YQAL e un cluster particolarmente acido (12 residui acidi). In trasfezione

ed infezione gM/gN colocalizza con AP-1 (adaptor protein-1), Rab7 e CD63

(marker dei MVB/late endosomes, LE) e gB, che a sua volta colocalizza con gli

stessi marker di TGN e MVB/LE, favorendo l’ipotesi di un trafficking comune

delle due glicoproteine. La delezione dell’intera coda terminale di gM determina

l’assemblaggio di virioni non infettivi per difetti di localizzazione del complesso

gM/gN all’AC. Le delezioni, invece, del motivo YQAL e del cluster acido,

singolarmente e accoppiate, determinano una velocità di trasporto all’AC di

gM/gN più bassa. I virioni sono vitali ma con difetti in replicazione. I motivi,

quindi, sono coinvolti nel trafficking all’AC (Krzyzaniak et al., 2007). Negli

α herpesvirus, invece, la gM non interviene nell’entry, ma risulta fondamentale

nel passaggio del virus fra cellule adiacenti (cell-to-cell spread) (Krzyzaniak et

al., 2007), grazie all’interazione con i recettori a livello delle giunzioni cellulari.

Questo sistema di diffusione virale che avviene in vivo nei tessuti epiteliali e

neuronali è tipico degli herpesvirus. Le particelle virali neo-sintetizzate sono

veicolate in specifici domini della superficie laterale, quali le giunzioni e le

sinapsi, ed entrano in questo modo rapidamente in contatto con le cellule

adiacenti, propagando l’infezione ed eludendo il sistema immunitario (Jonhson et

al., 2001; Jonhson and Huber, 2002). Anche in HCMV le glicoproteine che

mediano l’ingresso del virus nella cellula bersaglio dell’infezione ed in particolare

gB e gM/gN sono richieste in questo processo e mutanti virali privi di queste

glicoproteine presentano una ridotta capacità di diffusione tra cellule adiacenti

(Krzyzaniak et al., 2007; Isaacson and Compton, 2009).

Fusione

L’associazione di gB e di gM/gN ai recettori cellulari innesca una cascata di

eventi che coinvolgono altri recettori e mediatori dell’entry, che portano alla

fusione fra l’envelope e la membrana cellulare. Le glicoproteine coinvolte nella

35

_______________________________________________________________________________

fusione tra l’envelope e la membrana citoplasmatica sono gH/gL e gB. gH/gL è un

eterodimero conservato in tutti gli herpesvirus. La gH di HSV-1 sembra utilizzare

un segmento fusogeno interno ed un tratto coiled-coil (CC) per svolgere un'azione

diretta nella fusione. In HCMV gH ha la stessa funzione ma il ruolo del tratto

fusogeno conservato non è stato analizzato. gH richiede gL come chaperone per

acquistare la conformazione strutturale corretta ed essere trasportata alla

superficie cellulare (Hutchinson et al., 1992). L’espressione del complesso gH/gL

in assenza di infezione induce la formazione di sincizi. Oltre che nella

penetrazione, gH, in HCMV così come in altri herpesvirus, ha un ruolo anche

nella diffusione cellula-cellula. Recentemente è stato dimostrato che gH lega

l’integrina αvβ3, che potrebbe essere un corecettore nell’entry di HCMV. In β e

γ herpesvirus il complesso gH/gL può essere modificato dal legame di altre

glicoproteine. Nei γ herpesvirus il complesso gH/gL lega la glicoproteina gp42

formando il trimero gH/gL/gp42, che determina l’attacco, la fusione e il tropismo

per i linfociti B e le cellule epiteliali. In HCMV oltre all’eterodimero gH/gL sono

stati identificati altri complessi: un eterotrimero contenente anche gO (UL74), che

aumenta l’efficienza di fusione di gH/gL, ma sembra solo modestamente nei

fibroblasti; un eterotetramero comprendente anche le proteine codificate da

UL128 e UL130 e un eteropentamero che incorpora insieme a gH/gL i prodotti

genici di UL128, UL130 e UL131. Questi complessi aumentano il tropismo di

ceppi clinici di CMV verso cellule epiteliali, endoteliali e dendritiche. In queste

cellule l’assenza o mutazioni a carico di questi geni permettono

l’internalizzazione del virus ma i geni IE non sono codificati e, pertanto, è

possibile la propagazione selettiva del virus solo nei fibroblasti.

HCMV codifica altre famiglie di glicoproteine minori non necessarie per la

replicazione nei fibroblasti e tra queste gli omologhi virali dei recettori accoppiati

a proteina G (GPCR) UL33, UL78, US27 e US28. Una particolare attenzione è

stata posta sul recettore per le chemochine CC/CX3C US28. Si tratta di un

recettore costitutivo molto forte. La sua attivazione indotta dal ligando attiva la

via di signaling mediata dalle protein chinasi, la β arrestina, Gα12 e RhoA,

inducendo l’apoptosi e la migrazione cellulare. Il suo ruolo a livello virale non è

completamente chiaro.

36

_________________________________________________________________Introduzione

Figura 1.6.1 Modello dell’entrata del HCMV nelle cellule bersaglio. (1) attacco (tethering),

mediato dal legame con i proteoglicani di eparansolfato (HSPG) attraverso le glicoproteine gM/gN

e/o gB. (2) fusione (docking), mediata dal complesso gH/gL e dal legame di gB con il recettore per

l’epidermal growth factor (EGFR) espresso sulla superficie di cellule permissive per HCMV o con

altri recettori nelle cellule ematopoietiche. Queste interazioni e anche il legame tra le glicoproteine

dell’envelope e le integrine promuovono la concentrazione dei recettori in microdomini

specializzati (receptor clustering), che facilita il signaling. Queste interazioni guidano alla fusione,

che determina l’internalizzazione dei componenti virali. (3) penetrazione ed eventi di trasduzione

del segnale (postattachemnt events), che sono attivati da EGFR e/o integrine e che innescano gli

eventi a valle (traslocazione del capside nel nucleo ed espressione del genoma virale). I toll-like

receptor (TLR) iniziano uno specifico pattern di eventi durante l’entrata del virus nella cellula, che

attiva le cascate di signaling e la risposta immunitaria innata (Compton et al., 2004).

Il processo di fusione richiede anche l'interazione di gB con recettori presenti sulla

membrana cellulare. Sono state identificate tre diverse tipologie di molecole che

possono legare gB (Spear et al., 2000): gli eterodimeri di integrina, i recettori per

l’EGF (EGFR, epidermal growth factor receptor) e il toll-like receptor 2 (TLR-2).

Le integrine di superficie sono recettori ubiquitari che una volta attivati portano

alla riorganizzazione del citoscheletro. È stato ipotizzato che sia l’interazione con

le integrine β2 a mediare l’attività fusogena di gB. L'interazione con le integrine

β1 è mediata dal suo disintegin-like domain (DLD) (Feire et al., 2004). Il legame

di gB al EGFR determina la fosforilazione del recettore e porta all’attivazione

della fosfatidilinositolo 3 chinasi (PI-3 kinase) e di Akt con il rilascio di calcio dai

depositi intracellulari. Tale interazione non è, però, stata confermata e recenti

pubblicazioni mostrano che HCMV inibisce la fosforilazione e il signaling del

EGFR. I mutanti in gB, gM/gN o gH/gL non sono in grado di infettare le cellule a

37

_______________________________________________________________________________

meno che non si fornisca un fattore “fusogeno” sostitutivo come il

polietilenglicole o la glicoproteina del virus della stomatite vescicolare (VSV-G)

(Anderson et al., 2000).

1.7 Il trafficking delle glicoproteine lungo il pathway endocitico e le molecole trasportatrici

Un efficiente envelopment richiede che tutti i componenti necessari a costituire

particelle infettive, nucleocapside, proteine del tegumento e glicoproteine, si

localizzino correttamente nel sito di budding. La biosintesi ed il trafficking delle

glicoproteine erpetiche avvengono secondo la modalità delle proteine glicosilate

nelle cellule eucariotiche, seguendo la via di trasporto vescicolare della cellula (il

pathway biosintetico-secretorio o endocitoco). Questo pathway, che non sembra

necessitare di particolari segnali di attivazione, è formato da vari compartimenti in

costante comunicazione attraverso vescicole di trasporto che continuamente

gemmano da una membrana e fondono in un’altra in un traffico altamente

organizzato. Le glicoproteine sintetizzate a livello del RE sono trasportate

nell’apparato del Golgi, dove acquisiscono il loro corretto folding e subiscono le

modifiche post-traduzionali. L’apparato del Golgi è localizzato nella cellula in

posizione paranucleare ed è formato da dittiosomi, strutture costituite a loro volta

da gruppi di sacche membranose appiattite a forma di dischi impilate le une sulle

altre, che prendono il nome di cisternae e usualmente presenti in numero tra 5 e 8.

Il numero e la forma dei sacculi dipende dal tipo di cellula. I sacculi presenti in

prossimità del nucleo sono detti inferiori o prossimali e costituiscono la regione

cis del dittiosoma. I sacculi che invece sono presenti in prossimità della superficie

cellulare sono detti superiori o distali e costituiscono la regione trans dello stesso

dittiosoma. Entrambe queste parti sono connesse a diversi compartimenti cellulari,

formando in questo modo una rete di tubuli e cisternae interconnessi. Le vescicole

entrano dal RE nel cis-Golgi e raggiungono poi il TGN, dove è completata la

glicosilazione proteica. Non è ancora chiaro se la glicosilazione delle proteine

virali richieda l’intervento di enzimi virus-specifici e non è esclusa la possibilità

che il genoma virale codifichi enzimi con funzione simile a quella degli enzimi

della cellula ospite. Le glicoproteine virali presentano sia le N- sia le O-

glicosilazioni, anche se quest’ultime sono meno frequenti. Le N-glicosilazioni

hanno un ruolo attivo nell’infettività virale; infatti, in seguito a trattamento con

38

_________________________________________________________________Introduzione

tunicamicina, in grado di legare e quindi bloccare i siti N-glicosilati, si osserva

l’accumulo di proteine virali glicosilate e di virus rivestiti dall’envelope nel

citoplasma cellulare (Ghosh-Choudhury et al., 1994). Il ruolo delle O-

glicosilazioni non è ancora noto.

Dal TGN le vescicole contenenti le glicoproteine mature sono trasportate alla

membrana plasmatica, dove le glicoproteine stimolano la risposta anticorpale da

parte del sistema immunitario, o ad altri organuli. Esiste anche una via retrograda,

particolarmente importante per il reciclo di specifiche proteine da alcuni organelli

e che prevede che esse siano trasportate dal trans-Golgi al cis-Golgi e da qui al

RE (Alberts et al., 2002).

Molte glicoproteine virali così come le proteine cellulari contengono dei motivi

caratteristici, che controllano l’endocitosi dalla membrana plasmatica ed il

trafficking lungo il pathway di secrezione, mediando l’interazione delle proteine

target con i complessi cellulari che regolano il trasporto delle proteine tra i vari

compartimenti cellulari. Tali motivi sono:

i motivi ricchi di tirosine YXXΦ (dove Φ rappresenta un qualsiasi aminoacido

idrofobico);

i motivi di dileucina (LL o LI);

il cluster acido, contenente numerosi residui di acido aspartico o glutammico.

Molti lavori riguardanti il ruolo di questi motivi nella coda citoplasmatica di

alcune glicoproteine come le gB di HCMV e del virus della pseudorabbia (PRV)

evidenziano che i motivi ricchi di tirosine e i motivi LL sono coinvolti

nell’internalizzazione dalla membrana plasmatica grazie all’interazione con la

proteina adattatrice clathrin-associated AP-2. Delezioni o mutazioni a livello di

questi motivi, quindi, secondo questi lavori, determinano l’accumulo di queste

proteine in membrana (Radsak et al., 1996; Tugizov et al., 1999; Nixdorf et al.,

2001). Lavori più recenti, però, hanno evidenziato un coinvolgimento molto più

complesso degli adattatori non solo nell’endocitosi dalla membrana plasmatica ma

in tutto il trafficking endosomiale lungo il pathway di secrezione (Figura 1.7.1).

Ad esempio esperimenti di biotinilazione della gB di HCMV hanno dimostrato

che parte, ma non tutta, la glicoproteina incorporata nei virioni è recuperata dalla

membrana plasmatica e che il blocco dell’endocitosi mediante il dominante

39

_______________________________________________________________________________

negativo K44A della dinamina 1 non ha effetti sulla produzione di progenie virale

sia extracellulare sia cellulo-associata (Jarvis et al., 2002).

I motivi ricchi di tirosine YXXΦ sono coinvolti in:

1. endocitosi dalla membrana (di solito XX sono aminoacidi idrofilici e il

motivo localizza 10-40 residui dal dominio TM).

2. sorting ai lisosomi (in questo caso la Y è spesso preceduta da G senza

specificità per alcun AP e il motivo localizza 6-9 aminoacidi dal dominio

TM o al C-terminale).

3. sorting verso la membrana basolaterale in cellule polarizzate.

I motivi di dileucina LL o LI sono coinvolti in:

1. endocitosi (il motivo di solito localizza 6-7 residui dal dominio TM).

2. sorting dal ERC (endocytic recycling compartment) al TGN

3. sorting dal TGN agli endosomi

4. targeting endo-lisosomiale (la presenza di un residuo acido in posizione –4

(la prima L è +1) e un residuo acido in posizione –5 o una serina

de/fosforilabile (PP2A/CKII) modulano la forza del segnale e il legame a

AP-1 e AP-2. Di solito localizza molto vicino al dominio TM o al C-

terminale).

Globalmente quindi i ruoli di LL sembrano sovrapposti a quelli di YXXΦ.

Esistono due tipi di motivi LL:

[DE] XXXL [LI]: modulabile quando preceduto da serine, che se fosforilate

ne diminuiscono l’attività. Costitutivamente attivo in proteine dei LE e dei

lisosomi. Lega le AP.

DXXLL: lega proteine che inserite in CVV (clathrin coated vesicles)

gemmano e ciclano tra TGN ed endosomi. Mutazioni di D e LL aumentano

l’espressione di tali proteine in membrana. Spesso la D si trova in un

contesto di un cluster acido per cui i motivi sono detti acidic cluster-

dileucine signals (AC-LL), localizzati 1 o 2 residui dal C-termine e che non

legano AP ma le GGA (ADP-rybosilation factor (ARF)-dependent clathrin

adaptors) tramite il dominio VHS (Vps27, Hrs e STAM) di queste ultime.

Il cluster acido rappresenta il motivo caratteristico di localizzazione al TGN. In

alcune proteine, come la gB di HCMV e la furina, il cluster acido viene fosforilato

dalla CKII. Questa modificazione covalente ne permette l’interazione con

40

_________________________________________________________________Introduzione

l’enzima PACS-1 (phosphofurin acid cluster sorting protein-1), responsabile del

trasporto delle proteine target dagli endosomi al TGN per mezzo di CCV

contenenti AP-1 e AP-3. (Bonifacino et al., 2003). Secondo Crump e colleghi

utilizzando un dominante negativo o mediante siRNA di PACS-1 proteine con il

cluster acido rilocalizzano dal TGN agli EE, ma non ai LE e ai lisosomi (Crump

et al., 2003). Oltre alla funzione più nota di sorting verso il TGN sono stati messi

in luce ruoli addizionali di PACS-1 nel late secretory trafficking e nel recycling

da EE alla membrana plasmatica, attraverso interazioni oltre che con AP-1 e AP-3

anche con GGA3 (Atkins et al., 2008). Oltre alla gB di HCMV altre proteine che

localizzano nel TGN che contengono un cluster acido fosforilabile sono: la furina,

gE di VZV, gE di HSV, US9 di PRV, il MPR (mannose 6-phosphate receptor),

Nef, la carbossipeptidasi D (CPD), Env del retrovirus felino RD114. In base alle

proprietà di PACS-1 non è chiaro se le proteine siano veicolate ai MVB/LE senza

passare per il TGN e, quindi, direttamente da ERC-EE o attraverso un

obbligatorio passaggio per il TGN, modello visto per la gM di HCMV secondo

Krzyzaniak et al., 2007.

Esistono 4 classi di proteine adattatrici AP, che differiscono in base al tipo di

subunità µ e sono:

AP-1: media attraverso PACS-1 il sorting verso il TGN ma anche quello contrario

in uscita dal TGN verso endosomi e lisosomi. Si pensa pertanto che la differenza

dipenda dalle proteine accessorie che lega (Lubben et al., 2008). Agisce in modo

clatrina dipendente o indipendente.

AP-2: legando YXXΦ media l’endocitosi clatrina dipendente dalla membrana.

L’affinità per AP-2 diminuisce se la tirosina o residui circostanti al motivo sono

fosforilati, mentre l’endocitosi aumenta per aumentata affinità con YXXΦ se AP-

2 stesso è fosforilato (Bonifacino et al., 2003). La deplezione di AP-2 porta

all’accumulo in membrana di varie proteine che allo steady state localizzano in

endosomi e/o lisosomi (come le proteine LAMP-1 (lysosome associated

membrane protein-1) e CD63) e aumenta la velocità di maturazione degli EE

verso MVB/LE e la velocità di trasporto delle proteine (ad esempio il MHC-I

tramite Nef) da EE verso la membrana o verso i MVB/LE, accelerando la loro

degradazione lisosomiale. È stato ipotizzato che questi effetti della deplezione di

41

_______________________________________________________________________________

AP-2 siano dipendenti dall’ubiquitinazione e dal coinvolgimento di ubiquitino

ligasi E3.

AP-3: agisce sia in modo clatrina dipendente sia indipendente e legando YXXΦ

partecipa al trafficking verso lisosomi o organelli lisosoma-associati. Localizza al

TGN e agli endosomi. Lega anche PACS-1 ma è coinvolta nel sorting anche di

proteine lisosomiali prive di cluster acido (LAMP-1, LIMP-2 e tirosinasi).

AP-4: lega il motivo FI (ad esempio nella furina) promovendo il sorting verso la

membrana basolaterale. È stato ritrovato in vescicole che gemmano dal TGN

clatrina indipendenti.

Figura 1.7.1 Pathway endocitico e adattatori coinvolti nel trasporto delle proteine cargo.

1.8 La glicoproteina B (UL55)

La gB del HCMV (UL55) è una tra le più conservate proteine nella famiglia

Herpesviridae. E’ una glicoproteina di tipo I di 906 residui aminoacidici,

costituita da una porzione N-terminale extracellulare, un dominio TM (residui

751-771) e una regione C-terminale citoplasmatica. Viene prodotta come

precursore N- ed O-glicosilato del peso molecolare di 160 KDa. A livello del

TGN il precursore è scisso dall’endonucleasi cellulare furina, enzima responsabile

del processamento proteolitico di vari pro-ormoni e numerosi substrati proteici

riconoscendo il motivo RX(R/K)R, presente in gB a livello dei residui 456-459. In

tal modo la glicoproteina viene scissa in due subunità rispettivamente di 116 e 55

KDa, che rimangono legate da ponti disolfuro (Figura 1.8.1). gB viene così

incorporata nel virione maturo in forma di omodimero. Tale caratteristica è

comune a tutte le gB ad eccezione degli omologhi in HSV-1, HSV-2 ed EBV,

42

_________________________________________________________________Introduzione

anche se non è indispensabile per la replicazione in coltura (Wells et al., 1990;

Brücher et al., 1990). La colocalizzazione di gB con marker del TGN è riportata

in molti lavori tra i quali Crump et al., 2003; Jarvis et al., 2002; Turcotte et al.,

2005. Il suo segmento idrofobico 714-747 e il motivo KNP (748-750) sono

coinvolti nel cleavage della glicoproteina e, aumentandone l’affinità per i

chaperoni molecolari Bip/Grp78 e Grp94, ne causano la ritenzione nel RE. Il

dominio TM, invece, svolge la funzione di ancoraggio alla membrana (Zheng et

al., 1996).

gB svolge un ruolo critico insieme a gM nell’attacco alla cellula, poiché entrambe

le glicoproteine legano i proteoglicani di eparansolfato. Successivamente

interviene nelle fasi di entry grazie all’interazione con vari recettori cellulari: gli

eterodimeri di integrina, i recettori per l’EGFR e il TLR-2, mediando così la

penetrazione del virus nella cellula. In questa fase gB forma insieme al complesso

gH/gL il core fusion machinery, conservato in tutti gli herpesvirus e necessario

per mediare la fusione tra le membrane cellulare e virale. È stato ipotizzato che sia

l’interazione con le integrine β2 a mediare l’attività fusogena di gB. La sua

interazione con le integrine β1 è mediata dal suo disintegin-like domain (DLD)

(AA 92-111) (Feire et al., 2004).

Oltre a svolgere un ruolo fondamentale nell’entrata, la glicoproteina è richiesta

insieme al complesso gH/gL nel processo di diffusione cellula-cellula attraverso le

giunzioni cellulari, ruolo conservato anche per gli omologhi in HSV-1, HSV-2,

PRV, EBV, HHV-8.

Più controverso è il ruolo di UL55 a livello di assemblaggio e gemmazione virali,

poiché sembrano esserci differenze specifiche tra i vari herpesvirus. In particolare

i difetti di budding riscontrati per HSV-1 con gB deleta (totalmente o

parzialmente a livello della coda) non sono stati altrettanto riproducibili in altri

virus come PRV e lo stesso HCMV, in cui, in base alle ultime evidenze, UL55

non sarebbe essenziale per l’assemblaggio. Questo risultato deriva da saggi di

complementazione effettuati con un virus ricombinante deleto di gB mediante la

tecnologia del BAC (bacterial artificial chromosome) e pseudotipizzato in

fibroblasti esprimenti gB wild-type (wt). La totale delezione di gB ha evidenziato

come la glicoproteina sia essenziale in fusione ed entry, nonchè nella diffusione

cellula-cellula, ma non nell’uscita del virus (Isaacson and Compton, 2009).

43

_______________________________________________________________________________

gB è il maggiore bersaglio di anticorpi neutralizzanti ed è, pertanto, studiata per la

messa a punto di vari tipi di vaccino. Gli anticorpi, riconoscendo due differenti

domini antigenici di gB, possono inibire l’attacco e bloccare la fusione e, pertanto,

possono agire in diverse fasi dell’entry. Anche in assenza di altri componenti

virali ed in particolare dopo il legame alle integrine, la glicoproteina è in grado di

innescare una cascata di eventi di signaling, inducendo l’attivazione della risposta

immunitaria innata con la produzione di interferone e di citochine infiammatorie,

riarrangiamenti del citoscheletro e l’attivazione di chinasi.

UL55, come tutti gli omologhi nella famiglia degli herpesvirus, contiene a livello

della coda citoplasmatica due motivi ricchi di tirosine (YXXΦ 845-848 e 894-

897), due motivi di dileucina (LL 848-849 e 883-884) ed un cluster acido

all’estremità C-terminale (DSDEEENV 899-906), che ne promuove, quando la

serina 900 è fosforilata, l’interazione con PACS-1.

Figura 1.8.1 Domini in cui è organizzata la glicoproteina B di HCMV (UL55).

Avendo un cluster particolarmente acido, UL55 è molto sensibile alle variazioni

dei livelli di PACS-1, ad esempio in presenza di una forma dominante negativa o

se il trasportatore viene depleto. Diversamente la localizzazione di gH di HCMV,

che localizza ugualmente al TGN ma non contiene un cluster acido, non viene

influenzata (Crump et al., 2003). La mutazione della serina 900 ad acido

aspartico, che ne mima uno stato costitutivamente fosforilato, determina

l’aumento della forza di interazione con PACS-1 che non varia la velocità di

trasporto al TGN ma ne diminuisce la velocità di trasporto dal TGN ad altri

compartimenti (Jarvis et al., 2003). Crump e colleghi mostrano che la deplezione

di PACS-1, inoltre, causa una diminuzione dal 40 al 50% di progenie di HCMV

infettiva, mentre in cellule sovraesprimenti PACS-1 si osserva un aumento di

virus prodotto del 200-250% (Crump et al., 2003). Questo lavoro, così come

Krzyzaniak et al., 2007, suggeriscono l’importanza maggiore per le glicoproteine

di HCMV del loop regolato da PACS-1 rispetto a quello membrana

44

_________________________________________________________________Introduzione

plasmatica/EE/ERC. Secondo Krzyzaniak e colleghi, però, l’interazione di PACS-

1 con il cluster acido non dipende dallo stato di fosforilazione della serina ma

dall’acidità del cluster, che in UL55 Asp900 è maggiore poiché viene aggiunto un

residuo acido. Infatti, una forma tronca della gM di HCMV priva del cluster acido

è mostrato avere un’efficienza di trasporto al TGN rallentata e, poiché, secondo

questo lavoro, il passaggio al TGN è richiesto per il successivo reclutamento

all’AC, questo effetto spiegherebbe il ritardo del reclutamento nel sito di

assemblaggio di questo mutante. Un altro mutante di gM, invece, che presenta 6

residui acidi invece di 12 presenta un comportamento intermedio rispetto a gM wt

e alla forma tronca (Krzyzaniak et al., 2007).

1.9 Proteine del pathway dei multivesicular body coinvolte nella gemmazione di virus dotati di envelope

Molte evidenze in letteratura hanno dimostrato il coinvolgimento del sistema

endosomiale cellulare nella gemmazione di varie famiglie di virus con genoma ad

RNA dotati di envelope quali retrovirus, filovirus e paramyxovirus. Tale sistema

rappresenta una complessa rete di compartimenti membranosi che coordinano il

trasporto delle proteine tra la membrana plasmatica, il TGN ed i vacuoli/lisosomi.

Un ruolo centrale a questo livello è svolto da un organello di recente

individuazione e denominato multivesicular body (MVB).

La sua biogenesi avviene attraverso la formazione di vescicole intraluminali (ILV)

che gemmano dalla membrana all’interno degli endosomi. Così formatisi i MVB

fondono con il vacuolo/lisosoma, dove le proteine contenute nelle ILV sono

degradate da lipasi e idrolasi (Katzmann, 2002). Le proteine che non sono

inglobate nelle ILV vengono o riciclate, ritornando alla superficie cellulare o al

Golgi, o rimangono nella membrana esterna dei MVB, sfuggendo così alla

degradazione (Piper and Katzmann, 2004). Le proteine destinate alla degradazione

nel lisosoma vengono secrete nelle vescicole intraluminari dei MVB, che a loro

volta fondono con i lisosomi. I MVB sono delimitati da doppia membrana e

presentano solitamente una matrice elettron-lucente. Il loro diametro medio è di

200-500 nm, mentre il diametro delle ILV varia dai 40 ai 150 nm.

Nel lievito la biogenesi dei MVB richiede 17 proteine dette Vps (vacuolar protein

sorting) o di classe E, perché la perdita della loro funzione genera il fenotipo detto

di classe E, caratterizzato dal blocco della formazione dei MVB e dall’accumulo

45

_______________________________________________________________________________

di compartimenti endosomiali deformati e multilamellari, conosciuti come

compartimenti di classe E. Inoltre, il corretto indirizzamento delle proteine

vacuolari viene inibito e queste si accumulano sulle membrane esterne dei

compartimenti di classe E. E’ stato identificato un omologo umano per ciascuna

delle proteine di classe E di lievito, a dimostrazione della conservazione

nell’evoluzione della via cellulare regolata dai MVB. La maggior parte delle

proteine Vps svolge la sua funzione all’interno di uno dei quattro complessi

solubili che vengono reclutati in successione nel sito di formazione dei MVB e

chiamati ESCRT-0 (endosomal sorting complex required for transport) o HRS,

ESCRT-I, ESCRT-II e ESCRT-III (Katzmann, 2002; Figura 1.9.1).

Per permettere il riciclo del macchinario di assemblamento dei MVB, i complessi

ESCRT sono disassemblati nel sito di invaginazione della membrana dall’attività

enzimatica della AAA (ATPase associated with various cellular activities)

ATPasi Vps4, reclutata da ESCRT-III (Babst et al., 2002). I dominanti negativi di

questa proteina, come Vps4pE228Q, inibiscono il sorting ai MVB originando il

fenotipo di classe E. Le cellule di mammifero presentano due proteine Vps4

paraloghe, Vps4A e Vps4B/Skd1, che mostrano un elevato grado di identità tra

loro (80%) e con la proteina di lievito Vps4p (59 e 60% rispettivamente). In

lievito, nello stato basale, Vps4p è una proteina citosolica dimerica che porta

legato l’ADP. Il legame dell’ATP permette l’oligomerizzazione di Vps4p in un

complesso stabile, costituito da cinque dimeri e il suo reclutamento dal citoplasma

all’endosoma, tramite l’interazione con la proteina Vps24 (denominata CHMP3

nelle cellule di mammifero), appartenente al complesso ESCRT-III. A questo

punto, l’oligomerizzazione dei dimeri attiva la funzione ATPasica e il

cambiamento conformazionale conseguente all’idrolisi porta al disassemblaggio

dell’oligomero. Le proteine che costituiscono i complessi ESCRT-I-II-III vengono

rilasciate e possono legarsi nuovamente in membrana e iniziare un nuovo ciclo

(Babst, 2005).

La biogenesi dei MVB attraverso la formazione di vescicole che gemmano

all’interno degli endosomi è topologicamente identica alla gemmazione virale.

Questo può spiegare perché molti virus si siano evoluti per sfruttare questo

pathway per il loro rilascio dalla cellula. Dati recenti, infatti, hanno indicato il

coinvolgimento dei MVB nell’assemblaggio e il rilascio di molti virus ad RNA

provvisti di envelope: retrovirus e tra questi lentivirus come HIV-1 (Strack et al.,

46

_________________________________________________________________Introduzione

2003; Morita et al., 2004), oncoretrovirus (Rous Sarcoma Virus), spumavirus

(Foamy virus), filovirus (Ebola) (Jasenosky et al., 2004), arenavirus e

paramyxovirus (Strack et al., 2003).

Fig. 1.9.1 Biogenesi dei MVB nel lievito e composizione dei componenti ESCRT (da Slagsvold

et al., 2006).

I virus ad RNA dotati di envelope acquisiscono quest’ultima struttura, gemmando

attraverso membrane cellulari di varia origine (membrana plasmatica, TGN).

Un’infezione produttiva richiede che tutti i componenti che rendono la particella

virale infettiva si localizzino in modo coordinato nel sito della membrana dove

avverrà la gemmazione. Per i retrovirus questi componenti includono le

glicoproteine virali dell’envelope (Env), la poliproteina Gag, gli enzimi (proteasi,

trascrittasi inversa ed integrasi), il genoma ad RNA e altre proteine accessorie. La

poliproteina Gag è l’unica proteina virale necessaria e sufficiente a guidare il

rilascio delle particelle virali, in quanto, anche in assenza di altri fattori virali, è in

grado formare particelle extracellulari virus-simili (VLP) (Göttlinger, 2001).

Esistono due meccanismi che mediano il reclutamento delle proteine virali, così

come di quelle cellulari, ai MVB. Il primo meccanismo è basato sulla loro

interazione fisica con componenti dei complessi ESCRT, mentre il secondo

meccanismo è rappresentato dalla loro ubiquitinazione (Piper and Katzmann,

2004).

Per quanto riguarda il primo meccanismo, le interazioni sono mediate da domini

tetra-aminoacidici altamente conservati e ricchi in prolina contenuti a livello di

molte proteine strutturali virali e coinvolti nell’assemblaggio e nelle fasi tardive

del ciclo di replicazione virale e per questo detti late (L-)domain (Morita and

47

_______________________________________________________________________________

Sundquist, 2004; Demirov and Freed, 2004). Questi motivi, se mutati, portano

all’arresto dell’assemblaggio delle particelle negli stadi tardivi. Ne sono stati

identificati almeno 3 tipi: P(T/S)AP, YP(x)nL e PPxY. Il motivo P(T/S)AP è stato

identificato in tutti i lentivirus dei primati, come HIV-1 (Göttlinger et al., 1991), e

dei non primati, fatta eccezione per EIAV (virus dell’anemia infettiva equina),

dove è stato mappato il motivo YPxL. La sequenza PPxY è stata identificata negli

oncoretrovirus e, all’esterno della famiglia dei retrovirus, in filovirus (Ebola) e

arenavirus. L’identificazione di uno stesso L-domain in varie famiglie retrovirali è

significativo, perché porta ad ipotizzare che virus diversi dotati di envelope

gemmino attraverso meccanismi simili. A sostegno di questo è stato dimostrato

che i L-domain sono interscambiabili (Strack et al., 2000; Martin-Serrano et al.,

2001).

Per quanto riguarda il secondo meccanismo che controlla il corretto sorting delle

proteine riveste un ruolo molto importante l’ubiquitina (Ubi). L’ubiquitina è una

piccola molecola di 76 aminoacidi che interviene in numerosi fenomeni cellulari

fondamentali. L’ubiquitinazione viene definita come la formazione di un legame

isopeptidico tra il residuo di glicina C-terminale dell’ubiquitina e il gruppo

amminico ε di un residuo di lisina della proteina target o di un’altra molecola di

ubiquitina. Esistono vari pattern di ubiquitinazione: la multi-monoubiquitinazione

è definita come l’addizione di ubiquitina a vari residui di lisina di una proteina

target, mentre la poli-ubiquitinazione rappresenta il legame di lunghe catene di

ubiquitina ad un singolo residuo di lisina di una proteina. Le proteine destinate

alla degradazione nel proteosoma vengono poli- ubiquitinate attraverso i residui di

Lys48 o Lys29 dell’ubiquitina. Diversamente la mono- o oligo-ubiquitinazione

(principalmente attraverso i residui Lys63) determina la degradazione delle

proteine nel pathway dei MVB/lisosomi. Se questo è vero per le proteine cellulari

è altrettanto vero per molte proteine strutturali virali, che subiscono, pertanto cicli

di ubiquitinazione e deubiquitinazione che ne regolano il reclutamento. Numerosi

dati suggeriscono una connessione tra l’ubiquitina e il rilascio dei retrovirus: (1)

molti retrovirus, inclusi RSV, HIV, SIV e MLV, incorporano elevati livelli di

ubiquitina nelle loro particelle; (2) le proteine Gag di HIV-1 e MLV sono mono-

ubiquitinate in molteplici siti; (3) i livelli di ubiquitinazione di Gag sono alterati

dalla presenza o assenza di un L-domain funzionale (Strack et al., 2000; Martin-

Serrano, 2004); (4) inibitori del proteosoma che esauriscono i pool di ubiquitina

48

_________________________________________________________________Introduzione

libera portano all’arresto della gemmazione del virus in stadi tardivi (Strack et al.,

2002); e (5) mutazioni dell’ubiquitina possono inibire la gemmazione di HIV ed

Ebola (Strack et al., 2002). Sembra, quindi, che l’attacco dell’ubiquitina al Gag

funga da segnale endocitico e che questa proteina vada incontro a cicli di

ubiquitinazione/deubiquitinazione durante la gemmazione virale (Martin-Serrano

et al., 2001).

Alcune proteine Vps presentano un’attività di legame all’ubiquitina ben

caratterizzata. Queste sono: Hrs (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine

kinase substrate) e Tsg101 (tumor susceptibiliy gene 101). La prima è una

proteina solubile e rappresenta la subunità principale del complesso HRS, di cui

fanno parte anche altre proteine di classe E. Viene reclutata alla membrana

endosomiale e, in questa sede, prende contatto con l’ubiquitina delle proteine qui

presenti attraverso uno specifico dominio (ubiquitin-interacting motif, UIM). Una

volta in membrana Hrs è in grado di reclutare il complesso solubile ESCRT-I

mediante interazioni dirette con uno dei suoi componenti, la proteina Tsg101.

Questa proteina è costituita da 390 residui aminoacidici e contiene a partire dal N-

terminale il dominio UEV (ubiquitin E2 variant, 1-145), un dominio ricco in

prolina (PRO) (146-215), un putativo dominio coiled-coil (CC) (240-311) e,

infine, il dominio steadiness box (S-Box) (330-390). Inoltre tra i domini CC e S-

box (residui 320-323) è presente il motivo PTAP (Figura 1.9.2). Il dominio UEV è

omologo al dominio caratteristico delle E2 ubiquitino ligasi, ma è privo

dell’attività catalitica, poichè non è presente il residuo di cisteina nel sito attivo

necessario per l’attività enzimatica di trasferimento dell’ubiquitina (Morita and

Sundquist, 2004). Il dominio UEV media l’interazione di Tsg101 sia con residui

di ubiquitina sia con il L-domain P(T/S)AP di Hrs e di Gag. I residui aminoacidici

che influenzano maggiormente l’affinità delle due interazioni sono

rispettivamente i residui N45 e M95 (Pornillos et al., 2003).

Fig. 1.9.2 Domini in cui è organizzata la proteina Tsg101 (modificato da Stuchell et al.,

2004).

49

_______________________________________________________________________________

Molte evidenze in letteratura dimostrato che le proteine strutturali di HIV-1 e 2 ed

Ebola si sono evolute per mimare la proteina cellulare Hrs nella sua normale

funzione di reclutamento, allo scopo di dirottare il macchinario che catalizza la

formazione e la gemmazione di vescicole dei MVB. Infatti, sia

nell’organizzazione strutturale che nelle proprietà biochimiche, Hrs e la proteina

Gag di HIV presentano delle somiglianze (Pornillos et al., 2003): entrambe 1)

presentano dei motivi aminoacidici che ne permettono il reclutamento in

membrana; 2) contengono il motivo P(S/T)AP in una regione ricca in prolina; 3)

tale motivo è il sito di interazione con Tsg101; 4) sono mono-ubiquinate. Si

ipotizza che dopo essere stato reclutato in membrana dalle proteine virali, Tsg101

scambi queste come proteine da incorporare in vescicole e recluti il restante

macchinario dei MVB necessario a completare il processo di gemmazione. Questo

evento è dimostrato dal blocco del rilascio delle particelle nella fase di fissione

dalla membrana in assenza di Tsg101.

Una volta attivato, Tsg101 recluta in membrana un altro complesso solubile di

proteine di classe E detto ESCRT-II, il quale a sua volta è richiesto per iniziare

l’assemblaggio del complesso ESCRT-III sulle membrane endosomiali (Babst et

al., 2002). ESCRT-III nelle cellule di mammifero è costituito dalle proteine

CHMP. Tra queste CHMP4 interagisce con la proteina AIP1 (ALG-2 interacting

protein 1) (o Alix, ALG-2 interacting protein x), la quale sembra funzionare nelle

tappe finali del pathway dei MVB, collegando ESCRT-I ad ESCRT-III.

AIP1/Alix interagisce con Tsg101, e rappresenta il principale partner cellulare

delle proteine Gag che contengono come L-domain il motivo YP(x)nL. Questa

sequenza aminoacidica è presente nel dominio p9 della proteina Gag di EIAV e

nel dominio p6 della proteina Gag di HIV-1 (Strack et al., 2003). Il dominante

negativo di AIP1/Alix inibisce la gemmazione sia di HIV-1 che di EIAV.

Il meccanismo che controlla la coniugazione delle proteine all’ubiquitina prevede

tre eventi: l’attivazione dell’ubiquitina in modo ATP-dipendente da parte della

classe di enzimi ubiquitin-activating enzymes o enzymes-1 (E1), che legano il

residuo C-terminale dell’ubiquitina; il trasferimento dell’ubiquitina al gruppo

tiolico del residuo di cisteina degli ubiquitin-conjugating enzymes (E2), che

rappresentano le proteine carrier dell’ubiquitina; infine, il legame dell’ubiquitina

alla proteina target da parte delle ubiquitin-ligase proteins (E3) attraverso il

gruppo amminico ε di un residuo di lisina. Tra le E3 ubiquitino ligasi che

50

_________________________________________________________________Introduzione

svolgono un ruolo fondamentale nell’ubiquitinazione delle proteine destinate ai

MVB vi sono quelle della famiglia Nedd4 (neural precursor cell expressed

developmentally down-regulated) (Nedd4, Itch/AIP4 (atrophin-1 interacting

protein 4), WWP1 e WWP2) (Blot et al., 2004). Questa famiglia è composta

nell’uomo da nove membri, che condividono una struttura simile con un dominio

N-terminale C2 che lega i lipidi di membrana, seguito da multipli domini WW e

da un dominio C-terminale HECT (homologous to E6-AP C terminus), che

contiene il residuo di cisteina catalitico. I domini WW ne mediano l’interazione

con i motivi PPxY delle proteine Gag di alcuni retrovirus o delle proteine

strutturali di altri virus a RNA dotati di envelope (filovirus). Il fatto che la loro

ubiquitinazione Nedd4-mediata ne promuova l’entrata nel pathway dei MVB è

confermato dal fatto che gli inibitori dei proteosomi interferiscono con il rilascio

delle particelle virali.

Una volta reclutate attraverso l’ubiquitinazione, prima di entrare nei MVB, le

proteine subiscono uno step di deubiquitinazione ad opera di deubiquitinasi. A

tale livello svolgono un ruolo centrale UBPY (ubiquitin-specific processing

protease Y)/USP8 e AMSH (associated molecule with the Src homology 3 domain

of STAM). Entrambi gli enzimi legano il dominio SH3 di STAM, componente

dell’ESCRT-0. Nonostante entrambi deubiquitinino le proteine target a cui si

legano, gli effetti sui cargo e la loro deplezione mostrano risultati opposti. Per

spiegare tali effetti è stato, pertanto, proposto un modello di funzionamento delle

due deubiquitinasi (Welchman et al., 2005; Clague and Urbe, 2006; McCullough

et al., 2008). Questo modello prevede che AMSH deubiquini le proteine cargo (ad

esempio EGFR) per permetterne il reciclo e determini pertanto l’accumulo delle

proteine deubiquitinate e di ubiquitina libera a livello endosomiale (Welchman et

al., 2005; McCullough et al., 2008). Inoltre, l’enzima trasforma CHMP3 in un

potente inibitore del rilascio di HIV-1. La forma dominante negativa AMSHD348A,

che contiene una mutazione del residuo conservato di acido aspartico contenuto

nel dominio JAMM (JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme), intensifica gli effetti

della proteina wt, mentre siRNA di AMSH ha opposti effetti, determinando la

degradazione del cargo e incrementando la gemmazione virale (Zamborlini et al.,

2006; Agromayor and Martin Serrano, 2006). UBPY, invece, interviene nella

deubiquitinazione delle proteine bersaglio per permetterne la degradazione sia nel

pathway dei MVB sia nel proteosoma, con un ruolo analogo a quello proposto per

51

_______________________________________________________________________________

Doa4 in lievito. Il mutante a livello della cisteina catalitica (UBPYC786S) e siRNA

di UBPY hanno simili effetti, determinando l’accumulo dei cargo ubiquitinati

(Mizuno et al., 2005; Alwan et al., 2006; Row et al., 2007; Komada, 2008).

Sono state identificate molte proteine di sorting (Eps15, Epsin, CIN85, Tom,

Tollip, Vps36/Eap45, STAM, GGA, SH3, GAT, CUE, NZF, GLUE) che

riconoscono cargo ubiquitinati e che per la maggior parte sono esse stesse

ubiquitinate. Esse potrebbero agire semplicemente riconoscendo la proteina

ubiquitinata o avvicinando al complesso le ubiquitino ligasi. Sono localizzate in

membrana, TGN ed endosomi, per cui a seconda della loro localizzazione

mediano:

1 internalizzazione dalla membrana plasmatica

2 sorting dal TGN agli endosomi

3 sorting ai MVB

Tra i trasportatori più importanti coinvolti nel sorting dal TGN e dagli endosomi

in CCV ricche di AP-1 verso i MVB/LE vi sono le proteine GGA (GGA1, 2 e 3) e

le proteine Tom (Tom1, Tom1L1 e Tom1L2).

Le proteine GGA riconoscono il motivo DXXLL nelle proteine target e le

isoforme 1 e 3 contengono un motivo DXXLL con cui legano il loro stesso

dominio VHS, autoinibendosi. Sono attivate e legano le proteine target

defosforilate (al contrario di PACS-1) mentre CKII, fosforilandole, trasferisce la

proteina cargo ad AP-1. Tutte tre le isoforme (la 3 con maggiore avidità) sono

mono-ubiquitinate da Nedd4 nel dominio GAT (GGA and TOM). Tramite questo

dominio, inoltre, legano Radaptina 5, Tsg101 (competendo con Gag di HIV, Yuko

Yanagida-Ishizaki et al., 2008) e l’ubiquitina.

I trasportatori Tom1, Tom1L1 e Tom1L2 legano proteine prive del motivo

DXXLL e sono anch’esse mono-ubiquitinate.

Sia le proteine GAG sia le Tom legano la catena pesante della clatrina e Hrs

mediante il dominio VHS. Nelle Tom il legame a Tsg101 non è mediato dal

dominio GAT ma dai due L-domain PTAP e PSAP.

Alcune evidenze supportano l’ipotesi che entrambe queste famiglie di

trasportatori medino il sorting ai MVB senza il bisogno di riconoscere particolari

domini ma solo attraverso l’ubiquitinazione delle proteine cargo (Puertollano and

Bonifacino, 2004). Sembra, quindi, che tali molecole abbiano un ruolo analogo a

52

_________________________________________________________________Introduzione

Hrs come “adattatori endosomiali all’ubiquitina”, che legano cioè proteine

ubiquitinate per poi trasferirle a Tsg101 e ai complessi ESCRT.

Complex Human

protein

Protein

length Motifs Other names

NCBI locus

link ID#

Yeast

ortholog

Hrs 777 VHS, (UIM),

FYVE, coiled-coil,

PSAP

HGS 9146 Vps27p

STAM1 540 8027 Hse1p

ESCRT-0

STAM2 525 VHS, UIM, SH3,

coiled-coil

HBP/EAST 10254 Hse1p

Tsg101 390 UEV, coiled-coil,

PSAP

7251 Vps23p

VPS28 221 51160 Vps28p

VPS37Aa 397 coiled-coil, Mod_r,

UEV

HCRP1/FLJ32642 137492 Vps37p

VPS37Ba 285 coiled-coil, Mod_r,

PTAP

FLJ12750 79720 Vps37p

VPS37Ca 523 coiled-coil, Mod_r FLJ20847 55048 Vps37p

ESCRT-I

VPS37Da 397 coiled-coil, Mod_r WBSCR24/FLJ32642 137492 Vps37p

EAP20 176 hVPS25/MGC10540 84313 Vps25p

EAP30 258 11267 Vps22p

ESCRT-II

EAP45 386 CGI-145 51028 Vps36p

CHMP1A 196 PCOLN3/CHMP1 5119 Did2p

CHMP1B 199 CHMP1.5 57132 Did2p

CHMP2A 222 BC-2 27243 Vps2p/Did4p

CHMP2B 213 CHMP2.5/CGI-84 25978 Vps2p/Did4p

CHMP3 222 Altamente carico,

coiled-coil,

CGI-149/NEDF 51652 Vps24p

CHMP4Ab 224 SNF7 domain CAC14088/C20orf178 128866 Vps32p/Snf7p

CHMP4Bb 265 CDA04/HSPC134 29082 Vps32p/Snf7p

CHMP4C 233 MGC22825 92421 Vps32p/Snf7p

CHMP5 219 HSPC177/CGI-34 51510 Vps60p/Mos10p

ESCRT-III

CHMP6 201 FLJ11749 79643 Vps20p

Vps4A 437 Vps4 27183 Vps4p Vps4

Vps4B 444 AAA-ATPase SKD1 9525 Vps4p

AIP1 868 Bro1, coiled-coil,

PTAP

HP95/ALIX 10015 Vps31p/Bro1p

LIP5 307 C6orf55/DRG1/My012 51534 Vta1p

Altre

proteine

SLC9A6c 669 Sodium/proton

exchanger

NHE6/KIAA0267 10479 Vps44p/Nhx1p

Tabella 1.9.1 Le proteine di classe E umane (Morita and Sundquist, 2004). Le proteine

rilevanti per questo lavoro sono evidenziate in rosso.

53

_______________________________________________________________________________

1.10 Ruolo dei multivesicular body nella gemmazione di virus a DNA

Un’attuale oggetto di indagine mira a capire se il modello ormai consolidato ed

accettato per la gemmazione dei virus dotati di genoma ad RNA attraverso le

membrane dei MVB, sia applicabile anche a famiglie virali con genoma a DNA.

Nel nostro laboratorio ed in altri gruppi è stato dimostrato che HSV-1 utilizza le

membrane dei MVB per acquisire l’envelope e gemmare e che l’espressione di

forme dominanti negative di Vps4 e delle proteine del complesso ESCRT-III

causa una notevole riduzione del rilascio di particelle virali infettive, mentre non

sono influenzate infezione, trascrizione genica e sintesi proteica (Calistri et al.,

2007; Crump et al., 2007; Pawliczek and Crump, 2009). Approfondendo i

meccanismi con cui il virus entra in questo pathway, il nostro gruppo di ricerca ha

chiarito come la gB di HSV-1 svolge un ruolo critico. Questa glicoproteina non

contiene motivi sovrapponibili ad una sequenza consenso di un L-domain, ma

entra nei MVB e colocalizza con il marker LAMP-1 grazie alla sua mono-

ubiquitinazione. In cellule umane esprimenti le forme dominanti negative di Vps4

e Vps24 sono alterati la maturazione ed il trafficking di gB. La parziale delezione

a livello della coda citoplasmatica di gB (gB867) comporta una drammatica

riduzione dell’ubiquitinazione e del rilascio di progenie infettiva a livello

extracellulare (Calistri et al., 2007).

Un altro virus a DNA che sfrutta il macchinario dei MVB è il virus dell’epatite B

(HBV). Le proteine dell’envelope di HBV colocalizzano con AIP1/Alix e Vps4B.

Inoltre AIP11-702, una forma dominante negativa di AIP1, inibisce la produzione e

il rilascio di virus, senza significativi effetti sulla formazione dei nucleocapsidi,

mentre Vps4BE235Q inibisce sia la produzione di nucleocapsidi sia la gemmazione.

Queste forme dominanti negative non compromettono, invece, il rilascio di

particelle sub-virali provviste di pericapside ma prive di nucleocapside e

aumentano il rilascio di nucleocapsidi nudi (Lambert et al., 2007; Watanabe et al.,

2007).

Più recentemente l’analisi strutturale mediante microscopia elettronica ha

permesso di osservare che HHV-6 gemma a livello dei MVB e in vescicole

derivate dal TGN positive per CD63 e TGN46 e che CD63 è incorporata nel

virioni (Mori et al., 2008). Gli autori suggeriscono che le membrane che

54

_________________________________________________________________Introduzione

avvolgono HHV-6 abbiano caratteristiche intermedie tra quelle del TGN e quelle

endosomiali.

Una simile conclusione è quella attualmente avvalorata anche per HCMV in base

al modello proposto da Das e colleghi sulla struttura e composizione dell’AC e su

un lavoro recente di Capeda e colleghi. Nei lavori Sanchez et al., 2000 e

Homman-Loudly et al., 2003 si evidenzia che i marker Rab 7 (LE), LAMP-1 (LE

e lisosomi) e LAMP-2 (lisosomi) non concentrano a livello dell’AC, ma sembra

che alcuni aspetti della via di degradazione lisosomiale siano alterati. In base al

lavoro Capeda et al., 2009 sono reclutati all’AC e incorporati nei virioni di

HCMV marker dei EE, dei MVB/LE e del TGN: EEA-1, il recettore per la

transferrina (TfR, marker dei recycling endosomes che colocalizza con UL33),

l’annessina 1, CI-M6PR (cation indipendent mannose 6-phosphate receptor),

TGN46 e CD63. Analogamente ai due lavori precedenti non si osserva accumulo

all’AC di LAMP-1 e LAMP-2. Inoltre Capeda e colleghi hanno evidenziato una

riduzione significativa nel corso dell’infezione dei livelli sia dei trascritti sia delle

proteine di TGN46, CD63, annessina 1 e CD-M6PR (cation dipendent mannose

6-phosphate receptor) e che i virioni positivi per TGN46 e CD63 sono infettivi

(Capeda et al., 2009). Quale sia il reale apporto dei MVB nella formazione

dell’AC e quali componenti ESCRT ne siano reclutati è ancora oggetto di studio e

la letteratura fino a questo momento appare controversa. Fraile-Ramos e colleghi

mostrano che durante l’infezione i recettori chemochinici virali di HCMV UL33,

US28 e US27 e le glicoproteine gB e gH localizzano ai MVB/LE (Fraile-Ramos

et al., 2002 e 2003). Gli stessi autori, però, hanno osservato che, differentemente

da quanto accade nei retrovirus in cui il blocco del pathway dei MVB determina

un arresto della gemmazione virale, siRNA di Vps4 in cellule infettate con

HCMV incrementa la produzione virale. In base a questi risultati questi autori

suggeriscono che, nonostante molte proteine anche essenziali di HMCV

contengano sequenze riconducibili a L-domain (tra queste, in particolare, due

motivi PTAP in pp150 e UL56 (una proteina non strutturale coinvolta nel

packaging del DNA virale nel nucleo), due motivi PPxY in gB e UL48 e più di 30

motivi YXXL, Figura.1.10.1), il virus non richieda le proteine ESCRT per

completare il suo envelopment (Fraile-Ramos et al., 2007).

55

_______________________________________________________________________________

Figura 1.10.1 Sequenze omologhe a L-domain identificate nelle proteine di HCMV. Le proteine marcate in rosso sono essenziali per la replicazione virale (Fraile-Ramos et al., 2007).

Un coinvolgimento delle proteine ESCRT nelle fasi finali del ciclo replicativo di

HCMV è, invece, il risultato emerso dal lavoro di Tandom e colleghi, secondo cui

le forme dominanti negative di Vps4 e di CHMP1 inibiscono la replicazione

virale. Al contrario le forme dominante negative di Tsg101, AIP1 e WWP1 non

hanno effetto sulla maturazione del virus. Inoltre sia Vps4 sia CHMP1 sono

reclutati all’AC e colocalizzano con proteine virali come la gM in questo

compartimento.

56

_________________________________________________________________________Scopo

2 SCOPO

Nel corso degli ultimi anni diversi studi hanno permesso di chiarire che non solo

virus dotati di genoma ad RNA ma anche virus a DNA provvisti di envelope

utilizzano l’apparato dei multivesicular body (MVB) per completare correttamente

le fasi di assemblaggio e gemmazione dalla cellula. In particolare, il nostro e altri

laboratori hanno dimostrato che la maturazione del virus dell’herpes simplex di

tipo 1 (HSV-1) richede una corretta biogenesi dei MVB (Calistri et al., 2007;

Crump et al., 2007). Simili risultati sono stati ottenuti anche nel caso del virus

dell’epatite B (HBV) (Lambert et al., 2007; Watanabe et al., 2007) e

dell’herpesvirus umano di tipo 6 (HHV-6) (Mori et al., 2007). Più controverso

appare il ruolo svolto dai MVB nel ciclo relicativo del citomegalovirus umano

(HCMV). Da un lato, alcune evidenze sperimentali sembrano indicare che il virus

non utilizza le proteine necessarie alla biogenesi di questi organelli (ESCRT) nelle

fasi di maturazione del virione (Fraile-Ramos et al., 2007). Al contrario, più

recentemente, Tandom e colleghi hanno dimostrato che la gemmazione di HCMV

risulta significativamente ridotta quando il pathway di biogenesi dei MVB venga

bloccato, tramite l’espressione di forme dominanti negative di proteine chiave

nella biogenesi di questi organelli (Tandom et al., 2009).

Approfondendo i meccanismi molecolari che permettono ad HSV-1 di utilizzare

questo pathway, il nostro gruppo di ricerca ha chiarito come la glicoproteina B

(gB) giochi un ruolo in questo contesto. In particolare, abbiamo dimostrato che la

maturazione, il trafficking intracellulare e la localizzazione di gB richiedono una

corretta biogenesi dei MVB (Calistri et al. 2007). gB viene indirizzata ai MVB

grazie alla mono-ubiquitinazione della sua coda citoplasmatica e mutanti virali

esprimenti forme tronche di gB hanno una capacità ridotta di dare origine a

particelle mature e infettive (Calistri et al. 2007).

Il presente progetto di tesi è nato con l’obiettivo di chiarire se altri virus

appartenenti alla famiglia Herpesviridae utilizzino i MVB durante il proprio ciclo

replicativo. A tale scopo, siamo partiti dal presupposto che, essendo gB una delle

proteine più conservate all’interno della famiglia Herpesviridae, gli omologhi

della stessa in α, β e γ herpesvirus potessero svolgere un ruolo simile a quello da

noi dimostrato nel caso di HSV-1. In particolare, abbiamo focalizzato la nostra

attenzione su UL55, la gB di HCMV. I risultati riportati in questa tesi dimostrano

57

_______________________________________________________________________________

come anche la gB di HCMV rappresenti un link tra il virus e i MVB, ma con un

meccanismo diverso rispetto a quanto precedentemente dimostrato per l’omologo

in HSV-1.

58

____________________________________________________________Materiali e metodi

3 MATERIALI E METODI

3.1 Linee cellulari

In questo lavoro sono state utilizzate le seguenti linee cellulari:

293T: cellule embrionali di rene umano a morfologia stellata, che esprimono

costitutivamente l'antigene T del virus vacuolante della scimmia (SV40),

garantendo un’efficiente replicazione dei vettori plasmidici che contengono

l'origine di replicazione di tale virus. Le cellule 293T sono state gentilmente

fornite dal Dott. Baltimore (Rockfeller University, New York) (ATTC Number

CRL-11268). Le cellule 293T erano coltivate in terreno di crescita DMEM

(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), addizionato con il 10% (v/v) di FBS,

(fetal bovine serum, Gibco), inattivato a 56°C per 30 minuti, L-glutamina 2 mM e

con gli antibiotici penicillina (100 U/ml) (Sigma) e streptomicina (100 µg/ml)

(Sigma)

COS 7: cellule di rene di scimmia a morfologia simil-fibroblastica, trasformate

con un mutante di SV40 difettivo dell’origine di replicazione e codificante

l’antigene T. Rappresentano, pertanto, un sistema d’ospite particolarmente

favorevole per realizzare trasfezioni in transient con plasmidi contenenti l’origine

di replicazione di SV40. Le cellule Cos7 venivano mantenute in MEM (Eagle’s

minimum essential medium) contenente il 5% (v/v) di FCS (fetal calf serum), L-

glutamina, penicillina e streptomicina.

HFF (human foreskin fibroblast): fibroblasti umani, coltivati in MEM addizionato

con il 10% (v/v) di FCS, L-glutamina, penicillina e streptomicina.

MCR5 (human embryonic lung fibroblast): fibroblasti umani, coltivati in DMEM

con il 10% (v/v) di FCS, L-glutamina, penicillina e streptomicina.

Tutte le colture cellulari erano mantenute alla temperatura costante di 37°C in

ambiente umidificato al 5% di CO2 e sottoposte a periodici controlli per escludere

contaminazioni.

59

_______________________________________________________________________________

3.2 Ceppi virali

I ceppi virali utilizzati sono di seguito riportati:

HCMV AD169: questo isolato è il ceppo di laboratorio di HCMV ed è

stato interamente sequenziato nel 1990 (gentilmente fornito dalla Prof.ssa

Loregian, Università di Padova). Numero di riferimento NCBI: X17403.

HCMV TB40-BAC4: ricostituito dal ceppo endotelio-tropico TB40/E

(Sinzger et al., 2008) (fornito dal Dott. von Einem, Institute of Virology,

Uniklinik Ulm, Germany). Numero di riferimento NCBI: EF999921. ll

ceppo TB40/E è stato clonato come BAC in E.coli, come descritto in Hahn

et al., 2002. Brevemente, cellule HFF sono state trasfettate con il plasmide

pEB1097 contenente una cassetta tk-gpt-bac fiancheggiata dalle sequenze

omologhe a US1-US2 da una parte e US6-US7 dall’altra. Il giorno dopo il

monostrato è stato infettato con TB40/E a m.o.i. 5. Dopo 3 cicli di

selezione con xantina e acido micofenolico il DNA è stato estratto ed

elettroporato in E.coli DH10B. I batteri sono stati piastrati in terreno con

cloramfenicolo (CAF) e poi le colonie sono state coltivate in forma

liquida. 18 cloni sono stati usati per ricostituire il virus infettivo in cellule

MRC5 (ceppi TB40E-BAC 1-18). Tra questi il clone TB40(E)-BAC4 è

stato sequenziato, caratterizzato fenotipicamante e usato per la generazione

di mutanti.

3.3 Plasmidi

Di seguito sono descritti i plasmidi utilizzati in questo lavoro sperimentale:

pBJ5: plasmide che consente l’espressione in cellule eucariotiche di

sequenze geniche grazie alla presenza di un promotore ibrido (SRα)

costituito dalla sequenza del promotore precoce di SV40 fusa con la

regione R ed U5 derivata dalla LTR (long terminal repeat) del virus della

leucemia umana tipo 1 (human T-cell leukemia virus type-1, HTLV-1)

(Takebe et al., 1988) (Strack et al., 2003).

pBJ5-5’Flag Vps4: plasmide che deriva da pBJ5, in cui è stato inserito nel

sito di policlonaggio, a livello dei siti di restrizione XhoI ed EcoRI, il gene

che esprime la proteina Vps4A, alla quale è stata fusa in 5’ la sequenza

dell’epitopo Flag (Strack et al., 2003).

60

____________________________________________________________Materiali e motodi

pBJ5-5’FlagVps4E228Q: plasmide che deriva da pBJ5 5’Flag Vps4, nel

quale il gene che esprime la proteina Vps4 è stato mutagenizzato

sostituendo in posizione 228 della sequenza aminoacidica l’aminoacido

acido glutammico con l’aminoacido glutammina (Strack et al., 2003).

pcDNA3.1 e pcDNA3.1/V5-His/TOPO (Invitrogen): plasmidi dotati del

promotore precocissimo del HCMV, contenenti i geni per la resistenza

all’ampicillina (Amp) e il promotore e l’origine di SV40, seguiti dal gene

per la resistenza alla neomicina per l’espressione in cellule dotate

dell’antigene T di SV40. Rispettivamente a monte e a valle del sito di

policlonaggio sono state inserite le sequenze dei primer universali T7 e

BGH, utili per il sequenziamento. Il plasmide del kit Invitrogen

pcDNA3.1/V5-His/TOPO TA Expression Kit permette l’inserimento del

frammento di PCR poliadenilato per complementarietà con la porzione di

poli-T a singolo filamento alle due estremità del vettore lineare.

pBJ5-5’HA Tsg101: codifica la forma wt della proteina umana Vps23,

fusa in 5’ all’HA (Strack et al., 2003).

pBJ5-5’Flag AIP4, pBJ5-5’Flag WWP1, pBJ5-5’Flag Nedd4-1, pBJ5-

5’Flag Nedd4-2s e le rispettive forme mutate pBJ5-5’Flag AIP4C830S,

pBJ5-5’Flag WWP1C886S, pBJ5-5’Flag Nedd4-1C867S, pBJ5-5’Flag Nedd4-

2sC801S: codificano le forme wt e le forme cataliticamente inattive delle

ubiquitino ligasi AIP4, WWP1, Nedd4-1, Nedd4-2s fuse in 5’ al Flag

(Strack et al., 2000; 2003).

SRα-HA Ubi: esprime l’ubiquitina wt fusa all’HA (Strack et al., 2002).

pgBwt-MTS-HSV-1 gB: codifica la gB di HSV-1 ceppo F (gentilmente

fornito dalla Prof.ssa Campadelli-Fiume, Università di Bologna).

pcDNA3.1-UL27: codifica l’omologo della gB in PRV (UL27)

(gentilmente fornito dalla Prof.ssa Campadelli-Fiume).

pcDNA3.1-5’HA AMSH: codifica la deubiquitinasi AMSH fusa in 5’

all’HA (Zamborlini et al., 2006).

pEGFP C1-UBPY e pEGFP C1-UBPYC786S: codificano la deubiquitinasi

UBPY ed il suo mutante (gentilmente forniti dalla Prof.ssa Urbé,

Physiological Laboratory, School of Biomedical Sciences, University of

Liverpool).

61

_______________________________________________________________________________

pBJ5-5’HA Hrs: esprime la proteina umana Hrs fusa in 5’ all’epitopo HA

(gentilmente fornito dal Prof. Göttlinger, UMass Medical School,

Worcester).

pCR3.1-5’myc GGA1: esprime la proteina umana GGA1 fusa in 5’

all’epitopo myc (gentilmente fornito dalla Prof. Bonifacino, National

Institutes of Health, Bethesda).

pcDNA3HFN-5’Flag Tom1 e pcDNA3HFN-5’Flag Tom1L1: esprimono

le proteine umane Tom1 e Tom1L1 fuse in 5’ all’epitopo Flag

(gentilmente forniti dal Prof. Nakayama, Kyoto University).

pMSCV-5’Flag Tsg101: vettore oncoretrovirale che esprime la proteina

umana Tsg101 fusa al N-termine con l’epitopo Flag. Il vettore contiene le

sequenze LTR 5’ e 3’ del virus del sarcoma mieloproliferativo (pMSCV).

A valle della 5’ LTR è presente il segnale di incapsidazione (Ψ) e il sito di

policlonaggio. E’ inoltre presente, a monte della 3’ LTR, il gene che

conferisce la resistenza alla puromicina sotto il controllo trascrizionale del

promotore della fosfoglicerato chinasi murina; questa resistenza permette

la selezione di cloni cellulari che esprimono stabilmente il costrutto

(gentilmente fornito dal Prof. Göttlinger).

pMSCV-LTR GFP: vettore oncoretrovirale del tutto simile a quello

precedentemente descritto ma che esprime come transgene eterologo il

gene reporter GFP (gentilmente fornito dal Prof. Göttlinger).

MLV Gag-Pol: codifica Gag-Pol di MLV (virus della leucemia murina),

fornendo il packaging alle particelle oncoretrovirali (gentilmente fornito

dal Prof. Göttlinger).

VSV-G: codifica la glicoproteina del virus della stomatite vescicolare,

usata per pseudotipizzare le particelle oncoretrovirali, aumentandone così

il tropismo.

pEF (Invitrogen): plasmide dotato del promotore EF1α, contenenti i geni

per la resistenza all’Amp, il promotore e l’origine di SV40 e il gene per la

resistenza alla neomicina. A monte e a valle del sito di policlonaggio vi

sono le sequenze dei primer universali T7 e BGH usati per il

sequenziamento.

psVT28: vettore che contiene la sequenza Tn10 in grado di codificare in

modo costitutivo il repressore Tet (TetR). Il repressore, legando le

62

____________________________________________________________Materiali e motodi

sequenze dell’operatore tet (tetO) posto entro il promotore di SV40, sotto

cui è posto il gene di interesse, interferisce con la formazione del

complesso di inizio trascrizione. Il legame di TetR è controllato dalla

tetraciclina o dal suo analogo doxiciclina, che riducendo l’affinità del

repressore per l’operatore permettono l’avvio della trascrizione

(gentilmente fornito dal Dott. von Einem).

psVT28-GFP Vp4 e psVT28-GFP Vp4E228Q: esprimono Vps4 e Vps4E228Q

fuse in 5’ alla GFP (gentilmente concessi dal Dott. von Einem).

BAC 36: cromosoma artificiale batterico contenente il genoma di HHV-8,

il gene reporter GFP e il gene per la resistenza all’igromicina (gentilmente

fornito dal Dott. Gao, University of Texas, San Antonio, USA).

pCMV71, plasmide che codifica la fosfoproteina del tegumento pp71 che

funziona da transattivatore virale ed usato in vitro per incrementare

l’efficienza di trasfezione del DNA virale (gentilmente fornito dal Dott.

von Einem).

Il mantenimento dei plasmidi in cellule procariotiche è consentito dall’origine di

replicazione batterica ColE1 o pUC di E.coli. Per l’amplificazione dei plasmidi in

cellule procariotiche è stato utilizzato il ceppo DH5α di E.coli (Invitrogen)

[endA1 hsdR17 (rK-mK

+) glnV44thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 ∆ (laclZYA-

argF)U169 deoR (φ80dlac∆(lacZ)M15)].

Il ceppo batterico DH5α era coltivato in forma liquida in terreno Luria-Bertani

[LB, Bacto-triptone 1% (p/v), estratto di lievito 0,5% (p/v), NaCl 1% (p/v)] in

condizioni di agitazione a 37°C. Quando necessario, il terreno veniva solidificato

mediante aggiunta di agar 1,5% (p/v). Quando richiesto, era aggiunto l’antibiotico

di selezione, che consente la crescita selezionata di batteri resistenti, e CAF (12,5

µg/ml), che inibisce la sintesi proteica, legando il rRNA 23S della subunità 50S

del ribosoma batterico e inibendo la peptidil-trasferasi e usato per la crescita di

ceppi batterici contenenti il plasmide a basso numero di copie pBJ5.

63

_______________________________________________________________________________

3.4 Oligonucleotidi innesco

Nelle reazioni di amplificazione a catena della polimerasi (PCR), di mutagenesi e

di sequenziamento sono stati utilizzati oligonucleotidi innesco opportunamente

disegnati e riportati nelle tabelle 3.4.1, 3.4.2 e 3.4.3.

UL55 F 5’ GAT AAT GCC ACC ATG GAA TCC AGG ATC TGG TGC 3’

UL55 3’ Flag

UL55 3’Flag R 5’ CAT TAT TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC GAG GTT CTC TTC TTC GTC 3’

UL55 HindIII F 5’ CCC AAG CTT GCC ACC ATG GAA TCC AGG ATC TGG TGC 3’

UL55 3’ HA

UL55 3’HA R 5’ C TAG TCT AGA TCA AGC GTA ATC TGG GAC GTC GTA TGG GTA GAC GTT CTC TTC TTC GTC 3’

UL55833 F 5’ GAT AAT GCC ACC ATG GAA TCC AGG ATC TGG TGC 3’

UL55833 3’Flag

UL55833 3’Flag R

5’ CAT TAT TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC GAG GTT CTC TTC TTC GTC 3’

UL55 HindIII F 5’ CCC AAG CTT GCC ACC ATG GAA TCC AGG ATC TG GTG C 3’

UL55833 3’ HA

UL55833 3’HA R 5’ C TAG TCT AGA TCA AGC GTA ATC TGG GAC GTC GTA TGG GTA GGA TGC ATC AGA CGA CGG 3’

UL55 BamHI-AscI F

5’ CAC CGG ATC CGG CGC GCC ACC ATG GAA TCC AGG ATC TGG TGC CTG 3’

UL55 3’HA (pEF, pSVT28) UL55 3’HA

SwaI-NotI R 5’ T CAG CGG CCG CAT TTA AAT TCA AGC GTA ATC TGG GAC GTC GTA TG 3’

UL55 HindIII F 5’ CCC AAG CTT GCC ACC ATG GAA TCC AGG ATC TG GTG C 3’

UL55 untagged

UL55 untagged NotI-XbaI R

5’ CTA GTC TAG AGC GGC CGC TCA GAC GTT CTC TTC TTC GTC G 3’

ORF8 F 5’ GAT AAT GCC ACC ATG ACT CCC AGG TCT AGA TTG GCC 3’

ORF8 3’Flag

ORF8 3’Flag R 5’ CAT TAT TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC CTC CCC CGT TTC CGG AC 3’

ORF8787 F 5’ GAT AAT GCC ACC ATG ACT CCC AGG TCT AGA TTG GCC 3’

ORF8787 3’Flag

ORF8787 3’Flag R 5’ CAT TAT TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC GAT TTC CTC CCG TGT TGG GG 3’

UL27 F 5’ TAA GGA TCC GCC GCC ATG CCC GCT GGT GGC GG 3’

UL27 3’Flag

UL27 3’Flag R 5’ CAT TAT GAA TTC CTA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC CAG GGC GTC GGG GTC C 3’

UL27882 F 5’ TAA GGA TCC GCC GCC ATG CCC GCT GGT GGC GG 3’

UL27882 3’Flag

UL27882 3’Flag R 5’ CAT TAT GAA TTC CTA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC CCC GCT GTT CTT CTT GCG CG 3’

UL75 F 5’ CCC AAG CTT GCC GCC ATG CGG CCC GGC CTC CCC C 3’

UL75 3’Flag

UL75 3’ Flag R 5’ C TAG TCT AGA TCA CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC GCA TGT CTT GAG CAT GCG GTA GA 3’

64

____________________________________________________________Materiali e motodi

UL115 BamHI F

5’ CGC GGA TCC GCC GCC ATG TGC CGC CGC CCG GAT TG 3’

UL115 3’HA

UL115 3’HA EagI R

5’ ATAC CGG CCG TTA AGC GTA ATC TGG GAC GTC GTA TGG GTA GCG AGC ATC CAC TGC TTG AGG 3’

5’HA Tsg101 XhoI F

5’ TAA CTC GAG GCC GCC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAT TAC GCT GCG GTG TCG GAG AGC CA 3’

Tsg101 1-145 EcoRI R

5’ CAT CCG GAA TTC TCA ACG AGA GAA GAC TGG AGG TTC 3’

Tsg101 1-215 EcoRI R

5’ CAT CCG GAA TTC TCA GGC TCG GAT GGT GTC CTC 3’

5’HA Tsg101 215-390 XhoI F

5’CAT CCG CTC GAG GCC GCC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAT TAC GCT CTC ATC TCT GCG GTC AGT 3’

Tsg101 390 EcoRI R

5’ CAT CCG GAA TTC TCA GTA GAG GTC ACT GAG ACC G 3’

5’HA Tsg101

5’HA Tsg∆UEV 146-390 XhoI F

5’ CAT CCG CTC GAG GCC GCC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAT TAC GCT ATT TCG GCA TCC TAT CCG CCA 3’

5’HA UBPY BamHI F

5’ CGC GGA TCC GCC GCC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAT TAC GCT CCT GCT GTG GCT TCA GTT 3’

5’HA UBPY

UBPY EagI R 5’A TAC CGG CCG TTA TGT GGC TAC ATC AGT TAC TC 3’

Tabella 3.4.1 Sequenze dei primer utilizzati per i clonaggi. Si evidenziano la porzione dei

primer contenente la sequenza degli epitopi Flag o HA, la sequenza di Kozak necessaria per

ottimizzare la sintesi proteica, i siti di restrizione degli enzimi usati per i clonaggi, i codoni di

inizio trascrizione ATG e di fine trascrizione CTA, TTA o TCA.

UL55PPSA mut F 5’ CG TCG TTA CAG GCT (CCG CCT TCC [GCC]) GAG GAA AGT G 3’

UL55PPSA mut R 5’ C ACT TTC CTC ([GGC] GGA AGG CGG) AGC CTG TAA CGA CG 3’

AMSHD348A mut F 5’ CTC TCC AGT GTC [GCC] CTA CAC ACT CAC TGC 3’ AMSHD348A mut R 5’ GCA GTG AGT GTG TAG [GGC] GAC ACT GGA GAG 3’ Tsg101N45A mut F 5’ TGG GAT TCA TAT GTT TTT[GCC]GAT GGC AGT TCC AGG

GAA 3’ Tsg101N45A mut R 5’ TTC CCT GAA ACT GCC ATC [GGC] AAA AAC ATA TGA

ATC CAA 3’ Tsg101M95A mut F 5’ TTT GTT AAG CCT ACT AGT TCA [GCG] ACT ATT AAA ACA

GGA AAG CAT 3’ Tsg101M95A mut R 5’ ATG CTT TCC TGT TTT AAT AGT [CGC] TGA ACT AGT AGG

CTT AAC AAA A 3’

Tabella 3.4.2 Sequenze dei primer utilizzati per le reazioni di mutagenesi. Tra parentesi tonde

vi è la sequenza PPSY, tra parentesi quadre l’aminoacido mutato e sono sottolineati i nucleotidi

che mutano le sequenze wt.

65

_______________________________________________________________________________

Mut UL55PPSY F 5’ G GGC AGC ACC AAA GAC ACG TCG TTA CAG GCT (CCG CCT TCC [GCC]) GAG GAA AGT GTT TAT AAT TAG GAT GAC GAC GAT AAG TAG GG 3´

Mut UL55PPSY R

5´ TCC CGG TCC TTT GCG ACC AGA ATT ATA AAC ACT TTC CTC ([GGC] GGA AGG CGG) AGC CTG TAA CAA CCA ATT AAC CAA TTC TGA TTA G 3´

Mut UL55833 F

5’ TGG TCG CAA AGG ACC GGG ACC ACC GTC GTC TGA TGC ATC C [TGA] CGG CGG CTC CGC CTT ACA CAG GAT GAC GAC GAT AAG TAG GG 3´

Mut UL55833 R

5´ TCT GGT AAG CCT GCT CGT TGG TGT AAG GCG GAG CCG CCG [TCA] GGA TGC ATC AGA CGA CGG CAA CCA ATT AAC CAA TTC TGA TTA G 3´

Mut UL55∆13-783 F

5’ AC ATG GAA TCC AGG ATC TGG TGC CTG GTA GTC TGC GTT AAA ACC TCT TTC CCT ATC TGG TAG GAT GAC GAC GAT AAG TAG GG 3’

Mut UL55∆13-783 R

5’ CG GTG GTC CCG TCG GCG GAC ACC AGA TAG GGA AGA GGT TTT AAC GCA GAC TAC CAG GCA CAA CCA ATT AAC CAA TTC TGA TTA G 3’

PCR UL55PPSY/UL55833 F 5’ G GTC GAA GGC GTT GCC ACC 3’ PCR UL55PPSY/UL55833 R 5’ TCA GAC GTT CTC TTC TTC GTC AGA GTC 3’ PCR UL55∆13-783 F 5’ GG AGC CGG ACC GAC TTT GG 3’ PCR H UL55 HEB R 5’ G ATC CAG CTT GAT ATC GGA TCC TCA GAC

GTT CGC TTC TTC GTC AGA G 3’ AphAI-seq1 5’ GCA GTT TCA TTT GAT GCT CGA TG 3’ AphAI-seq2 5’ CGT TTC CCG TTG AAT ATG GCT C 3’

Tabella 3.4.3 Sequenze dei primer utilizzati per la mutagenesi col BAC e per il controllo

delle mutagenesi per PCR. Tra parentesi tonde vi è la sequenza PPSY, tra parentesi quadre

l’aminoacido mutato e sono sottolineati i nucleotidi che mutano le sequenze wt. Si evidenzia la

porzione dei primer contenente la sequenza omologa al templato pEPkan-S.

T7 5’ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3´ BGH 5´ TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3´ M13 F 5’ GTA AAA CGA CGG CCA G 3´ M13 R 5´ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3´ Tsg101M95A seq F 5’ AAT GTT ATT ACT CTA TAC 3’ Tsg101N45A seq F 5’ GCG GTG TCG GAG AGC CAG 3’ gB-112nt F 5’ GG AGC CGG ACC GAC TTT GG 3’ gB+2219nt F 5’ G GTC GAA GGC GTT GCC ACC 3’

Tabella 3.4.4 Sequenze dei primer utilizzati per i sequenziamenti.

3.5 Tecniche di biologia molecolare

3.5.1 Purificazione del DNA plasmidico

Sono stati utilizzati diversi protocolli per la purificazione del DNA plasmidico,

che permettono di ottenere rese e gradi di purezza differenti.

Il protocollo della lisi alcalina modificato (Sambrook et al., 1989) permette di

purificare DNA a bassa resa (Mini prep) e ad un basso livello di purezza. I batteri

erano risospesi in una soluzione contenente glucosio 50 mM, Tris-HCl 25 mM pH

8.0 e EDTA 10mM pH 8.0; la lisi batterica veniva effettuata in una soluzione

66

____________________________________________________________Materiali e motodi

basica a base di NaOH 0,2 M e SDS 0,1%; infine una soluzione di potassio

acetato 5 M ripristinava il pH fisiologico. Il DNA veniva poi risospeso in buffer

TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8), addizionato di RNAsi

pancreatica (1 mg/ml, Roche).

Le Mini prep e le preparazioni plasmidiche in grande scala (Maxi prep) ad elevato

grado di purezza erano preparate con il metodo della lisi alcalina e purificate

rispettivamente con i kit QIAprep Spin Miniprep Kit o Plasmid Maxi Kit

(Qiagen). Il surnatante, ottenuto tramite centrifugazione delle cellule batteriche

lisate, veniva applicato ad una colonna a scambio anionico capace di legare il

DNA plasmidico. In tal modo era purificato da RNA, proteine ed impurità ad alto

peso molecolare utilizzando tamponi a bassa concentrazione salina. Il DNA

plasmidico era successivamente eluito dalla colonna per mezzo di tamponi ad

aumentata concentrazione salina. L’eluato così ottenuto veniva concentrato e

sottoposto a precipitazione con isopropanolo e, successivamente, ad un lavaggio

con etanolo al 70% (v/v) per rimuovere i sali. Il DNA ottenuto era sottoposto a

controllo mediante restrizione enzimatica (paragrafo 3.5.2) e successiva

migrazione elettroforetica in gel d’agarosio in tampone salino TBE 1X (Tris-

borato 0,009 M, EDTA 1 mM); inoltre la quantità di acido nucleico era

quantificata mediante lettura allo spettrofotometro (Eppendorf, Biophotometer),

alla lunghezza d’onda di 260 nm, corrispondente al massimo di assorbimento,

utilizzando cuvette di quarzo aventi un cammino ottico di 0,1 cm. La

concentrazione del DNA veniva calcolata tramite la legge di Lambert-Beer (A =

εxCxS, dove A = densità ottica; ε = coefficiente di estinzione molare, che per il

DNA a doppio filamento a 260 nm vale 6600 M-1 cm-1; C = cammino ottico; S =

concentrazione soluzione). La presenza di eventuali contaminazioni proteiche era

rilevata tramite lettura della preparazione alla lunghezza d’onda di 280 nm, alla

quale il legame peptidico ha il picco di assorbimento. Venivano considerate pure

le preparazioni per le quali il rapporto D.O.260/D.O.280 era compreso tra 1,8 e 2. Il

DNA plasmidico così ottenuto, presentando un elevato grado di purezza, poteva

essere utilizzato nelle trasfezioni di cellule eucariotiche.

67

_______________________________________________________________________________

3.5.2 Restrizioni enzimatiche

Le reazioni di restrizione enzimatica del DNA erano effettuate utilizzando gli

opportuni enzimi (Biolabs) nei rispettivi tamponi di reazione. Le reazioni erano

condotte alla temperatura ottimale dell’enzima (in genere 37°C) per il tempo

richiesto, a seconda del tipo di endonuclesi impiegata e della quantità di acido

nucleico da digerire; le unità di enzima impiegate erano proporzionali alla quantità

di DNA da digerire. Al termine della digestione i campioni venivano analizzati

tramite migrazione elettroforetica in gel d’agarosio all’1% addizionato di etidio

bromuro in tampone salino TBE 1X (Tris-borato 9 mM, EDTA 1mM) e

visualizzati al transluminatore a raggi UV. Per verificare la corretta dimensione

dei frammenti erano impiegati opportuni marcatori di peso molecolare noto, quali

il Marker VII (0,25 µg/ml) e il Marker II (0,25 µg/ml) (Roche/Boehringer).

3.5.3 Tecniche di clonaggio

In questo lavoro di tesi sono state utilizzate tre strategie di clonaggio.

Prima tecnica: si basava sull’amplificazione della sequenza genica da clonare

mediante la tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR, paragrafo

3.5.4). A tale scopo sono stati disegnati opportuni oligonucleotidi innesco in grado

di amplificare l’intera sequenza di interesse, addizionati all’estremità 5’ da

sequenze di taglio di opportuni enzimi di restrizione (Tabella 3.4.1). La PCR era

caricata in gel di agarosio e per verificare la corretta dimensione dei frammenti

venivano utilizzati opportuni marcatori di peso molecolare noto. Il frammento di

gel contenente la banda corretta era tagliato mediante l’utilizzo di un bisturi ed il

DNA era eluito grazie all’utilizzo del kit QIAGEN® "QIAquick gel extraction

kit”. Questo sistema è basato sulla solubilizzazione dell'agarosio e sul successivo

legame specifico degli acidi nucleici, in presenza di un tampone ad alta

concentrazione salina, alla membrana di silice-gel di una colonna a scambio

anionico. Le impurità, quali sali, agarosio, etidio bromuro, non sono trattenute

dalla membrana di silice ed il DNA così purificato era eluito con un tampone ad

alta forza ionica. Poi il prodotto di PCR era sottoposto a digestione enzimatica con

gli opportuni enzimi scelti per il clonaggio, i cui siti di restrizione erano contenuti

rispettivamente nei primer F e R. Il vettore eucariotico veniva sottoposto a

digestione con gli stessi enzimi e a defosforilazione con la fosfatasi alcalina ed il

68

____________________________________________________________Materiali e motodi

suo buffer (Tris-HCl 50mM, MgCl2 10mM, DTT 10mm, ATP 1mM). Entrambi i

prodotti di restrizione erano nuovamente analizzati in gel d’agarosio allo 0,7% per

verificare la corretta dimensione dei frammenti e purificare il DNA dai tamponi

usati nella restrizione enzimatica ed estratti con il kit Quiaquick Gel extraction.

Per inserire il DNA nel vettore erano sfruttate le proprietà enzimatiche della DNA

ligasi del batteriofago T4 (4x105 U/ml) (Biolabs), capace di catalizzare in vitro la

formazione di legami fosfodiesterici tra il residuo di fosfato in 5' ed il gruppo

idrossilico in 3' delle estremità adiacenti. Le reazioni venivano effettuate in un

volume finale di 20 µl impiegando 1 unità di ligasi e incubate per 16 ore a 16°C.

Le quantità dei due frammenti usate nella reazione di ligazione erano calcolate

utilizzando la seguente formula:

X(ng)= Ypb x 50/ pb V

Dove:

X = ng dell’inserto

Ypb = paia di basi dell’inserto

50 = 50 ng di vettore

pb V = dimensioni in paia di basi del vettore plasmidico

Si trattava in tutti i casi di ligazioni direzionate, in quanto le estremità

dell’amplificato e quelle del vettore erano prodotte utilizzando gli stessi enzimi e

quindi la probabilità che il frammento di interesse si inserisse nel vettore con

l’orientamento corretto era molto alta. Inoltre, era improbabile che il vettore si

richiudesse, in quanto le sue estremità risultavano incompatibili.

Seconda tecnica: in seguito all’amplificazione della sequenza genica da clonare

mediante PCR e all’estrazione e purificazione della banda di PCR corretta, il

DNA veniva poliadenilato, aggiungendo a 700 ng di prodotto di PCR 1 µl di Taq

DNA polimerasi gold (pre-attivata per 10 minuti a 95°C), 1 µl di buffer della Taq

gold contenente MgCl2+ e 1 µl di dATP 0,2 mM. Dopo 30 minuti a 70°C al

frammento poliadenilato (400-500 ng) era aggiunto il vettore pcDNA3.1/V5-

His/TOPO (5 ng) e 1 µl di soluzione salina (NaCl 1,2 M, MgCl2 0,06 M). La

reazione era mantenuta a temperatura ambiente per 30 minuti e poi bloccata in

ghiaccio. Infine per la trasformazione venivano usate le cellule competenti E.coli

TOP10 (paragrafo 3.5.5).

69

_______________________________________________________________________________

Terza tecnica: prevedeva l’ottenimento del frammento di DNA da clonare

mediante restrizione enzimatica di un plasmide contenente la sequenza genica di

interesse. Il frammento purificato da gel d’agarosio come precedentemente

descritto era utilizzato per la reazione di ligazione con l’opportuno plasmide.

Per tutte le tecniche di clonaggio i prodotti di ligazione venivano utilizzati per la

trasformazione dei batteri competenti (come descritto nel paragrafo 3.5.5) e fatti

crescere in terreno selettivo contenente l’antibiotico di selezione. Le colonie

resistenti erano incubate in 5 ml di terreno LB in presenza dell'antibiotico e fatte

crescere in agitazione 12 ore a 37°C. La presenza del DNA plasmidico veniva

verificata eseguendo miniprep con il metodo della lisi alcalina modificato. Il DNA

plasmidico purificato dai cloni così ottenuti era sottoposto a varie restrizioni

enzimatiche ed analizzato in gel d’agarosio all’1% per verificare la presenza

dell’inserto. Dai cloni contenenti la sequenza genica d’interesse il DNA

plasmidico era estratto mediante il kit QIAprep Spin Miniprep kit, per poter essere

controllato mediante sequenziamento. Una volta verificata la correttezza della

sequenza, si ottenevano le preparazioni plasmidiche ad alta resa con il kit Plasmid

Maxi.

3.5.4 Reazione di amplificazione a catena della polimerasi

Per amplificare la sequenza genica da clonare sono state eseguite reazioni di PCR

a partire da DNA plasmidico o genomico. Per amplificare i geni di HCMV è stato

utilizzato come templato il DNA genomico virale di HCMV ceppo AD169

estratto medinate il kit “QIAmp MinUlute Virus Spin, Qiagen”.

Nelle reazioni di PCR sono stati utilizzati i seguenti enzimi:

iProof High-Fidelity DNA Polymerase, il suo buffer iProof GC Buffer

(Bio-Rad), particolarmente adatto per amplificare templati ricchi in GC;

I- PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase (Biolabs).

La mix di PCR era preparata aggiungendo una miscela di dNTPs 0,2 mM, primer

forward (F) e reverse (R) 0,5 µM, l’enzima 1 U/µl, il suo buffer e 100 ng di

templato. Quando la sequenza da amplificare conteneva un’alta percentuale di

basi GC, alla miscela di reazione era aggiunto dimetilsulfossido al 2% (DMSO,

Sigma) per facilitare la denaturazione della sequenza genica di interesse. Il ciclo

70

____________________________________________________________Materiali e motodi

di PCR prevedeva uno step iniziale di denaturazione del DNA e attivazione della

polimerasi a 98°C per 60 secondi; un ciclo di denaturazione a 98°C per 10

secondi; l’annealing ad una temperatura superiore di 3°C rispetto a quella più

bassa tra i due primer per 30 secondi; l’elongazione a 72°C per 30 secondi/Kb. In

genere, venivano effettuati 35 cicli di amplificazione in termociclatore

(Mastercycler personal, Eppendorf), seguiti dall’estensione finale a 72°C per 7

minuti.

3.5.5 Competenza e trasformazione batterica

I plasmidi ed i prodotti delle reazioni di ligazione sono stati trasformati in tre tipi

di cellule competenti a seconda del tipo di plasmide utilizzato.

La maggior parte venivano trasformati in cellule di E.coli, ceppo DH5α, rese

artificialmente competenti mediante la tecnica del cloruro di calcio. Le colonie

batteriche erano fatte crescere a 37°C in 3 ml di terreno liquido LB contenente

MgCl2 15 mM, in assenza di antibiotico per circa 12 ore, fino a raggiungere una

densità ottica pari a 0,4 alla lunghezza d'onda di 600 nm. In seguito, l'inoculo era

trasferito in 400 ml dello stesso terreno. Una volta raggiunta la densità ottica pari

a 0,4 alla lunghezza d'onda di 600 nm, si raffreddava rapidamente la coltura in

ghiaccio per interrompere la crescita batterica; i batteri erano quindi sedimentati

per centrifugazione a 3500 rpm a 4°C per 15 minuti e risospesi in una soluzione

fredda contenente MnCl2-4H2O 10 mM, CaCl2 50 mM, MES [2-

(Nmorpholino)ethanesulfonic acid] 10 mM pH 6.3. I batteri venivano poi

centrifugati, delicatamente risospesi in 10 ml della stessa soluzione fredda

addizionata di glicerolo al 15% (v/v) e, quindi, aliquotati e conservati a -80°C. La

trasformazione di questo tipo di cellule competenti avveniva con il metodo

chimico mediante shock termico. Veniva cioè addizionato a 50 µl di cellule

batteriche competenti il DNA plasmidico (50-300 ng) o i prodotti delle reazioni di

ligazione, e la miscela era lasciata ad incubare in ghiaccio per 30 minuti. In

seguito era praticato lo shock termico a 37°C per 2 minuti. I batteri erano poi

raffreddati in ghiaccio qualche istante ed incubati a a 37°C per un'ora in 200 µl di

LB, consentendo così l’espressione e la sintesi della proteina che conferisce la

resistenza all'antibiotico di selezione. In seguito, tutta la sospensione era seminata

in piastre Petri contenenti LB-agar addizionato con l’antibiotico di selezione

71

_______________________________________________________________________________

(Amp 100 µg/ml o kanamicina (Kan) 50 µg/ml ed incubata 12 ore a 37°C al fine

di selezionare i batteri trasformati.

Le ligazioni dei kit pcDNA3.1/V5-His/TOPO TA Expression Kit erano

trasformate nel ceppo E.coli TOP10 (Invitrogen). Le cellule scongelate in

ghiaccio venivano addizionate con il vettore contenente l’inserto sottoposto a

poliadenilazione e TA-cloning. Si procedeva con lo shock termico di 2 minuti a

42°C seguito da incubazione in ghiaccio. Dopo l’aggiunta di 200 µl di terreno LB

senza antibiotico si incubava la miscela per un’ora a 37°C e infine la sospensione

era seminata in piastre Petri contenenti LB-agar addizionato con l’antibiotico di

selezione ed incubata 12 ore a 37°C.

Le ligazioni del vettore psVT28 venivano trasformate per elettroporazione nelle

cellule competeneti PIR1. La preparazione delle cellule elettrocompetenti era

eseguita come segue: i batteri erano fatti crescere in 200 ml di LB. Quando la

coltura raggiungeva un’OD600 di circa 0,5-0,7 era trasferita in ghiaccio per 5

minuti e poi sedimentata per centrifugazione a 6000 rpm per 10 minuti a 4°C. Poi

con risospensione e centrifugazioni successive i batteri venivano lavati 3 volte con

una soluzione fredda di glicerolo 10%. Dopo l’ultimo lavaggio a 6000 rpm per 5

minuti a 4°C erano risospesi in un piccolo volume di glicerolo 10% e le aliquote

erano conservate a -80°C. La trasformazione di plasmidi e ligazioni contenenti il

vettore psVT28 era eseguita aggiungendo 300 ng di DNA ad ogni aliquota di 50

µl di batteri. L’elettroporazione veniva eseguita a 1,25 kV, 3 µF, 200 Ohm in

cuvette da 1 mm (Biotechnologie GmbH). Poi si aggiungevano ai batteri 900 µl di

SOC-Medium pre-riscaldato e la miscela era lasciata per un’ora a 37°C, prima di

essere seminata in piastre di LB-agar addizionate dell’opportuno antibiotico (per

il vettore psVT28 era utilizzata zeocina 30 µg/ml).

3.5.6 Mutagenesi sito specifica

Le mutagenesi sito specifiche sono state ottenute utilizzando il kit QuickChange II

Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) ed i primer opportunamente disegnati

(Tabella 3.4.2). Il kit prevedeva l’utilizzo della polimerasi ad alta fedeltà

PfuUltra™ per la sintesi del DNA con la mutazione desiderata. I primer, utilizzati

alla concentrazione finale di 0,25 µM, erano complementari ai filamenti opposti

del vettore, contenevano entrambi la mutazione desiderata e avevano un contenuto

in GC superiore al 40% e una temperatura di annealing superiore a 78°C. Ogni

72

____________________________________________________________Materiali e motodi

ciclo (95°C per 30 secondi, 55°C per 1 minuto e 68°C per 1minuto/Kb di

lunghezza del plasmide) era ripetuto per 16 cicli di amplificazione (se si

desiderava, come nel nostro caso, la mutazione di un singolo residuo

aminoacidico). A questi cicli era aggiunto un ultimo ciclo a 94°C per 1 minuto,

55°C per 1 minuto e 72°C per 10 minuti. Al termine della reazione i campioni

venivano mantenuti 2 minuti in ghiaccio ed in seguito sottoposti a restrizione con

l’enzima DpnI, che digerisce il DNA parentale metilato e il filamento

emimetilato. Il prodotto di mutagenesi era poi utilizzato per la trasformazione di

batteri competenti E.coli DH5α. Le mutagenesi erano controllate per digestione

enzimatica e sequenziamento.

3.5.7 Sequenziamento dei plasmidi e purificazione delle sequenze

Oltre all’analisi mediante restrizione enzimatica, i clonaggi e le mutagenesi sono

stati controllati tramite sequenziamento impiegando il kit “Big Dye Terminator

Cycle Sequencing Ready Reaction” (Applied Biosystem), basato sul metodo di

Sanger modificato (Sanger et al., 1997). Il principio del sequenziamento di

Sanger, o metodo a terminazione di catena, prevede che la PCR venga effettuata

oltre che in presenza di dNTPs anche con ddNTPs coniugati con un fluoroforo

(dideossinucleotidi delle quattro basi azotate, privi del gruppo ossidrilico in

posizione C3). La DNA polimerasi permette la sintesi del filamento

complementare a quello stampo utilizzando i vari nucleotidi (dNTPs e ddNTPs).

Quando viene incorporato casualmente il ddNTP la catena è terminata, perché il

ddNTP non possiede il gruppo ossidrilico al 3’ necessario per la continuazione

della catena. In tal modo si ottengono frammenti di lunghezza diversa che si

differenziano tra di loro anche per una singola base. I frammenti di DNA vengono

separati per elettroforesi su gel capillare ed analizzati da un rivelatore, che

converte la diversa fluorescenza emessa dai cromofori eccitati (corrispondente ai

diversi ddNTPs terminatori) in un picco di colore diverso. Il risultato di un

sequenziamento automatico corrisponde ad un profilo densitometrico di picchi

fluorescenti. Il rilevatore permette di captare le emissioni fluorescenti, che

vengono integrate e rappresentate come picchi di altezza diversa, dove l’area

sottesa a ciascun picco è proporzionale all’intensità d’emissione. La sequenza può

essere così letta nell’elettroforetogramma. La reazione era allestita in un volume

finale di 10 µl, comprendenti il reagente Big Dye, il buffer (Tris-HCl 200 mM pH

73

_______________________________________________________________________________

9.0, MgCl2 5 mM), l’opportuno primer 0,1 µM e 200-500 ng di templato. Per i

vettori pcDNA3.1 e pcDNA3.1/V5-His/TOPO sono stati utilizzati i primer

universali T7 (in senso) e BGH (non senso), mentre per gli altri plasmidi i primer

per il sequenziamento sono stati disegnati opportunamente (Tabella 3.4.4). La

PCR di sequenza veniva condotta in un termociclatore (Mastercycler personal,

Eppendorf) e prevedeva 30 cicli di amplificazione. Dopo uno step iniziale a 95°C

per 5 minuti ogni ciclo era composto da: 95°C per 30 secondi, 50°C per 10

secondi, 60°C per 4 minuti. Prima di essere caricato nel sequenziatore automatico

(ABI PRISMA 3100, Applied Biosystem) il DNA della mix di reazione veniva

precipitato, purificato dai sali e denaturato. La PCR era, pertanto, risospesa in

sodio acetato 3M pH 5.2 ed etanolo al 96%. Il DNA veniva sedimentato

centrifugando a 13200 rpm per 20 minuti a 4°C, lavato in etanolo al 70%,

risospeso in formammide e, infine, denaturato a 95°C per 5 minuti.

3.5.8 BAC mutagenesi

La mutagenesi basata sul Cromosoma Artificiale Batterico (BAC)-plasmide mini

F, nel quale può essere clonata una porzione di DNA superiore alle 300 Kb, ha

reso possibile la rapida ed efficiente mutagenesi di larghe sequenze in cellule di

E.coli. La Red ricombination è una delle più comuni ed efficienti tecniche di

mutagenesi di lunghe sequenze di DNA, che utilizza marker di selezione

amplificati per PCR. In particolare, il protocollo che abbiamo utilizzato

costuituisce una strategia modificata (Markeless two step Red-mediated

recombination, Tishet et al., 2006), che utilizza il gene per la resistenza alla Kan

fiancheggiato ad un sito di cleavage per l’endonucleasi endogena di E.coli I-SceI

per introdurre la mutazione desiderata nella sequenza target e per una prima

selezione positiva. Nel successivo step il taglio da parte di I-SceI a livello del suo

sito di riconoscimento rimuove la cassetta di selezione e permette la seconda

ricombinazione, che utilizza come substrato le sequenze del gene target introdotte

in duplicato (Figura 3.5.8.1). La ricombinazione è stata effettuata nel ceppo E.coli

GS1783 che contiene un clone del BAC infettivo del ceppo endotelio-tropico

TB40-BAC4. Questo ceppo di E.coli contiene un promotore inducibile che

esprime dopo lo shock termico le proteine Red recombination, necessarie per

entrambi gli step di ricombinazione, ed un promotore arabinosio(Ara)-inducibile

74

____________________________________________________________Materiali e motodi

per l’espressione di I-SceI, enzima necessario per il taglio proteolitico prima della

seconda ricombinazione.

I primer utilizzati per le due mutagenesi e per la delezione del gene UL55 sono

riportati in tabella 3.4.3. I primer sono stati opportunamente costruiti in modo da

contenere a partire dall’estremità 5’ una sequenza omologa al gene UL55 40 nt a

monte del sito di mutazione o delezione e 20 nt a valle. In seguito è stata posta la

sequenza di 25 o 22 nt omologa al plasmide pEPkan-S, contenente il gene della

resistenza alla Kan fiancheggiato dal sito di taglio per I-SceI.

Con questi primer sono state effettuate le reazioni di PCR a partire dal templato

pEPkan-S, in modo da ottenere amplificati contenenti la sequenza di interesse con

la mutazione desiderata, il gene per la resistenza alla Kan, il sito di taglio per I-

SceI e una piccola duplicazione della sequenza di interesse. I batteri E.coli

GS1783 erano lasciati crescere a 32°C fino ad una OD600 di circa 0,5-0,7 e poi resi

elettrocompetenti mediante shock termico in agitazione a 42°C per 20 minuti.

Dopo lo shock la coltura era trasferita in ghiaccio per 20 minuti. In seguito i

batteri venivano sedimentati a 6000 rpm per 10 minuti a 4°C e poi lavati varie

volte con una soluzione fredda di glicerolo 10%. Dopo l’ultimo lavaggio a 6000

rpm per 5 minuti a 4°C i batteri erano risospesi in un piccolo volume di glicerolo

10% e le aliquote erano conservate a -80°C. 100 ng dei prodotti di PCR venivano

elettroporati in 50 µl dei batteri elettro-competenti a 1,25 kV, 25 µF, 200 Ohm,

poi incubati con 900 µl di SOC-Medium pre-riscaldato per un’ora a 32°C e infine

seminati in piastre di LB-agar contenenti CAF e Kan. Dopo 24 ore a 32°C le

colonie erano risospese in terreno liquido e poi il DNA era estratto dai batteri

mediante Mini prep (paragrafo 3.5.1). Il controllo dell’avvenuta integrazione del

prodotto di PCR nel BAC dei batteri, in seguito alla prima Red ricombination, è

stato eseguito mediante PCR con gli opportuni primer (Tabella 3.4.3). I cloni

corretti sono stati sottoposti al secondo step. Venivano, pertanto, fatti crescere in

terreno LB contenente CAF a cui dopo 1-2 ore a 32°C era aggiunto Ara 2% per

indurre l’espressione di I-SceI. Dopo un’ora a 32°C la coltura era sottoposta a

shock termico in agitazione a 42°C per 30 minuti e poi era nuovamente incubata a

42°C per 2-3 ore prima di essere seminata in piastre di LB-agar in presenza di

CAF e Ara 1%. In seguito le colonie cresciute venivano piccate in doppio in

piastre contenenti CAF o CAF/Kan. Solo i cloni CAF resistenti e Kan sensibili,

che cioè hanno rimosso la cassetta della selezione positiva, sono stati controllati

75

_______________________________________________________________________________

mediante PCR con gli stessi primer utilizzati per controllare la prima

ricombinazione. Le PCR dei corrispondenti cloni corretti sono state sottoposte a

sequenziamento per controllare l’inserimento delle mutazioni desiderate, mentre il

DNA bacmidico è stato sottoposto a restrizione enzimatica e gel elettroforesi per

essere confrontato con il BAC parentale. Poi il DNA è stato utilizzato per la

ricostituzione dei virus mediante elettroporazione di cellule MRC5 (paragrafo

3.6.1).

Figura 3.5.8.1 BAC mutagenesi mediante Markeless two step Red-mediated recombination. La

cassetta I-SceI-aphAI è stata amplificata per PCR per aggiungere circa 40 pb di sequenza target

(rosso e azzurro o giallo e verde), in cui è stata inserita la mutazione desiderata (X). Le linee

colorate simboleggiano sequenze identiche, mentre le linee tratteggiate indicano singoli eventi di

ricombinazione omologa. psm, positive selelction marker; X, nuova sequenza; triangolo, sequenza

originaria, S, sito di restrizione per I-SceI (Tishet et al., 2006).

3.6 Tecniche di biologia cellulare

3.6.1 Tecniche di trasfezione

In questo lavoro di tesi sono state utilizzate tre tecniche di trasfezione:

due tecniche si basavano sull’utilizzo di liposomi: il reagente Jet PEJ™

(Celbio) era usato per la valutazione dell’espressione proteica dei costrutti

clonati e per le immunoprecipitazioni (IP) e Lipofectamine™ 2000

(Invitrogen) per gli studi di co-immunoprecipitazione (co-IP). Entrambi

sono stati utilizzati per la trasfezione transiente di cellule 293T e Cos7;

76

____________________________________________________________Materiali e motodi

il terzo metodo, invece, consisteva nell’elettroporazione ed è stato

utilizzato per le cellule MRC5.

Per quanto riguarda il primo metodo che utilizzava il reagente Jet PEJ™ (Celbio),

il giorno precedente alla trasfezione venivano seminate 6x105 cellule in pozzetti di

10 cm2 (six-well plate, Falcon) in DMEM al 10% di FBS in un volume finale di 2

ml. Dopo 24 ore, raggiunta una confluenza dell'80%, le cellule erano trasfettate

con Jet PEJ™, un reagente a base di polimeri sintetici altamente idrosolubile e

derivato da polietilenimina lineare, che, inglobando il DNA in particelle cariche

positivamente capaci di interagire con proteoglicani anionici alla superficie

cellulare, ne media l’ingresso nella cellula tramite endocitosi. Venivano preparate

due diverse miscele di reazione, la prima contenente 4 µg di DNA in 100 µl di

soluzione NaCl 150 mM; la seconda contenente 6 µl di reagente Jet PEJ disciolto

in 100 µl di NaCl 150 mM. La soluzione di Jet PEJ era aggiunta a quella

contenente il DNA e la miscela unica era incubata a temperatura ambiente per 30

minuti e poi aggiunta alle cellule goccia a goccia. Le cellule trasfettate venivano

incubate a 37°C al 5% CO2 per 48 ore e, successivamente, lisate e utilizzate per

l’analisi dell’espressione proteica in SDS-PAGE.

Per gli esperimenti di co-IP, il giorno precedente alla trasfezione 1,5x106 cellule

293T erano seminate in fiasche aventi superficie di 25 cm2 (T25) in DMEM,

addizionato con il 10% (v/v) di FBS in un volume finale di 5 ml. Dopo 24 ore a

confluenza cellulare del 80% si effettuava il protocollo di trasfezione. Le cellule

erano trasfettate con Lipofectamine™ 2000, complessi liposomici di lipidi

cationici. Al momento della trasfezione venivano preparate due miscele, di cui

una contenente 500 µl di DMEM privo di FBS e 20 µl di reagente

Lipofectamine™, l’altra contenente 500 µl di DMEM privo di FBS ed il DNA

(per una quantità totale di 8 µg). Le due miscele erano poi unite e la miscela unica

era incubata a temperatura ambiente per 20 minuti e poi aggiunta goccia a goccia

al monostrato cellulare. Le cellule venivano incubate a 37°C in CO2 per un

intervallo di tempo adatto al saggio di espressione genica da effettuare.

Per analizzare il pathway di degradazione proteico è stato utilizzato l’inibitore dei

lisosomi bafilomicina A1 alla concentrazione finale di 10 nM (Sigma). Cellule

293T erano trasfettate in doppio con Jet PEJ™ o Lipofectamine™ 2000. 6 ore

dopo la trasfezione nel primo gruppo di cellule veniva aggiunto al terreno DMSO,

77

_______________________________________________________________________________

mentre nel secondo era aggiunto l’inibitore. Le cellule venivano incubate a 37°C

in CO2 per 24 ore prima di effettuare la lisi.

Le cellule MRC5, invece, sono state trasfettate per elettroporazione. Una fiasca da

75 cm2 alla confluenza del 90% era usata per due trasfezioni. Le cellule venivano

lavate due volte con PBS-EDTA, tripsinizzate e risospese in 10 ml di DMEM

10% FCS. Dopo l’aggiunta di 20 ml di PBS erano centrifugate 5 minuti a 1200

rpm a temperatura ambiente, e poi risospese in un adeguato volume di Optimem

senza siero. Per ogni elettroporazione 250 µl della sospensione erano aggiunti al

DNA da trasfettare, diluto in un volume finale di 40 µl di Optimem addizionato

con il 5% (v/v) di FCS, e trasferiti in una cuvetta. Per le trasfezioni con il vettore

inducibile erano usati 5 µg di DNA, mentre per la ricostituzione del virus dal

BAC erano usati 2-3 µg del DNA bacmidico e 1 µg di pCMV71.

L’elettroporazione era effettuata a 260 V, 1050 µF, 335 R in cuvette da 4 mm

(Biotechnologie GmbH). Poi le cellule venivano risospese in terreno completo

pre-riscaldato. La trasfezione con il vettore psVT28 richiedeva che l’espressione

della proteina clonata nel vettore fosse indotta in presenza di doxiciclina 1 µg/ml.

3.6.2 Trasduzione delle cellule HFF

Cellule 293T (3,5x106 per condizione in fiasche di superficie di 75 cm2) erano

seminate in DMEM 10% FCS in un volume finale di 10 ml. Dopo 24 ore veniva

effettuato il normale protocollo di trasfezione usando Lipofectamine™ 2000.

Nella prima miscela contenente 1,5 ml di DMEM privo di siero erano aggiunti 40

µl di Lipofectamine™, nella seconda contenente lo stesso volume di DMEM era

aggiunto il DNA: il vettore oncoretrovirale pMSCV che esprime la proteina di

interesse, il costrutto MLV Gag-Pol, che fornisce il packaging, e il plasmide che

codifica VSV-G, che fornisce l’envelope al provirus pseudotipizzato. I tre costrutti

erano aggiunti in proporzione 5:5:1 per una quantità totale di 24 µg. Si univano

poi le due miscele e la miscela unica era incubata a temperatura ambiente per 20

minuti e poi aggiunta goccia a goccia al monostrato cellulare. Dopo 48 ore dalla

trasfezione i surnatanti delle cellule trasfettate contenenti le particelle virali

ricombinanti venivano raccolti, centrifugati a 5000 rpm 10 minuti e filtrati con un

filtro da 0,45 mm per rimuovere eventuali cellule presenti nel surnatante. Le

particelle virali erano, quindi, concentrate centrifugando il surnatante a 23000 rpm

per un’ora a 4°C in un rotore Beckman SW40.1 e risospendendo il pellet in 500 µl

78

____________________________________________________________Materiali e motodi

di MEM. Le cellule HFF venivano seminate, il giorno dopo infettate con HMCV e

24 ore dopo trasdotte con il virus raccolto. L’efficienza di trasduzione è stata

controllata mediante analisi citofluorimetrica di cellule HFF trasdotte con il virus

di controllo che esprime la GFP (pMSCV-LTR-GFP).

3.6.3 Infezione delle colture cellulari con HCMV

MCR5 o HFF ad una confluenza del 80-100% venivano incubate 2 ore a 37°C con

HCMV ceppo TB40 utilizzando una m.o.i. da 0,5 a 3 PFU/ml. Durante

l’incubazione era utilizzato il terreno specifico per il tipo cellulare scelto

(rispettivamente DMEM o MEM) privo di siero. Trascorse le 2 ore il terreno era

rimosso e sostituito con terreno completo e le cellule venivano incubate a 37°C

fino ai tempi richiesti dall’esperimento.

3.6.4 Lisi cellulare

Le cellule trasfettate o infettate venivano lisate per effetto osmotico in tamponi

opportuni a seconda del tipo di esperimento. Per valutare l’espressione proteica o

per le IP la lisi era effettuata nel Buffer di lisi RIPA1X (NaCl 150 mM, IGEPAL

CA-63 1%), mentre negli esperimenti di co-IP era usato il tampone più blando

Np40 1X (2,5% IGEPAL CA-63, Tris-HCl pH 7.4 100 mM, NaCl 750 mM),

capace di preservare le eventuali interazioni proteiche. I tamponi di lisi erano

addizionati di una miscela di inibitori delle proteasi 1X (N-p-tosyl-L-lysine

chloromethyl ketone 0,1 mM –tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone 0,1

mM, Roche). Le cellule venivano staccate dalla fiasca, risospese in PBS 1X e

centrifugate a 1100 rpm a 4°C per 5 minuti. Al termine si eliminava il surnatante e

si effettuavano due lavaggi in PBS 1X freddo. Successivamente erano risospese in

un adeguato volume del buffer di lisi addizionato di inibitori delle proteasi ed

erano incubate in ghiaccio per 20 minuti. In seguito venivano centrifugate a 13000

rpm per 20 minuti a 4°C per separare i surnatanti (citoplasma) da nuclei,

membrana plasmatica e compartimenti membranosi della cellula. Terminata la

centrifugazione il surnatante era raccolto e i lisati erano diluiti 1:2 nel tampone di

caricamento Loading Buffer (LB) 2X (Tris-HCl 100 mM pH 6,8, SDS 4%,

glicerolo 20%, blu di bromofenolo 0,2%, DTT 200 mM, β mercaptoetanolo 20%)

ed in seguito bolliti per 10 minuti prima di essere analizzati in SDS-PAGE. Se si

79

_______________________________________________________________________________

desiderava analizzare anche i compartimenti membranosi, il pellet era lisato con

50 µl di LB 2X e risospeso con cicli di vortex e bollitura.

Per IP e co-IP, invece, i lisati erano posti a contatto con le biglie legate

all’anticorpo (Ab) di interesse (vedi paragrafo 3.6.5). Tutti i campioni venivano

analizzati in SDS-PAGE e Immunoblot (paragrafi 3.6.6 e 3.6.7).

3.6.5 Immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione

Per IP e co-IP biglie G-sepharose (GE Healthcare) venivano sottoposte a 3

lavaggi nel tampone di lisi a 1200 rpm, per 2 minuti a 4°C e successivamente

incubate con l’Ab opportuno per 3 ore a temperatura ambiente in agitazione.

Dopo 4 ulteriori lavaggi nel tampone di lisi a 1200 rpm per 2 minuti a 4°C le

biglie erano incubate con i lisati cellulari a 4°C per 2 ore in agitazione. In seguito

a vari lavaggi a 1200 rpm per 2 minuti a 4°C i campioni venivano risospesi in LB

2X e bolliti per 10 minuti prima di essere analizzati in SDS-PAGE.

3.6.6 SDS-gel elettroforesi

Lisati, IP e co-IP erano analizzati in SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate poly

acrylamide gel electrophoresis) (gel ProteaII, Bio-rad). In questo lavoro sono stati

preparati minigel di acrilammide dello spessore di 1,5 mm o gel ProteaII (Bio-rad)

dello spessore di 1 mm come da ricetta:

• Gel di impaccamento al 4,5% (p/v), costituito da 4 ml di Tris-HCl 0,5 M, pH

6.8, 2,4 ml della soluzione acrilammide/bis 37,5:1 al 30% (p/v), 160 µl di SDS

10% (p/v), 20 µl di N, N, N’, N’-tetra-metil-etilenediammina (TEMED), 80 µl

di ammonio persolfato (APS) 10% (p/v) e portato al volume finale di 16,06 ml

con acqua deionizzata;

• Gel di corsa all’8,5 o al 10% (p/v), costituito da 12,5 ml di Tris-HCl 1.5 M,

pH 8.8, 14,2 ml (o 16,6 ml per gel al 10%) della soluzione acrilammide/bis-

acrilammide 37,5:1 al 30% (p/v), 500 µl di SDS 10% (p/v), 40 µl di TEMED e

200 µl di APS 10% (p/v) e portato al volume finale di 50 ml con acqua

deionizzata.

La migrazione elettroforetica era effettuata con un’intensità di corrente costante

(100 V per 2 ore o 70 V per tutta la notte) in presenza di un tampone di corsa

(3,02 g di Tris, 14,4 g di glicina, 10 ml di SDS 10% (p/v) e acqua distillata per

80

____________________________________________________________Materiali e motodi

raggiungere il volume di 1 litro, Bio-Rad). Per verificare la dimensione delle

bande era utilizzato il marker Page Ruler™ Prestained Protein ladder (Fermentas)

costituito da una miscela di proteine di peso molecolare noto e compreso tra 10 e

170 KDa.

3.6.7 Immunoblotting

Le proteine separate in gel elettroforesi venivano trasferite elettricamente su di

una membrana di nitrocellulosa (PROTRAN®, PerkinElmer), precedentemente

idratata in acqua deionizzata ed equilibrata in tampone di trasferimento (tampone

di corsa addizionato con metanolo al 20%). Il trasferimento era effettuato a 50V

per 2 ore. Successivamente, per saturare i siti aspecifici, la membrana di

nitrocellulosa era incubata in una soluzione costituita da latte scremato 5% (p/v)

(Biorad), Tween-20 0,1% (v/v) (Sigma) e PBS1X. Le membrane usate per

l’immunoblotting per l’ubiquitina erano autoclavate a 120°C in acqua deionizzata

per 20 minuti per esporre i siti antigenici riconosciuti dal PAb anti-Ubi (Strack et

al., 2000). In seguito la membrana veniva incubata con l’Ab primario specifico

per le proteine oggetto di analisi opportunamente diluito nella soluzione di

saturazione per una notte a 4°C o per 2 ore a temperatura ambiente in agitazione.

Dopo il trattamento con l’Ab primario la membrana era sottoposta a tre lavaggi

con PBS-T [PBS 1X, Tween-20 0,1%(v/v)] e poi incubata per un’ora con l’Ab

secondario anti-IgG di coniglio o anti-IgG di topo HRP, coniugato con l’enzima

perossidasi di rafano (GE Healthcare), diluito 1:5000 in latte scremato 5% (p/v) e

PBS-T. Di seguito sono riportate due tabelle (Tabelle 3.6.8.1 e 3.6.8.2) che

riassumono gli Ab primari e secondari impiegati in questo lavoro e le modalità di

utilizzo. Il caricamento era controllato con un PAb anti-tubulina.

Infine la membrana era immersa in una soluzione di sviluppo utilizzando il kit per

la rilevazione della chemioluminescenza “ECL plus Western Blotting Detection

System” (Amersham Biosciences) e successivamente esposta su lastra fotografica

(Kodak Biomax Mr Film). Il principio della rivelazione con ECL (enhanced

chemiluminescence) sfrutta la reazione di chemiluminescenza prodotta

dall’ossidazione del luminolo da parte della perossidasi in condizioni alcaline,

resa più accentuata dalla presenza di catalizzatori chimici come il fenolo. In

seguito all’ossidazione il luminolo si trova in uno stato eccitato, da cui torna allo

81

_______________________________________________________________________________

stato fondamentale tramite emissione di energia sotto forma di

chemiluminescenza, che raggiunge un picco dopo 5-20 minuti.

Il gel di poliacrilamide era colorato con Coomassie Blue (0,05 g di Comassie Blue

(Sigma), 40 ml di Metanolo, 10 ml di Acido Acetico e acqua distillata per

raggiungere il volume di 100 ml) e decolorato con una soluzione di metanolo 40%

e acido acetico glaciale 10%.

3.6.8 Saggi di immunofluorescenza indiretta

Il giorno precedente la trasfezione o l’infezione le cellule venivano seminate su

una piastra da 24 pozzetti (Costar) sul cui fondo erano deposti vetrini portaoggetto

sterili o su piastre da 8 pozzetti Ibidi. Trascorse 24 ore, quando le cellule

risultavano ad una confluenza del 60-80%, si procedeva alla trasfezione

(paragrafo 3.6.1) o all’infezione (paragrafo 3.6.3). Dopo l’opportuno intervallo di

tempo a seconda del tipo di esperimento si procedeva con il saggio di

immunofluorescenza (IF). Le cellule erano lavate in PBS 0,01 mM e in seguito

fissate in paraformaldeide (PFA) al 4% (p/v) (PBS 0,01 M, NaOH a pH 7,2) per

10 minuti a 4°C e e dopo 3 lavaggi in PBS 0,01 mM permeabilizzate con una

soluzione di Triton X-100 0,1% (v/v) in PBS 0,01 mM per 10 minuti a

temperatura ambiente. In seguito venivano seguiti due protocolli diversi per

cellule trasfettate e infettate. Nel caso delle cellule trasfettate dopo 3 lavaggi in

PBS 0,01 mM i vetrini erano incubati in una soluzione di saturazione contenente

FCS 5% in PBS 0,01 mM per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente

le cellule venivano incubate con il primo Ab primario diluito nella stessa

soluzione di bloccaggio per 45 minuti a temperatura ambiente. Dopo 3 lavaggi in

PBS 0,01 mM i vetrini erano incubati con il secondo Ab primario diluito nella

soluzione di saturazione per 45 minuti a temperatura ambiente. Nel caso delle

cellule infettate, invece, veniva utilizzata una soluzione di bloccaggio più forte

contenente siero umano 6% e BSA 1% in PBS. I campioni erano incubati nella

soluzione per 30 minuti ed in seguito con gli Ab primari diluiti nella stessa

soluzione per 45 minuti a temperatura ambiente. I lavaggi degli Ab primari erano

effettuati in una soluzione di lavaggio contenente BSA 1% e Triton X-100 0,1%

in PBS/BSA 1%. In seguito per entrambi i protocolli si procedeva allo stesso

modo incubando le cellule al buio con l’Ab secondario diluito in PBS 0,01 mM

per 45 minuti a temperatura ambiente. Infine dopo altri 3 lavaggi i campioni

82

____________________________________________________________Materiali e motodi

venivano incubati con una soluzione di DAPI (Diamidinophenylindol; 1 µg/ml)

diluito in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo altri 3 lavaggi in PBS

0,01 mM i vetrini erano coperti con una goccia di soluzione di montaggio (Pro

Long® Gold antifade reagent, Invitrogen) ed analizzati al microscopio a confocale

Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo 63X ad immersione ed apotoma. Le

immagini erano analizzate con il Software Axiovision 4.6.

Di seguito sono riportate due tabelle (Tabelle 3.6.7.1 e 3.6.7.2) che riassumono gli

Ab primari e secondari impiegati in WB e in IF in questo lavoro e le modalità di

utilizzo.

Nome Ditta Utilizzo Diluizione Anti-tubulina Sigma Mouse WB 1:5000 Anti-γ adaptina Sigma Mouse IF 1:1000 Anti-EEA1 BD Bioscence Mouse IF 1:100

Anti-CD63 H-193 Santa Cruz Biotechnology Rabbit IF 1:50

Anti-c-Myc 9E10 Covance Mouse WB 1:500

Anti-Flag M2 Sigma Mouse IF WB

1:500 1:2500

Anti-Flag Sigma Rabbit IF 1:200

Anti-HA.11 Covance Mouse IF WB

1:500 1:2000

Anti-HA Sigma Rabbit IF 1:200 Anti-Ubi Sigma Rabbit WB 1:100

Anti-HCMV gB 2F12 Virusys Mouse WB IF

1:500 1:50

Anti-HSV-1 Dako Rabbit WB 1:1000

Anti-UL71 Dott. von Einem lab Rabbit IF 1:250

Tabella 3.6.7.1 Anticorpi primari utilizzati in WB e IF e loro principali caratteristiche.

Nome Ditta Utilizzo Diluizione Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen Goat IF 1:1000

Alexa Fluor® 488 F(ab’)2 Fragment of goat anti-rabbit IgG Invitrogen Goat IF 1:1000

Alexa Fluor® 555 F(ab’)2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L)

Invitrogen Goat IF 1:1000

Alexa Fluor® 555 F(ab’)2 fragment of goat anti-rabbit IgG Invitrogen Goat IF 1:1000

Anti-Mouse HRP-Coniugated GE Healthcare Goat WB 1:5000

Anti-Rabbit HRP-Coniugated GE Healthcare Goat WB 1:5000

Tabella 3.6.7.2 Anticorpi secondari utilizzati in WB e IF e loro principali caratteristiche.

83

______________________________________________________________________Risultati

4 RISULTATI

PREMESSA

Il pathway cellulare dei MVB svolge un ruolo fondamentale nella gemmazione di

numerose famiglie di virus dotati di envelope, non solo ad RNA ma anche a DNA

e tra questi in particolare HSV-1, HHV-6 e HCMV. Nel tentativo di studiare i

meccanismi molecolari e le proteine virali coinvolte nell’utilizzo da parte di questi

virus di questo pathway cellulare abbiamo focalizzato la nostra attenzione sul

ruolo della glicoproteina B (gB). Questa scelta nasce dai risultati ottenuti nel

nostro laboratorio che dimostrano il ruolo della gB di HSV-1 per permettere al

virus di sfruttare il pathway dei MVB durante il proprio ciclo replicativo. La gB di

HSV-1, infatti, localizza a livello dei MVB ed il blocco di questo pathway

comporta un'alterazione della sua maturazione e localizzazione intracellulare. La

capacità di gB di accumularsi a livello delle membrane dei MVB è correlata

all'ubiquitinazione della sua regione C-terminale, mediante interazioni tra residui

di lisina (K63) nell’ubiquitina e residui presenti nella coda citoplasmatica di gB.

Inoltre, la parziale delezione della sua coda citoplasmatica (gB867) comporta una

riduzione dell’ubiquitinazione e del rilascio di progenie virale infettiva (Calistri et

al., 2007). A partire da questi dati e dal momento che questa glicoproteina è una

delle più conservate all’interno della famiglia Herpesviridae, questo progetto è

partito con l’intenzione di analizzare gli omologhi della gB di HSV-1 in PRV

(UL27), HCMV (UL55) e HHV-8 (ORF8), tre virus prototipo rispettivamente di

un α, β e γ herpesvirus, per capire se questi omologhi condividono una funzione

simile per l’ingresso nel pathway dei MVB. Dopo i primi risultati il progetto si è

focalizzato sulla gB di HCMV.

4.1 Ottenimento dei costrutti esprimenti l’omologo della gB di HSV-1 in HCMV (UL55) in forma wt e in una forma parzialmente tronca a livello della coda citoplasmatica

La sequenza genica codificante l’omologo della gB di HSV-1 in HCMV è stata

clonata in un vettore d'espressione priva di tag o fusa al C-terminale con gli

epitopi Flag o HA (pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55). Inoltre per mezzo

dell’inserimento di un codone di stop prematuro è stata ottenuta anche la rispettiva

forma tronca fusa in 3’ a Flag o HA contenente una parziale delezione a livello

85

_______________________________________________________________________________

della coda citoplasmatica, omologa alla forma tronca della gB di HSV-1 (gB867),

per verificarne gli effetti in termini di ubiquitinazione e rilascio di progenie virale

infettiva a livello extracellulare (pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55833). I cloni

corretti sono stati trasfettati in cellule 293T, 48 ore dopo le cellule sono state lisate

in opportuno tampone di lisi e l’espressione delle proteine di interesse è stata

rivelata mediante western blotting (WB), utilizzando opportuni anticorpi (Ab).

Abbiamo, pertanto, confermato che, come riportato in letteratura (Wells et al.,

1990) e diversamente da quanto accade nel caso della gB di HSV-1, la gB di

HCMV è prodotta come precursore, che viene processato proteoliticamente ad

opera dell’enzima furina, che agisce a livello di specifici motivi RX(R/L)R,

generando eterodimeri che rimangono legati attraverso ponti disolfuro. Clonaggi e

risultati analoghi sono stati ottenuti anche per le gB di PRV e HHV8 sia in forma

full lenght (pcDNA3.1-UL27 e pcDNA3.1/V5-His/TOPO-ORF8) sia in forma

tronca (pcDNA3.1-UL27882 e pcDNA3.1/V5-His/TOPO-ORF8787). Come già

accennato, tuttavia, abbiamo concentrato la nostra attenzione su UL55 di HCMV.

4.2 UL55 è ubiquitinata in cellule trasfettate ed infettate

Dal momento che uno dei segnali di sorting più importanti per l’entrata delle

proteine nel pathway dei MVB è la loro ubiquitinazione, abbiamo analizzato

l’ubiquitinazione della gB di HCMV. Il saggio è effettuato mediante WB in

seguito ad immunoprecipitazione (IP) specifica.

In particolare, il costrutto esprimente la glicoproteina wt fusa all’epitopo Flag è

stata trasfettata in cellule 293T in presenza (+) o assenza (-) di un plasmide

esprimente l’ubiquitina fusa in 3’ all’epitopo HA (pBJ5-HA Ubi). 48 ore dopo, le

cellule sono state lisate in opportuno buffer di lisi e la gB è stata

immunoprecipitata dai lisati. I risultati ottenuti dimostrano che la gB di HCMV è

altamente ubiquitinata. Inoltre, analizzando il pattern di ubiquitinazione, è

possibile ipotizzare che, diversamente da quanto accade per la gB di HSV-1 che è

mono-ubiquitinata (Calistri et al., 2007), la gB di HCMV sia poli-ubiquitinata

(Figura 4.2.1 B). Essendo noto che nella gB di HSV-1 i residui coinvolti

nell’ubiquitinazione sono localizzati a livello della coda C-terminale, abbiamo

analizzato, in maniera analoga a quanto già descritto per la forma full lenght, il

livello di ubiquitinazione della forma tronca UL55833. I nostri dati dimostrano che

86

______________________________________________________________________Risultati

la parziale delezione a livello della coda citoplasmatica abroga parzialmente ma

non completamente il fenomeno (Figura 4.2.1 B). Tuttavia, l’analisi del livello

intracellulare di gB, effettuato in parallelo alla valutazione dei livelli di

ubiquitinazione, sembra indicare che questa riduzione sia legata alla quantità

significativamente ridotta della forma matura della gB tronca rispetto alla relativa

full-lenght (Figura 4.2.1 A). Quest’ultimo fenomeno potrebbe essere imputato a

difetti di processamento proteolitico o a prematura degradazione della proteina

mutante. Lo stesso esperimento e gli stessi risultati sono stati ottenuti anche per i

due omologhi di gB in PRV e HHV8 (figura non mostrata).

Figura 4.2.1 UL55 è ubiquitinata in cellule trasfettate. (A e B) Elettroforesi e WB delle IP

effettuate dai lisati di cellule 293T trasfettate con i plasmidi pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55

3’Flag o la rispettiva forma parzialmente deleta al C-terminale (pcDNA3.1/V5-HisTOPO-UL55833

3’Flag), insieme ad un costrutto esprimente l’ubiquitina fusa all’epitopo HA (pBJ5-HA Ubi), o al

corrispondente vettore vuoto pBJ5, (HA Ubi + o HA Ubi –). 48 h dopo la trasfezione la

glicoproteina è IP con il MAb M2 anti-Flag. I WB sono sviluppati con il MAb anti-Flag o il PAb

anti-HA, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

Al fine di analizzare la specificità dell’ubiquitinazione di UL55, abbiamo

effettuato lo stesso esperimento impiegando in questo caso un costrutto

esprimente la glicoproteina H di HCMV (UL75). Poiché i corretti folding e

localizzazione di questa glicoproteina necessitano la co-espressione di gL

(UL115), abbiamo innanzitutto clonato entrambe le sequenze codificanti fuse in

frame al 3’ con due diversi epitopi (pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL75 3’Flag e

pcDNA3.1-UL115 3’HA). Abbiamo, quindi, cotrasfettato cellule 293T con

87

_______________________________________________________________________________

entrambi i costrutti in presenza (+) o meno (-) di pBJ5-HA Ubi. 48 ore dopo la

trasfezione i lisati cellulari sono stati immunoprecipitati con l’Ab specifico per

l’epitopo Flag e i campioni sono stati opportunamente analizzati in WB (Figura

4.2.2).

Il risultato mostra che UL75 di HCMV, così come la gH di HSV-1, non è

ubiquitinata in cellule trasfettate (Figura 4.2.2 B e C). Inoltre in questo

esperimento abbiamo confermato l’ubiquitinazione specifica di UL55 anche con

un Ab diretto contro l’ubiquitina (Figura 4.2.2 B).

Figura 4.2.2 UL75 di HCMV (gH) non è ubiquitinata in cellule trasfettate. (A e B)

Elettroforesi e WB delle IP effettuate dai lisati di cellule 293T cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-

His/TOPO-UL55 3’Flag, o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL75 3’Flag/pcDNA3.1-UL115 3’HA, che

esprimono rispettivamente le glicoproteine gH e gL di HCMV. 48 h dopo la trasfezione le

glicoproteine sono state immunoprecipitate con il MAb M2 anti-Flag. Le proteine separate sono

state analizzate in WB con il MAb anti-Flag o il PAb anti-Ubi. (C) Le cellule sono state trasfettate

con gli stessi costrutti insieme a pBJ5-5’HA Ubi o al corrispondente vettore vuoto pBJ5 (HA Ubi

+ o HA Ubi –). 48 h dopo la trasfezione UL55 o UL75/UL115 sono immunoprecipitate con il

MAb M2 anti-Flag. Le IP sono state separate in SDS-PAGE, seguita da WB con il PAb anti-Ubi.

Sulla sinistra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

Al fine di valutare la rilevanza dell’ubiquitinazione di gB nel contesto della

replicazione virale, cellule HFF sono state infettate a m.o.i. 2 con il virus wt. 120

ore dopo l’infezione gB è stata immunoprecipitata utilizzando un Ab specifico. I

campioni sono stati analizzati in WB, impiegando il PAb anti-Ubi (Figura 4.2.3

88

______________________________________________________________________Risultati

B). Con questo esperimento abbiamo dimostrato che UL55 è ubiquitinata anche in

cellule infettate (Figura 4.2.3 B).

Figura 4.2.3 UL55 è ubiquitinata in cellule infettate. (A e B) Elettroforesi e WB delle IP

effettuate dai lisati di cellule HFF infettate con HCMV a m.o.i. 2 (+) o non infettate (–). 120 h

dopo l’infezione la glicoproteina è stata immunoprecipitata dai lisati con il MAb anti-UL55. I WB

sono stati sviluppati con il MAb anti-HA o il PAb anti-Ubi, come indicato. Le frecce indicano le

bande di ubiquitinazione. Sulla sinistra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

4.3 UL55 colocalizza con le membrane dei MVB ed il suo trafficking intracellulare richiede la corretta biogenesi dei MVB

Poiché, come precedentemente accennato, l’ubiquitinazione rappresenta uno dei

segnali attraverso i quali le proteine sono indirizzate ai MVB, e vista la nostra

esperienza con HSV-1, abbiamo voluto analizzare, attraverso saggi di

immunofluorescenza (IF), se anche UL55 colocalizza con le membrane dei MVB.

A tale scopo, cellule Cos7 sono state trasfettate con il costrutto esprimente UL55

3’HA. 24 ore dopo le cellule sono state fissate con paraformaldeide (PFA) al 4%

(v/v) e permeabilizzate con Triton X-100 0,1%. Come controllo positivo alcuni

campioni sono stati marcati con il PAb (anticorpo policlonale) anti-HA e con il

MAb (anticorpo monoclonale) anti-γ adaptina, marker del TGN, dove è noto dalla

letteratura UL55 subisce le modificazioni post-traduzionali e il processamento

proteolitico (Figura 4.3.1 da A a F). Altri campioni, invece, sono stati incubati con

il MAb anti-HA e con il PAb anti-CD63, marker dei MVB (Figura 4.3.1 da G a

L). Questi ultimi pannelli mostrano che la glicoproteina virale colocalizza in parte

anche con le membrane dei MVB.

89

_______________________________________________________________________________

Figura 4.3.1 UL55 accumula in parte a livello delle membrane dei MVB in cellule trasfettate.

Cellule Cos7 sono state trasfettate con un costrutto esprimente pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55

3’HA. (Da A a F) Come controllo di colocalizzazione 24 h dopo le cellule sono state incubate con

il PAb anti-HA e con il MAb anti-γ adaptina. (Da G a L) I campioni sono stati marcati con il MAb

anti-HA e con il PAb anti-CD63. Successivamente tutti i vetrini sono stati incubati con gli

opportuni Ab secondari. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. Le cellule sono state

analizzate al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo 63X ad immersione

ed apotoma.

Al fine di valutare in maggior dettaglio il coinvolgimento dei MVB nella

maturazione e nel trafficking di UL55 e più in generale, negli esperimenti

successivi, nella maturazione virale, abbiamo valutato gli effetti del blocco del

pathway di biogenesi dei MVB a questo livello. A tale scopo, abbiamo utilizzato

la forma dominante negativa di Vps4, una proteina cellulare, avente un ruolo

essenziale nella biogenesi dei MVB. Questa ATP-asi agisce, infatti, nelle fasi

terminali che portano alla formazione delle vescicole intraluminali caratteristiche

90

______________________________________________________________________Risultati

dei MVB, disassemblando i complessi ESCRT nel sito di invaginazione della

membrana. La forma dominante negativa di Vps4 utilizzata in questo lavoro è

stata ottenuta con l’introduzione della mutazione puntiforme E228Q nella proteina

di fusione Flag Vps4; il risultato è la perdita dell’attività ATPasica necessaria per

il suo funzionamento (Strack et al., 2003). Il blocco dell’intero pathway ottenuto

utilizzando questa forma dominante negativa è unanimamente considerato il test

per eccellenza per valutare se e in che misura i MVB siano coinvolti in un

determinato fenomeno (Strack et al., 2003; Calistri et al., 2007; Crump et al.,

2007; Tandom et al., 2009). Le cellule 293T sono state trasfettate con il costrutto

esprimente UL55 3’Flag o la sua forma tronca UL55833, insieme al vettore vuoto o

ai plasmidi esprimenti 5’Flag Vps4 o 5’Flag Vps4E228Q. 48 ore dopo i lisati e i

pellet cellulari sono stati analizzati in SDS-PAGE e in WB con un MAb diretto

verso l’epitopo Flag (Figura 4.3.2 A e B). Il caricamento della stessa quantità

proteica è stato controllato mediante WB specifico per la proteina cellulare

tubulina (Figura 4.3.2 C).

I risultati mostrano che, in presenza di Vps4E228Q, sia UL55wt sia la sua forma

tronca si accumulano nella cellula, probabilmente a livello di compartimenti

membranosi (Figura 4.3.1). Questo dato avvalora l’ipotesi di un coinvolgimento

dei MVB e la necessità della loro corretta biogenesi per il corretto trafficking di

UL55, similmente a quanto dimostrato per la gB di HSV-1 (Calistri et al., 2007).

Un risultato analogo è stato ottenuto anche con la gB di PRV (UL27).

91

_______________________________________________________________________________

Figura 4.3.2 UL55 e UL55833 si accumulano sia nel citoplasma sia in compartimenti

membranosi in cellule trasfettate con la forma dominante negativa di Vps4. (A e C) Analisi

elettroforetica e WB dei lisati di cellule 293T cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-

UL553’Flag, o pcDNA3.1/V5-HisTOPO-UL55833 3’Flag, insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-

5’Flag Vps4, o a pBJ5-5’Flag Vps4E228Q. Le proteine separate in SDS-PAGE sono state analizzate

in WB con il MAb anti-Flag o con il MAb anti-tubulina. (B) Analisi elettroforetica e WB dei pellet

di cellule 293T cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag, o pcDNA3.1/V5-

HisTOPO-UL55833 3’Flag, e il vettore vuoto pBJ5, o pBJ5-5’Flag Vps4, o pBJ5-5’Flag Vps4E228Q.

L’analisi di WB è stata effettuata con il MAb anti-Flag. Sulla sinistra sono riportati i pesi

molecolari di riferimento.

Successivamente si è valutato in IF se l’espressione di Vps4E228Q avesse effetto

sulla localizzazione intracellulare di gB. A tale scopo, cellule Cos7 sono state

cotrasfettate con il costrutto esprimente UL55wt 3’HA insieme a 5’Flag Vps4E228Q

o al corrispondente vettore vuoto. 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state

fissate e permeabilizzate. In seguito sono state incubate con il PAb anti-HA e con

il MAb contro il Flag (Figura 4.3.3) e analizzate al microscopio confocale.

Nelle cellule esprimenti Vps4E228Q, UL55 si ridistribuisce, accumulandosi a livello

di vescicole intracitoplasmatiche allargate (Figura 4.3.3 da C a H).

92

______________________________________________________________________Risultati

Figura 4.3.3 Localizzazione di gB in presenza del dominante negativo di Vps4 in cellule

trasfettate. Cellule Cos7 sono state cotrasfettate rispettivamente con il vettore vuoto (A e B), o

con il plasmide pBJ5-5’Flag Vps4E228Q (da C a H), insieme al vettore pcDNA3.1/V5-His/TOPO-

UL55 3’Flag. I campioni dopo fissazione con PFA4% (p/v) e permeabilizzazione con Triton X-

100 0,1% (v/v) sono stati incubati con il PAb anti-HA e con il MAb anti-Flag e successivamente

con gli oppurtuni Ab secondari. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I campioni sono

stati analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo 63X ad

immersione ed apotoma.

Per valutare la rilevanza biologica dei dati ottenuti è stato valutato l’effetto del

dominante negativo di Vps4 sulla localizzazione di gB anche nel contesto

dell’infezione virale. A tale scopo, cellule MRC5 sono state elettroporate con i

costrutti GFP-Vps4 o GFP Vps4E228Q, espressi nel vettore inducibile psVT28, che

ha mostrato una buona efficienza di trasfezione nei fibroblasti. L’impiego di

vettori inducibili è stato scelto per ottenere l’espressione della proteina dominante

negativa solo quando voluto durante l’infezione virale e per minimizzare gli effetti

tossici della stessa. A tale scopo, 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state

infettate a m.o.i. 1 con il virus wt e il giorno dopo (36 ore prima della fissazione)

le cellule sono state incubate con doxiciclina 1 µg/ml, in modo da permettere

l’espressione di Vps4 o Vps4E228Q. 4 giorni dopo l’infezione (4 d.p.i.) le cellule

sono state fissate, permeabilizzate e incubate con il MAb anti-HA (Figura 4.3.4).

93

_______________________________________________________________________________

I dati permettono innanzitutto di osservare che Vps4 è reclutata a livello dei siti di

assemblaggio virale (AC), mentre Vps4E228Q rimane nella periferia dell’AC

(pannelli D e G). E’ noto che durante l’infezione anche UL55 è reclutata all’AC,

ed in particolare a livello dell’anello dove si accumulano le particelle virali,

marcate dalle proteine virali pp28 e pp150 (Sanchez et al., 2000). Anche i nostri

risultati confermano queste osservazioni (pannelli A e B). Inoltre, è possibile

osservare che, in presenza di Vps4E228Q, ma non di Vps4, UL55 presenta un

difetto di accumulo all’AC e la sua localizzazione appare distribuita nel

citoplasma delle cellule infettate (da F a H).

Figura 4.3.4 Effetto del blocco dei MVB sulla localizzazione di gB in cellule infettate. Cellule

MRC5 sono state elettroporate con il vettore vuoto psVT28 (A e B), o con i costrutti psVT28-GFP

Vps4 (da C a E), o psVT28-GFP Vps4E228Q (da F aH). 24 h dopo la trasfezione le cellule sono

state infettate con HCMV a m.o.i. 1. 24 h dopo sono state incubate con doxiciclina 1 µg/ml e 36 h

dopo fissate e permeabilizzate. Lo staining è stato eseguito con il MAb anti-UL55 2F12 e

successivamente con l’opportuno Ab secondario. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I

campioni sono stati analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo

63X ad immersione ed apotoma.

94

______________________________________________________________________Risultati

4.4 Le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 sono coinvolte nell’ubiquitinazione e degradazione di UL55 ed interagiscono con la glicoproteina attraverso il suo motivo PPSY

Con lo scopo di chiarire il ruolo funzionale dell’ubiquitinazione di UL55,

abbiamo osservato la presenza, a livello della sua sequenza aminoacidica, di un

motivo PPSY (AA 810-813), che è sovrapponibile alla sequenza consenso PPxY

che media il legame con proteine caratterizzate da domini WW, quali le ubiquitino

ligasi della famiglia Nedd4 (Strack et al., 2000). Inoltre, significativamente, e

come descritto in dettaglio nell’introduzione (paragrafo 1.9), il dominio PPxY è

una delle tre sequenze ricche in prolina note come L-domain, che mediano il

legame di proteine strutturali virali con fattori cellulari importanti nella biogenesi

e nel funzionamento del pathway dei MVB, come appunto le ubiquitino ligasi

della famiglia Nedd4.

Abbiamo, pertanto, analizzato un possibile coinvolgimento di queste ligasi

nell’ubiquitinazione di UL55. A tale scopo i plasmidi codificanti UL55wt 3’Flag e

5’HA Ubi sono stati trasfettati insieme al vettore vuoto o ai costrutti esprimenti le

ubiquitino ligasi wt o le stesse mutate a livello di una cisteina essenziale per

l’attività enzimatica e presente a livello del sito attivo (C→S) (Strack et al., 2000).

UL55 è stata immunoprecipitata dai lisati cellulari utilizzando un MAb diretto

verso l’epitopo Flag e analizzata in WB impiegando un MAb anti-HA. I rispettivi

lisati sono stati incubati con un MAb anti-Flag

Il pattern di ubiquitinazione mostra che le ubiquitino ligasi di questa famiglia

hanno un ruolo nell’ubiquitinazione di UL55 (Figura 4.4.1 A). Infatti, in presenza

delle forme cataliticamente attive delle ubiquitino ligasi, l’ubiquitinazione di gB

aumenta (Figura 4.4.1 A) e i corrispondenti lisati mostrano che la glicoproteina

viene degradata (Figura 4.4.1 B); al contrario, in presenza delle ubiquitino ligasi

funzionalmente inattive i livelli della glicoproteina non risultano diminuiti (Figura

4.4.1 B).

95

_______________________________________________________________________________

Figura 4.4.1 Le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 sono coinvolte nell’ubiquitinazione e

nella degradazione di UL55. (A) Analisi elettroforetica e WB dei lisati di cellule 293T

cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag e pBJ5 HA-Ubi insieme al vettore vuoto

pBJ5, o a pBJ5-5’Flag AIP4, Nedd4-1, Nedd4-2s or WWP1. Il WB è stato sviluppato per il MAb

anti-HA. (B e C). Cellule 293T sono state cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55

3’Flag insieme a pBJ5, o pBJ5-5’Flag- AIP4, Nedd4-1, Nedd4-2s o WWP1, o agli stessi costrutti

codificanti le ubiquitino ligasi mutate a livello della cisteina catalitica (C→S). I rispettivi lisati

cellulari sono stati analizzati in WB con il MAb anti-Flag o con il MAb anti-tubulina. Sulla destra

sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

A conferma di questa conclusione, mediante saggi di coimmunoprecipitazione

(co-IP), siamo stati in gradi di dimostrare:

i) che UL55 interagisce con vari membri di questa famiglia di ubiquitino

ligasi (Nedd4-1, Nedd4-2s, AIP4 e WWP1) (Figura 4.4.2 A);

ii) che il sito di legame è rappresentato proprio dal dominio PPSY (Figura

4.4.2 A).

E’ da notare che nei saggi di co-IP sono state impiegate le forme cataliticamente

inattive delle ubiquitino ligasi al fine di evitare che UL55 fosse degradata e per

stabilizzare l’eventuale interazione.

96

______________________________________________________________________Risultati

Figura 4.4.2 UL55 interagisce con membri delle ubiquitino ligasi E3 della famiglia Nedd4

attraverso il suo motivo PPSY. (A e B) Cellule 293T sono state cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-

His/TOPO-UL55 3’HA, o la forma mutata di UL55 a livello del motivo PPSY (pcDNA3.1/V5-

His/TOPO-UL55PPSA 3’HA) insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-5’Flag AIP4C830S, Nedd4-

1C867S, Nedd4-2sC801S o WWP1C886S. I campioni sono stati immunoprecipitati con il MAb M2 anti-

Flag e analizzati in WB con il MAb anti-HA o il MAb anti-Flag, come indicato. Sulla destra sono

riportati i pesi molecolari di riferimento.

Ad ulteriore conferma del fatto che il dominio PPxY è fondamentale per il legame

tra UL55 e le ubiquitino ligasi, abbiamo verificato che l’interazione tre le due

proteine viene mantenuta anche nel caso in cui la gB sia privata di una porzione

della coda citoplasmatica (UL55833). Il risultato era atteso in quanto UL55833

contiene ancora il dominio PPSY (Figura 4.4.3 A).

97

_______________________________________________________________________________

Figura 4.4.3 UL55833 continua ad interagire con le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4. (A

e B) Analisi elettroforetica e WB delle co-IP tra le ubiquitino ligasi Nedd4 e UL55833. Cellule

293T sono state cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55833 3’HA (o pcDNA3.1/V5-

His/TOPO-UL55 3’HA come controllo di co-IP) insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-5’Flag

AIP4C830S, Nedd4-1C867S, Nedd4-2sC801S o WWP1C886S. Le ubiquitino ligasi sono state

immunoprecipitate dai lisati cellulari con il MAb anti-Flag e i campioni sono stati analizzati in

WB con il MAb anti-HA o il MAb anti-Flag, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi

molecolari di riferimento.

Infine, coerentemente con quest’ultimo risultato, quando le cellule 293T sono

state trasfettate con UL55PPSA 3’Flag insieme a 5’Flag AIP4 o 5’Flag AIP4C830S e i

lisati analizzati in WB, il mutante UL55PPSA non è risultato degradato dalle

ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 funzionali (Figura 4.4.4).

98

______________________________________________________________________Risultati

Figura 4.4.4 Le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 degradano UL55wt e UL55833, ma non

UL55PPSA. (A e B) Analisi elettroforetica e WB dei lisati di cellule 293T cotrasfettate con

pcDNA3.1/V5-His/TOPO UL55 3’Flag, pcDNA3.1/V5-His/TOPO UL55833 3’Flag o

pcDNA3.1/V5-His/TOPO UL55PPSA insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-5’Flag AIP4, o a

pBJ5-5’Flag AIP4C830S. L’analisi di WB è stata effettuata con il MAb anti-Flag o il MAb anti-

tubulina. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

4.5 UL55PPSA mostra una differente localizzazione rispetto a UL55wt e UL55833 in cellule trasfettate

Ad ulteriore conferma di questa conclusione sono i risultati ottenuti dall’analisi

della localizzazione intracellulare delle tre forme di gB. Cellule Cos7 sono state

cotrasfettate con UL55wt, UL55833 o UL55PPSA fuse in 3’ all’epitopo HA. 24 ore

dopo le cellule sono state fissate, permeabilizzate, incubate con il PAb anti-HA ed

analizzate al microscopio confocale (Figura 4.5.1). I pannelli da A a C mostrano

la normale distribuzione di UL55wt a livello della membrana nucleare e in

vescicole discrete a livello citoplasmatico. La localizzazione di UL55833 non

appare significativamente diversa (da D a F). UL55PPSA, invece, sembra

accumulare a livello di vescicole citoplasmatiche ingrossate (da G a I). Lo stesso

risultato è stato ottenuto anche confrontando UL55wt e UL55PPSA prive di tag, a

dimostrazione che l’effetto è attribuibile in modo specifico alla mutazione del

motivo PPSY (figura non mostrata). Una possibile interpretazione dei dati, in

linea con i risultati del WB (Figura 4.4.4), è che, non essendo UL55PPSA degradata

in maniera corretta, si accumuli all’interno della cellula determinando

l’allargamento delle vescicole.

99

_______________________________________________________________________________

Figura 4.5.1 UL55PPSA presenta una localizzazione differente rispetto a UL55wt e UL55833 in

cellule trasfettate. Cellule Cos7 sono state trasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’HA

(da A a C), o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55833 3’HA (da D a F), o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-

UL55PPSA 3’HA (da G a I). 24 h dopo le cellule sono state incubate con il MAb anti-HA e

successivamente con l’opportuno Ab secondario. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I

vetrini sono stati analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo

63X ad immersione ed apotoma.

4.6 UL55PPSA e la forma wt in presenza di Vps4E228Q rilocalizzano a livello delle membrane degli endosomi precoci

Sulla base dei risultati dei WB in figure 4.4.4 e 4.3.2 che mostrano che sia

UL55PPSA sia UL55wt in presenza di VpsE228Q accumulano e allo scopo di capire la

natura delle vescicole ingossate che abbiamo visto nelle successive analisi di IF

per entrambe le condizioni (Figure 4.5.1 e 4.3.3), abbiamo eseguito dei saggi di

colocalizzazione con noti marker di diversi organelli cellulari. In modo

significativo l’analisi ha mostrato come in entrambe i casi la glicoproteina virale

colocalizza con il marcatore degli endosomi precoci EEA-1 e che, pertanto, le

vescicole ingrossate che abbiamo notato corrispondono ad endosomi precoci (EE)

aberranti (Figura 4.6.1). La colocalizzazione di UL55PPSA con la γ adaptina (TGN)

è, invece, del tutto simile a quella osservata per la forma wt, né vi sono alterazioni

a carico delle membrane del TGN, quindi l’effetto del mutante è specifico per gli

EE (figura non mostrata).

100

______________________________________________________________________Risultati

Figura 4.6.1 Sia UL55PPSA sia UL55wt in presenza di VpsE228Q rilocalizzano in vescicole

endosomiali aberranti. Cellule Cos7 sono state trasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55

3’HA (da A a C), o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55PPSA 3’HA (da D a F), o pcDNA3.1/V5-

His/TOPO-UL55 3’HA insieme a pBJ5-5’Flag Vps4E228Q (da G a I). 24 h dopo le cellule sono

state incubate con il PAb anti-HA e il Mab anti-EEA-1 e successivamente con l’opportuno Ab

secondario. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I vetrini sono stati analizzati al

microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo 63X ad immersione ed apotoma.

4.7 UL55 segue la via dei MVB/lisosomi

Per confermare che UL55 durante il trafficking intracellulare entra in contatto con

la via dei MVB/lisosomi abbiamo condotto degli esperimenti in presenza di

bafilomicina A1, un inibitore che, prevenendo l’acidificazione degli endosomi,

blocca la maturazione dei lisosomi. I livelli di UL55 (sia il precursore sia la forma

processata) aumentano in presenza dell’inibitore. Inoltre, in maniera più evidente,

in presenza di bafilomicina e di AIP4 si può osservare un parziale rescue dei

livelli di glicoproteina (Figura 4.7.1 A).

Questo risultato evidenzia che i MVB/lisosomi sono coinvolti nella degradazione

di UL55. Normalmente la forma matura della glicoproteina (vale per tutti tre gli

omologhi analizzati) è caratterizzata da due bande di peso molecolare leggermente

diverso. Non abbiamo analizzato la natura delle bande, ma è possibile supporre si

tratti di due forme a diverso grado di glicosilazione, fosforilazione o di

101

_______________________________________________________________________________

ubiquitinazione di gB. In presenza dell’inibitore bafilomicina, invece, si può

osservare la presenza di un’unica banda (Figura 4.7.1 A).

Figura 4.7.1 UL55 è degradata attraverso il pathway MVB/lisosomi. (A e B) Analisi

elettroforetica e WB dei lisati di cellule 293T cotrasfettate in doppio con pcDNA3.1/V5-

His/TOPO-UL55 3’Flag insieme al vettore vuoto pBJ5, o a pBJ5-5’Flag AIP4 o a pBJ5-5’Flag

AIP4C830S. 6 h dopo la trasfezione ad uno dei due gruppi di cellule è stata aggiunta bafilomicina A1

10 nM (A) A 24 h dalla trasfezione i lisati sono stati analizzati con il MAb anti-Flag. (B) Il

caricamento è stato controllato con un PAb anti-tubulina. Sulla destra sono riportati i pesi

molecolari di riferimento.

4.8 Localizzazione dei mutanti di UL55 nel contesto dell’infezione virale

Al fine di analizzare la localizzazione dei tre mutanti di gB anche nel contesto

dell’infezione virale, abbiamo clonato le tre forme della glicoproteina fuse in 3’

all’HA nel vettore inducibile psVT28. Cellule MRC5 sono state elettroporate con

il vettore vuoto o con i costrutti esprimenti gB. 24 ore dopo la trasfezione le

cellule sono state infettate a m.o.i. 3 con il virus wt e 48 ore dopo incubate con

doxiciclina 1 µg/ml, in modo da permettere l’espressione delle gB. 3 giorni dopo

l’infezione (3 d.p.i.) le cellule sono state fissate, permeabilizzate e incubate con il

MAb anti-UL55 o il MAb anti-HA (Fig 4.8.1). L’analisi dei risultati ottenuti

conferma in linea generale quanto osservato in cellule trasfettate, in particolare

per il mutante gBPPSA, che accumula in vescicle aberranti e presenta un difetto di

102

______________________________________________________________________Risultati

accumulo all’AC (da J a M). Per gB833, invece, si osserva in molti campi un

ritardo di accumulo all’AC (da G a I).

Figura 4.8.1 Localizzazione delle tre forme di gB nel contesto dell’infezione virale. Cellule

MRC5 sono state elettroporate con il vettore vuoto psVT28 (da A a C), o con i costrutti psVT28-

UL55 3’HA (da D a F), o psVT28-UL55833 3’HA (da G a I), o psVT28-UL55PPSA 3’HA (da J a

M). 24 h dopo la trasfezione le cellule sono state infettate con HCMV a m.o.i. 3. 48 h dopo sono

state incubate con doxiciclina 1 µg/ml e 36 h dopo fissate e permeabilizzate. Lo staining è stato

eseguito con il MAb anti-UL55 2F12 o con il MAb anti-HA e con il PAb anti-UL71 e

successivamente con l’opportuno Ab secondario. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I

campioni sono stati analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con obiettivo

63X ad immersione ed apotoma.

103

_______________________________________________________________________________

4.9 Ruolo delle deubiquitinasi AMSH e UBPY

Essendo gB bersaglio di ubiquitino ligasi ed essendo chiaro il ruolo svolto dai

MVB/lisosomi durante il trafficking della proteina, abbiamo voluto valutare il

ruolo svolto dagli enzimi a funzione de-ubiquitinasica UBPY/USP8 e AMSH, che

cooperano con le proteine della famiglia Nedd4-like a determinare il complesso

equilibrio tra ubiquitinazione/de-ubiquitinazione delle proteine cargo all’interno

del sistema endo-esocitico della cellula (paragrafo 1.9 dell’introduzione).

A tale scopo, la sequenza codificante UBPY è stata clonata nel vettore pcDNA3.1

fusa in frame al 5’ con l’epitopo HA. E’ stata anche inserita, mediante mutagenesi

sito specifica, a livello del sito catalitico dell’enzima la mutazione C786S

(Mizuno et al., 2005; Alwan et al., 2006; Row et al., 2007; Komada, 2008) che lo

inattiva. Analogamente, la sequenza codificante AMSH, già disponibile nel nostro

laboratorio fusa in 5’ all’epitopo HA, è stata mutagenizzata al fine di ottenere la

forma dominante negativa dell’enzima, contenente la mutazione D348A

(Zamborlini et al., 2006). Quest’ultima mutazione mappa a livello del dominio

JAMM e abolisce l’attività isopeptidasica di AMSH, determinando l’accumulo di

ubiquitina a livello endosomiale (paragrafo 1.9 dell’introduzione).

La figura 4.9.1 A mostra che in presenza di entrambe le isopeptidasi

l’ubiquitinazione di gB diminuisce, mentre viene ripristinata in presenza delle due

isopeptidasi cataliticamente inattive. Analizzando i lisati cellulari è possibile

osservare che sovraesprimendo AMSH i livelli di UL55 aumentano (Figura 4.9.1

B). Questo risultato è in accordo con il ruolo proposto in letteratura per AMSH

(Welchman et al., 2005; Clague M. J. and Urbe S. 2006; McCullough et al.,

2008). Infatti, AMSH avrebbe la funzione di deubiquitinare le proteine cargo

prima che queste vengano portate nel lume dell’endosoma durante la formazione

dei MVB, promuovendo, così, il loro reciclo verso la membrana plasmatica.

Inoltre, l’accumulo di gB appare ancora più marcato in presenza della mutazione

puntiforme D348A (Figura 4.9.1 B), anche questo in accordo con i dati in

letteratura che indicano come la forma dominante negativa AMSHD348A amplifica

l’effetto della proteina wt (Zamborlini et al., 2006). L’espressione di UBPY,

invece, determina la diminuzione dei livelli di UL55, coerentemente al ruolo

proposto per questa deubiquitinasi di rimuovere l’ubiquitina dalle proteine target

appena prima della loro entrata e degradazione attraverso le ILV (Welchman et

104

______________________________________________________________________Risultati

al., 2005; Clague M. J. and Urbe S. 2006; McCullough et al., 2008). Al contrario,

come atteso, UBPYC786S determina l’accumulo della glicoproteina (Figura 4.9.1

B).

Figura 4.9.1 AMSH e UBPY deubiquitinano UL55. (A e B) Analisi elettroforetica e WB delle

IP e dei lisati di cellule 293T cotrasfettate con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag e pBJ5-

5’HA Ubi insieme al vettore vuoto pcDNA3.1, o a pcDNA3.1-5’HA AMSH, o pcDNA3.1-5’HA

AMSHD348A, o pcDNA3.1-5’HA UBPY, o pcDNA3.1-5’HA UBPYC786S. UL55 è stata

immunoprecipitata con il MAb anti-Flag e il WB è stato sviluppato per il MAb anti-HA. I

rispettivi lisati cellulari sono stati analizzati con il MAb anti-Flag. Sulla destra sono riportati i pesi

molecolari di riferimento.

4.10 UL55, ma non UL55833, interagisce con Tsg101

Essendo UL55 altamente ubiquitinata abbiamo cercato di approfondire i

meccanismi che ne possano determinare il reclutamento ai MVB, analizzandone

l’interazione con varie proteine di sorting che legano e reclutano proteine

ubiquitinate (Puertollano and Bonifacino, 2004). Abbiamo innanzitutto escluso

mediante co-IP l’interazione di UL55 con Hrs (Figura 4.10.1 A e B), GGA1

(Figura 4.10.1 C e D) e le proteine Tom1 e Tom1L1 (Figura 4.10.1 E e F).

105

_______________________________________________________________________________

Figura 4.10.1 UL55 non interagisce con Hrs, GGA1 o le proteine Tom (A e B) Cellule 293T

sono state cotrasfettate con i pBJ5-5’HA Hrs e pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag. I

campioni sono stati immunoprecipitati con il MAb M2 anti-Flag e analizzati con il MAb anti-HA

o il MAb anti-Flag. (C e D) Cellule 293T sono state cotrasfettate con il plasmide pCR3.1-5’myc

GGA1 insieme al vettore vuoto pcDNA 3.1, o a pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag, o a

pBJ5-5’Flag Nedd4-1, come controllo positivo di co-IP. I campioni sono stati immunoprecipitati

con il MAb M2 anti-Flag e analizzati con il MAb anti-myc o il MAb anti-Flag. (E e F) Cellule

293T sono state cotrasfettate con i plasmidi pcDNA3HFN-5’Flag Tom1, o pcDNA3HFN-5’Flag

Tom1L1, o con il vettore vuoto pcDNA3.1, insieme a pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’HA. I

lisati sono stati immunoprecipitati con il MAb M2 anti-Flag e il WB è stato sviluppato con il MAb

anti-HA o il MAb anti-Flag. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

A questo punto abbiamo spostato la nostra attenzione su proteine appartenenti al

complesso ESCRT-I, che intervengono nel pathway più a valle rispetto alle

proteine cellulari precedentemente analizzate. In particolare, abbiamo ipotizzato

che UL55 potesse essere reclutata da una proteina con un ruolo essenziale e

precoce nel pathway dei MVB e quindi abbiamo focalizzato la nostra attenzione

su Tsg101. È noto che le proteine che interagicono con tale componente del

complesso ESCRT-I contengono un L-domain di tipo P(T/S)AP. Nonostante

UL55 non contenga nella sua struttura primaria una sequenza consenso

sovrapponibile a tale motivo, abbiamo verificato mediante co-IP che UL55

interagisce con Tsg101 (Figura 4.10.2 A). Per dimostrare la specificità

dell’interazione e il fatto che Tsg101 non interagisce con tutte le proteine

ubiquitinate abbiamo dimostrato che non co-immunoprecipita né con la gB di

HSV-1 né con UL27 (gB di PRV) (Figura 4.10.2 A).

106

______________________________________________________________________Risultati

Figura 4.10.2 UL55, ma non la gB di HSV-1 né UL27 di PRV, interagisce con Tsg101. (A, B,

C) Analisi elettroforetica e WB delle CO-IP tra UL55, la gB di HSV-1 e UL27 con Tsg101.

Cellule 293T sono state cotrasfettate con il vettore vuoto pcDNA 3.1, o con pcDNA3.1/V5-

His/TOPO-UL55 3’Flag, o con pgBwtMTS-HSV-1 gB, o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL27

3’Flag, insieme a pBJ5-5’HA Tsg101. (A e B) UL55 e UL27 sono state immunoprecipitate dai

lisati cellulari con il MAb anti-Flag. (A e C) La gB di HSV-1 è stata immunoprecipitata con il PAb

anti-HSV-1. I campioni sono stati analizzati in WB con il MAb anti-HA, il MAb anti-Flag o il

PAb anti-HSV-1, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

Allo scopo di mappare il sito di legame di UL55 con Tsg101 abbiamo ripetuto il

saggio di co-IP usando UL55833 3’Flag (e UL55 3’Flag come controllo positivo di

co-IP). In questo modo siamo stati in grado di dimostrare che l’interazione non è

mantenuta per la forma tronca di UL55 e che, pertanto, il dominio responsabile

dell’interazione è contenuto a livello della coda citoplasmatica entro gli ultimi 73

aminoacidi della glicoproteina (Figura 4.10.3 A).

107

_______________________________________________________________________________

Figura 4.10.3 UL55833 non interagisce con Tsg101. (A e B) Analisi elettroforetica e WB delle

co-IP tra UL55833 e Tsg101. Cellule 293T sono state cotrasfettate con il vettore vuoto pcDNA 3.1,

o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55833 3’Flag (o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO UL55 3’Flag

come controllo positivo di co-IP) insieme a pBJ5-5’HA Tsg101. UL55 è stata immunoprecipitata

dai lisati cellulari con il MAb anti-Flag e i campioni sono stati analizzati in WB con il MAb anti-

HA o il MAb anti-Flag, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

Poiché UL55 non contiene un dominio P(S/T)AP, abbiamo formulato alcune

ipotesi di meccanismo per questa interazione, che abbiamo in parte analizzato

sperimentalmente:

• Interazione indiretta mediata dalle ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4.

• Interazione indiretta attraverso l’ubiquitina.

• Interazione diretta attraverso una sequenza non convenzionale analoga

funzionalmente a P(T/S)AP.

Per quanto riguarda il primo meccanismo è noto che le proteine del complesso

ESCRT-I vengono ubiquitinate dalle ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4

(Chung et al., 2008). Inoltre, è stato dimostrato che una ubiquitino ligasi aviaria

con il 93% di omologia a Nedd4-2s (HA-LDI-1) associa con Tsg101 (Medina et

al., 2005). Abbiamo, quindi, analizzato mediante co-IP se Tsg101 è in grado di

interagire con le isoforme umane delle ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4. I

nostri dati dimostrano che questo è in effetti il caso (Figura 4.10.4 A). Tuttavia,

abbiamo dimostrato che il mutante di UL55 che non interagisce più con le

ubiquitino ligasi Nedd4 (UL55PPSA) continua ad interagire con Tsg101 (Figura

4.10.4 C).

108

______________________________________________________________________Risultati

Figura 4.10.4 L’interazione tra UL55 e Tsg101 non è mediata dalle ubiquitino ligasi della

famiglia Nedd4. (A e B) Cellule 293T sono state trasfettate con pBJ5, o pBJ5-5’Flag AIP4C830S,

Nedd4-1C867S, Nedd4-2sC801S o WWP1C886S, insieme a pBJ5-5’HA Tsg101. I campioni sono stati

immunoprecipitatati con il MAb M2 anti-Flag e analizzati in WB con il MAb anti-HA o il MAb

anti-Flag, come indicato. (C e D) Cellule 293T sono state trasfettate con pcDNA3.1/V5-

His/TOPO-UL55 3’Flag, o pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55PPSA 3’Flag, insieme a pBJ5-5’HA

Tsg101. La glicoproteina è stata immunoprecipitata con il MAb M2 anti-Flag e il WB è stato

sviluppato con il MAb anti-HA o il MAb anti-Flag.

Per analizzare gli altri due meccanismi proposti, abbiamo mutagenizzato due siti

del dominio N-terminale UEV (ubiquitin E2 variant) di Tsg101, responsabili con

maggiore affinità, come riportato nel lavoro Pornillos et al., 2003, delle

interazioni con l’ubiquitina (residuo N45) e con il L-domain PTAP contenuto nel

dominio p6 di Gag di HIV-1 (residuo M95). Il nostro risultato, riportato in figura

4.10.5 A, mostra che i due mutanti Tsg101N45A e Tsg101M95A continuano ad

interagire con la glicoproteina virale, per cui, verosimilmente, l’interazione tra le

due proteine non è mediata né dall’ubiquitina, né, in prima approssimazione, dal

legame con motivi analoghi a P(T/S)AP. Tuttavia, quest’ultimo aspetto non può

essere escluso completamente e stiamo attualmente saggiando altri mutanti a

livello di regioni ricche in prolina che potrebbero mimare il P(T/S)AP. Resta,

inoltre, da testare l’effetto della combinazione di entrambe le mutazioni sul

legame tra UL55 e Tsg101.

109

_______________________________________________________________________________

Figura 4.10.5 L’interazione tra UL55 e Tsg101 non è mediata né dall’ubiquitina né dal

motivo P(T/S)AP. (A e B) Analisi elettroforetica e WB delle co-IP tra UL55 e i due mutanti di

Tsg101 Tsg101N45A e Tsg101M95A. Cellule 293T sono state cotrasfettate con il vettore vuoto

pcDNA 3.1, o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO-UL55 3’Flag, insieme a pBJ5-5’HA Tsg101 (come

controllo positivo di co-IP), o a pBJ5-5’HA Tsg101N45A, o a pBJ5-5’HA Tsg101M95A. UL55 è stata

immunoprecipitata dai lisati cellulari con il MAb anti-Flag. Le IP sono state analizzate in WB con

il MAb anti-HA e il MAb anti-Flag, come indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di

riferimento.

Analogamente, per mappare il sito di legame tra le due proteine anche in Tsg101,

abbiamo costruito varie forme delete della proteina basate sulla sua

organizzazione strutturale (Figura 1.9.2 dell’introduzione) e sull’espressione di

forme tronche già riportate in letteratura (Demirov et al., 2001; Bouamr et al.,

2006; Johnson et al., 2004). La figura 4.10.6 mostra l’elenco delle forme tronche

di Tsg101 (insieme ai due mutanti nell’UEV Tsg101N45A e Tsg101M95A), clonate

tutte nel vettore pBJ5 fuse al N-termine all’epitopo HA.

Figura 4.10.6 Forme tronche e mutanti della proteina dei MVB Tsg101. I costrutti sono stati

clonati nel vettore pBJ5 fusi al N-termine all’epitopo HA.

110

______________________________________________________________________Risultati

La corretta espressione di tutte queste forme mutate è stata verificata nei lisati di

cellule 293T trasfettate con questi costrutti, sviluppando un WB contro l’HA

(figura non mostrata).

L’analisi di co-IP ha rivelato come il dominio responsabile dell’interazione con

UL55 sia il dominio UEV, compreso nei primi 145 aminoacidi della proteina. La

figura 4.10.7 A mostra, infatti, che la co-IP con UL55 è mantenuta solo per i

costrutti di Tsg101 che contengono il dominio UEV 5’HA Tsg1011-145 e 5’HA

Tsg1011-215 (che contiene il dominio UEV e quello PRO). Non è osservata,

invece, co-IP con UL55 per le forme tronche che non contengono l’UEV 5’HA

Tsg101215-390 (che codifica i domini CC e S-Box, incluso il motivo PTAP) e 5’HA

Tsg101146-390 (che contiene i motivi PRO, CC e S-Box).

Figura 4.10.7 L’interazione tra UL55 e Tsg101 è mediata dal dominio UEV di Tsg101. (A e

B) Analisi elettroforetica e WB delle co-IP tra UL55 e le forme tronche di Tsg101. Cellule 293T

sono state cotrasfettate con il vettore vuoto pcDNA 3.1, o con pcDNA3.1/V5-His/TOPO UL55

3’Flag, insieme a pBJ5-5’HA Tsg1011-145, o a pBJ5-5’HA Tsg1011-215, o a pBJ5 5’HA Tsg101215-

390, o a pBJ5-5’HA Tsg101146-390. UL55 è stata immunoprecipitata dai lisati cellulari con il MAb

anti-Flag. Le IP sono state analizzate in WB con il MAb anti-HA e il MAb anti-Flag, come

indicato. Sulla destra sono riportati i pesi molecolari di riferimento.

4.11 La proteina dei MVB Tsg101 è reclutata all’assembly compartment

Al fine di valutare se altre proteine appartententi al pathway dei MVB oltre a

Vps4 sono reclutate all’assemby compartment (AC) durante l’infezione da HCMV

e dal momento che gB interagisce con Tsg101, abbiamo utilizzato un vettore

oncoretrovirale che esprime Tsg101 fusa al N-termine al Flag (pMSCV-5’Flag

111

_______________________________________________________________________________

Tsg101), già disponibile nel nostro laboratorio, per trasdurre cellule HFF. Infatti

queste cellule non sono facilmente trasfettabili e la trasduzione con vettori virali

rappresenta una buona alternativa. Il retrovirus ricombinante viene prodotto

trasfettando in cellule 293T il vettore oncoretrovirale esprimente la proteina di

interesse, pMSCV-5’Flag Tsg101, contemporaneamente ai costrutti MLV Gag-

Pol, che fornisce le proteine strutturali ed enzimatiche necessarie alla formazione

della particelle retrovirali, e VSV-G, che fornisce alle particelle l’envelope del

virus della stomatite vescicolare, dotato di ampio tropismo. Dopo 48 ore dalla

trasfezione i surnatanti delle cellule trasfettate sono centrifugati a 23000 rpm per

un’ora e il pellet è risospeso in 500 µl di MEM, in modo da concentrare il virus in

questo piccolo volume, che viene utilizzato per trasdurre le cellule HFF.

L’efficienza di trasduzione è stata controllata mediante analisi citofluorimetrica di

cellule HFF trasdotte con il virus di controllo che esprime la GFP (trasfettando

pMSCV-LTR GFP al posto di pMSCV-5’Flag Tsg101) e infettate 72 ore dopo la

trasduzione. L’analisi effettuata 96 ore dopo l’infezione ha mostrato come il 66%

delle cellule risultino positive per l’espressione della GFP (Figura 4.11.1).

Figura 4.11.1 Analisi citofluorimetrica dell’efficienza di trasduzione di cellule HFF con il

vettore oncoretrovirale pMSCV-LTR GFP. Cellule HFF sono state trasdotte con pMSCV-LTR

GFP e 72 h dopo la trasduzione sono state infettate con HCMV a m.o.i. 1. L’analisi al FACS è

stata effettuata 96 h.p.i.

Il giorno dopo la trasduzione le cellule sono state infettate a m.o.i. 1 con il virus

wt e osservate al microscopio confocale 4 giorni dopo l’infezione (4 d.p.i.) in

seguito a fissazione, permeabilizzazione e marcatura. La figura 4.11.2 mostra lo

staining con il PAb anti-Flag per marcare Tsg101 e con il MAb anti-UL55 per

visualizzare la glicoproteina. Il pannelli A e D mostrano che la proteina Tsg101 è

reclutata all’AC ma non colocalizza nell’anello positivo per la gB (C e F). Lo

staining effettuato con il MAb anti-Flag e con il PAb anti-UL71, invece, mostra

112

______________________________________________________________________Risultati

che Tsg101 colocalizza con la proteina del tegumento UL71, che si distribuisce in

tutto l’AC (Figura 4.11.3).

Figura 4.11.2 Tsg101 è reclutato all’AC in cellule infettate ma non colocalizza con gB. Cellule

HFF sono state trasdotte con il vettore pMSCV-5’Flag Tsg101. 24 h dopo la trasduzione le cellule

sono state infettate con HCMV a m.o.i. 1. 96 h dopo sono state fissate e permeabilizzate. Lo

staining è stato eseguito con il PAb anti-Flag e con il MAb anti-UL55 2F12 e successivamente con

gli opportuni Ab secondari. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I campioni sono stati

analizzati al microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con apotoma.

Figura 4.11.3 Tsg101 colocalizza con UL71 durante l’infezione. Cellule HFF sono state

trasdotte con il vettore pMSCV-5’Flag Tsg101. 24 h dopo la trasduzione le cellule sono state

infettate con HCMV a m.o.i. 1. 96 h dopo sono state fissate e permeabilizzate. Lo staining è stato

eseguito con il MAb M2 anti-Flag e con il PAb anti-UL71 e successivamente con gli opportuni Ab

secondari. I nuclei sono stati marcati con DAPI 1 µg/ml. I campioni sono stati analizzati al

microscopio a confocale Axio-Observer.Z1 (Zeiss) con apotoma .

113

_______________________________________________________________________________

Questi dati forniscono un’evidenza sperimentale del ruolo svolto da proteine dei

MVB nell’assemblaggio di HCMV. Infatti Tsg101 è chiaramente reclutata a

questo livello. Dall’altro, risulta evidente che, nonostante UL55 interagisca

fisicamente con Tsg101, non localizza con questa proteina cellulare a livello degli

AC, indicando che, con tutta probabilità, la loro interazione avviene prima della

formazione degli AC e forse serve al virus proprio per condurre Tsg101 nel sito di

assemblaggio. Esperimenti condotti con virus caratterizzati da mutazioni a livello

di gB che abrogano l’interazione con Tsg101 o privi di questa glicoproteina

(descritti nel paragrafo 4.12), ci permetteranno di chiarire questo aspetto. Inoltre

resta da analizzare la localizzazione delle ubiquitino ligasi Nedd4 nelle cellule

infettate.

4.12 Costruzione di virus ricombinanti mediante tecnologia BAC

Allo scopo di caratterizzare le interazioni precedentemente descritte tra UL55 e le

proteine ESCRT nel contesto dell’infezione virale e, quindi, capire se tali

interazioni hanno un ruolo nel ciclo replicativo di HCMV e sono importanti per la

localizzazione intracellulare della glicoproteina, abbiamo introdotto le mutazioni

già descritte (UL55PPSA e UL55833) nel genoma virale. Attraverso la tecnica di

mutagenesi basata sul Cromosoma artificiale batterico (BAC) Markeless two step

Red-mediated recombination (Tishet et al., 2006), in collaborazione con il

laboratorio del Prof. Mertens, (Institute of Virology, Uniklinik Ulm, Germany),

sono stati costruiti, a partire dal virus parentale TB40-BAC4, tre virus mutanti:

1. vUL55PPSA, in cui attraverso una mutazione puntiforme il motivo PPSY

è stato mutato a PPSA.

2. vUL55833, che per introduzione di un codone di stop in posizione 834

esprime la forma tronca di gB a livello della coda C-terminale.

3. v∆UL55, che non codifica più la glicoproteina. La delezione inserita

ricopre la sequenza aminoacidica 13-783 per evitare la delezione del

promotore di UL54, come accade, invece, per il virus deleto di UL55 del

lavoro Isaacson and Compton, 2009.

I mutanti sono stati sequenziati ed il DNA bacmidico è stato sottoposto a

restrizione enzimatica per confrontare il pattern di digestione ottenuto per i

mutanti rispetto al virus parentale (Figura 4.12.1). Come previsto, i mutanti

114

______________________________________________________________________Risultati

UL55PPSA e UL55833 presentano un pattern identico a quello del virus wt poiché

l’introduzione della mutazione puntiforme e del codone di stop non alterano siti di

restrizione per i tre enzimi che abbiamo usato, mentre la delezione 13-783 nel

mutante v∆UL55 comporta la distruzione di alcuni siti di restrizione (*),

determinando un pattern di bande differente (Figura 4.12.1).

Figura 4.12.1 Controllo dei mutanti virali ottenuti mediante mutagenesi con il BAC

attraverso digestione enzimatica. Le restrizioni del DNA bacmidico wt e di quello di vUL55PPSA,

vUL55833 e v∆UL55 sono state effettuate rispettivamente con HindIII, EcoRI e EcoRV. Le bande

scomparse nelle lane del mutante v∆UL55, a causa della distruzione di alcuni siti di restrizione,

sono segnate con *. M, marker dei pesi molecolari. A sinistra è riportata la dimensione delle

bande.

Attualmente è in corso la caratterizzazione dei tre mutanti valutando le proprietà

di crescita dei virus ricostituiti ed in futuro ci proponiamo di utilizzarli per saggi

di IF e di microscopia elettronica. La ricostituzione a partire dal DNA bacmidico è

effettuata per elettroporazione di cellule MRC5 (paragrafo 3.6.1). Insieme al DNA

bacmidico è elettroporato anche il plasmide codificante la fosfoproteina del

tegumento pp71 che funziona da transattivatore virale ed incrementa in vitro

l’efficienza di trasfezione. Attraverso il mutante virale v∆UL55 ci proponiamo di

valutare l’effetto della totale mancanza della glicoproteina sul ciclo replicativo di

HCMV. Per poter effettuare i saggi di complementazione con questo mutante

stiamo ricostituendo il virus wt trasfettando cellule MRC5 con il DNA virale

insieme a UL55wt, che abbiamo clonato fusa in 3’all’epitopo HA nel vettore pEF,

privo del promotore forte del HCMV.

115

___________________________________________________________________Discussione

5 DISCUSSIONE

I virus dotati di envelope acquisiscono il pericapside gemmando attraverso

membrane cellulari di varia natura, da quella plasmatica, a quella nucleare, a

quella di organelli citoplasmatici. Un’infezione produttiva richiede che tutti i

componenti che rendono la particella virale infettiva si localizzino in modo

coordinato nel sito della membrana dove avverrà la gemmazione. I virus sono

parassiti intracellulari obbligati e come tali sfruttano diversi pathway cellulari

durante la propria replicazione. Ad esempio è ormai ampiamente dimostrato che i

virus rivestiti di envelope e dotati di genoma ad RNA sono in grado di utilizzare il

pathway di biogenesi dei multivesicular body (MVB) durante le fasi finali del

ciclo replicativo, ed in particolare maturazione e gemmazione (Calistri et al.,

2008). I MVB rappresentano l’organello a livello del quale viene deciso il destino

delle proteine di membrana ovvero la loro degradazione attraverso il lisosoma o il

loro ritorno in membrana dopo l’endocitosi. L’evento chiave è la formazione di

vescicole intraluminali (ILV) che si formano a livello degli endosomi tardivi,

nelle quali vengono incorporate le proteine transmembranarie destinate alla

degradazione. La genesi e la gemmazione delle ILV, un fenomeno

topologicamente identico alla fuoriuscita di particelle virali dalla cellula, richiede

l’intervento di numerose proteine, che normalmente sono presenti nel citoplasma

della cellula e che vengono reclutate ciclicamente in complessi (ESCRT,

endosomal sorting complex required for transport) a livello della membrana

dell’endosoma.

Sono due i meccanismi principali che i virus ad RNA utilizzano per sfuttare i

MVB nelle fasi conclusive del ciclo replicativo: i) il legame diretto delle proteine

strutturali con componenti essenziali per la biogenesi dell’organello, mediato da

corti motivi aminoacidici ricchi in prolina definiti late (L-)domain; ii)

l’ubiquitinazione/de-ubiquitinazione di proteine strutturali (Calistri et al., 2008).

Il coinvolgimento dei MVB nel ciclo replicativo di virus rivestiti di envelope e

dotati di genoma a DNA è ad oggi meno chiaro, forse anche per la maggior

complessità che, in generale, li caratterizza. Dati recenti suggeriscono che anche

virus a DNA, quali gli herpesvirus, potrebbero reclutare le proteine del pathway

dei MVB non solo per facilitare la fase di gemmazione dalla cellula, ma anche

quella di assemblaggio, garantendo la corretta localizzazione intracellulare sia

117

_______________________________________________________________________________

delle proteine dell’envelope sia di quelle del tegumento e di conseguenza, visto il

ruolo fondamentale del tegumento, di quelle capsidiche e dell’envelope (Calistri et

al., 2007; Crump et al, 2007; Lambert et al., 2007; Watanabe et al., 2007 ; Mori et

al., 2007; Tandom et al., 2009).

In particolare, analizzando la sequenza aminoacidica delle proteine del tegumento

e dell’envelope degli herpesvirus sono state identificate sequenze sovrapponibili

alla sequenza consenso dei L-domain dei virus ad RNA. La presenza di tali

sequenze in proteine virali, alcune delle quali essenziali nell’assemblaggio delle

particelle mature, è stata una delle basi di partenza per valutare il coinvolgimento

dei MVB nelle fasi tardive del ciclo replicativo di questi virus. In particolare, in

HCMV sono stati identificati, da noi come da altri gruppi (Fraile-Ramos et al.,

2007) i seguenti motivi: pp150 e UL56, rispettivamante la maggiore proteina del

tegumento essenziale nella maturazione, e una proteina non strutturale coinvolta

nel packaging del DNA virale nel nucleo, contengono la sequenza PTAP (Pro-

Thr-Ala-Pro), che costituisce il sito di binding, come già dimostrato in numerosi

lentivirus dei primati (Garrus et al., 2001; Martin-Serrano et al., 2001), per la

proteina Tsg101. gB e la proteina del tegumento UL48 contengono, invece, il

motivo aminoacidico PPxY (Pro-Pro-x-Tyr), presente in oncoretrovirus

(Göttlinger et al., 1991), filovirus (Strack et al., 2000) e arenavirus, che media il

legame con le proteine cellulari appartenenti alla famiglia Nedd4 delle ubiquitino-

ligasi E3, che, ubiquitinando le proteine target, ne promuovono l’entrata nel

pathway dei MVB.

Nel nostro laboratorio abbiamo recentemente dimostrato che la gB di HSV-1

accumula a livello delle membrane dei MVB e che il corretto traffico

intracellulare della glicoproteina necessita di una corretta biogenesi dei MVB

(Calistri et al., 2007). Significativamente, gB non contiene sequenze

sovrapponibili a quelle di un L-domain, né fino a questo momento sono state

messe in luce sue interazioni con proteine dei complessi ESCRT, ma il segnale

che ne permette l’incorporazione nei MVB è la mono-ubiquitinazione a livello

della coda C-terminale (Calistri et al., 2007).

Partendo da questi risultati, con questo lavoro di tesi abbiamo voluto contribuire

al chiarimento del ruolo dei MVB nel ciclo replicativo degli herpesvirus

focalizzando la nostra attenzione sulla gB di rappresentanti di α-, β- e γ-

118

___________________________________________________________________Discussione

herpesvirus. Il razionale è fornito dal fatto che questa proteina è una delle più

conservate a livello della famiglia Herpesviridae ed, in particolare, altamente

conservati sono i motivi della coda citoplasmatica (YXXΦ, LL ed un cluster

acido), coinvolti in endocitosi e trafficking intracellulare. Ad eccezione della gB

di HSV-1 e di quella di VZV, gli omologhi in tutti gli altri herpesvirus sono

prodotti come precursori, che vengono processati proteoliticamente dalla

endoproteasi furina, a livello del TGN. In questo modo si generano due subunità

che rimangono legate attraverso ponti disolfuro e la gB viene incorporata in

questa forma nell’envelope del virus maturo (Wells et al., 1990). Non si conosce

il significato funzionale del processamento da parte della furina, anche perché

questo evento non sembra essenziale nè per l’inglobamento delle gB nel virione

né per l’infettività virale (Brücher et al., 1990).

La nostra attenzione si è focalizzata, in particolare, su UL55, la gB di HCMV, in

quanto, a differenza della gB di HSV-1, è caratterizzata dalla presenza di una

sequenza PPSY che si sovrappone perfettamente a L-domain di tipo PPxY. I

nostri esperimenti hanno dimostrato che questo corto motivo aminoacidico anche

nel contesto della gB di HCMV, come già dimostrato per altre proteine virali

(Strack et al., 2000), costituisce il sito di interazione con le ubiquitino ligasi E3

della famiglia Nedd4 (Figura 4.4.2). Non solo gB interagisce con queste proteine

virali, ma viene anche da queste ubiquitinata in maniera specifica (Figura 4.4.1).

Mutanti a livello di PPSY (UL55PPSA) non interagiscono più con le ubiquitino

ligasi (Figura 4.4.2), mentre il mutante della proteina parzialmente privo della

coda citoplasmatica (UL55833), ma contenente ancora il motivo aminoacidico,

continua ad interagire (Figura 4.4.3). Questi risultati suggeriscono l’interazione

diretta e funzionalmente rilevante tra una proteina di un virus con genoma a DNA

e una proteina coinvolta nella biogenesi dei MVB. Recentemente, è stato riportato

in lettaratura che anche UL56, una proteina di membrana di tipo II di HSV-2, di

non chiara funzione ma che è stato predetto essere incorporata nell’envelope

virale, interagisce sia in trasfezione sia in infezione con i membri della famiglia

Nedd4, tramite tre motivi PPxY (Ushijima et al., 2008; 2009). Il comportamento

di UL56 è, però, diverso da quello di UL55, poiché la proteina di HSV-2 non è un

substrato di ubiquitinazione da parte delle ubiquitino ligasi. Inoltre, non è stato

chiarito il contributo dell’interazione tra UL56 e le ubiquitino ligasi Nedd4 nel

contesto della replicazione virale, in particolare nelle fasi tardive. Nel nostro caso,

119

_______________________________________________________________________________

invece, è chiaro che UL55 di HCMV viene ubiquitinata dalle ubiquitino ligasi

Nedd4 (Figura 4.4.1). Questa modificazione post-traduzionale è peculiare per gB

non verificandosi nel caso di altre glicoproteine, quali gH (Figura 4.2.2). Inoltre,

essendo osservata sia in cellule infettate (Figura 4.2.3) sia in cellule trasfettate,

può essere considerata una proprietà intrinseca della glicoproteina. Basandoci

anche sui dati relativi alla gB di HSV-1, abbiamo voluto analizzare se

l’ubiquitinazione di UL55 avesse un ruolo nell’indirizzamento della proteina ai

MVB. I nostri risultati mostrano che UL55 colocalizza in cellule trasfettate con il

marcatore dei lisosomi tardivi CD63 (Figura 4.3.1).

Come già accennato, il test per eccellenza per valutare il coinvolgimento dei MVB

in specifici fenomeni, quali l’assemblaggio e la gemmazione virali consiste

nell’utilizzare forme dominanti negative di proteine chiave nella biogenesi di

questo organelli ed in particolare Vps4E228Q, l’ATPasi che media il rilascio dei

componenti ESCRT, dopo la gemmazione delle ILV (Strack et al., 2003). Gli

studi eseguiti nel caso dei virus ad RNA hanno chiarito che l’espressione di

Vps4E228Q inibisce il rilascio di HIV-1 e di altri retrovirus, lasciando le particelle

virali immature legate alla superficie esterna della membrana cellulare (Garrus et

al., 2001; Strack et al., 2003). Analogamente, il nostro gruppo di ricerca e il

lavoro di Crump e colleghi hanno chiarito come anche assemblaggio e

gemmazione di HSV-1 sono significativamente ridotti in presenza di Vps4E228Q

(Calistri et al., 2007; Crump et al., 2007). Più recentemente un risultato simile è

stato osservato anche nel caso di HCMV (Tandom et al., 2009), avvalorando

l’ipotesi del coinvolgimento dei MVB nel ciclo replicativo del virus. In questo

lavoro di tesi abbiamo dimostrato che, in presenza di Vps4E228Q, UL55 accumula a

livello intracellulare, probabilmente in compartimenti membranosi (Figura 4.3.2).

Per la gB di HSV-1, in condizioni analoghe, era stato osservato l’accumulo di

forme immature della proteina non completamente glicosilate (Calistri et al.,

2007). Al contrario, nel caso di UL55 non si riscontra un difetto di maturazione e

il processamento proteolitico mediato dalla furina non risulta compromesso.

Accumulano, infatti, nella stessa misura sia il precursore sia la forma processata

(Figura 4.3.2). Saggi di microscopia confocale hanno mostrato che il blocco dei

MVB comporta la rilocalizzazione della gB di HSV-1 in siti che corrispondono in

parte alla distribuzione della calreticulina, una marker endosomiale (Calistri et al.,

2007). I nostri saggi dimostrano che, nelle stesse condizioni, la gB di HCMV si

120

___________________________________________________________________Discussione

accumula a livello di vescicole intracitoplasmatiche ingrossate positive per EEA-

1, marker degli endosomi precoci (EE) (Figura 4.6.1). Lo stesso fenotipo si

osserva nel caso di UL55 mutante non più in grado di legare le ubiquitino ligasi

della famiglia Nedd4, UL55PPSA (Figura 4.6.1). UL55PPSA continua a colocalizzare

con la γ adaptina (figura non mostrata), coerentemente al fatto che questa forma

matura correttamente a livello del TGN, ma le membrane di questo organello non

risultano modificate dalla sua espressione, quindi l’effetto è specifico per gli EE.

E’ possibile supporre che, sia in presenza di VpsE228Q sia della mutazione di

PPSY, il normale trafficking di UL55 lungo il pathway endocitico fino a

MVB/lisosomi sia compromesso e che la glicoproteina accumuli, pertanto, in

organelli a monte dello stesso pathway come possono essere gli EE. I nostri dati,

nel loro complesso, suggeriscono, quindi la necessità della corretta biogenesi dei

MVB per il corretto trafficking di UL55.

Anche la forma tronca di UL55, UL55833, si accumula in presenza di Vps4E228Q

(figura 4.3.2). In generale, l’analisi dei livelli di UL55833 ci hanno permesso di

osservare un accumulo del precursore, mentre le bande relative alla forma matura

della proteina (~55 KDa) appaiano di intensità significativamente ridotta, rispetto

alla proteina wt (Figura 4.2.1), indicando o un difetto di processamento da parte

della furina o una prematura degradazione della forma matura da parte della

cellula.

La forma tronca della gB di HSV-1 (gB867) è significativamente meno

ubiquitinata della glicoproteina wt, indicando che i residui ubiquitinati sono

contenuti principalmente nella coda citoplasmatica. Inoltre, un mutante virale

contenente la forma deleta di gB determina una drammatica riduzione dei livelli di

progenie virale rilasciata (Calistri et al., 2007). La forma tronca UL55833 presenta

ugualmente un segnale di ubiquitinazione ridotto, ma il dato è inficiato dal fatto

che le forme processate, come detto, sono presenti in quantità molto ridotta

(Figura 4.2.1). Inoltre, il motivo PPSY è mantenuto a livello di questo mutante di

gB. Alcuni lavori riportano che forme tronche di gB a livello della coda ne

compromettono l’endocitosi e ne determinano, pertanto, l’accumulo a livello della

membrana plasmatica (Radsak et al., 1996; Tugizov et al., 1999; Nixdorf et al.,

2001). Più recentemente, però, è stato chiarito che i motivi conservati presenti

della coda sono coinvolti non solo nell’endocitosi ma anche nel trafficking

intracellulare tra endosomi, ERC (endocytic recycling compartment) e lisosomi

121

_______________________________________________________________________________

(Jarvis et al., 2002; Fraile-Ramos et al., 2002 e 2003). gB, infatti, rimane solo

temporaneamente nella membrana cellulare e allo steady state è espressa nella

membrana nucleare e soprattutto a livello del TGN, come confermato anche dai

nostri esperimenti eseguiti utilizzando il marker γ adaptina (Figura 4.3.1). Questo

spiegherebbe perché, sebbene un certo livello di glicoproteine endocitate sia

incorporata nei virioni, il recupero dalla membrana, come è stato dimostrato per

UL55 e UL27, ma anche per la gE del PRV, non sia necessario per la formazione

dei virioni maturi (Jarvis et al., 2002). Le nostre immagini di IF non mostrano

differenze di localizzazione per UL55833 rispetto alla forma wt in cellule trasfettate

(Figura 4.5.1). Tuttavia nel contesto dell’infezione virale gB833 mostra un ritardo

di reclutamento agli AC (Figura 4.8.1), in modo simile a quanto visto da

Krzyzaniak e colleghi nel caso di mutanti di gM di HCMV parzialmente deleti

nella coda citoplasmatica (Krzyzaniak et al., 2007).

Come nelle cellule trasfettate, invece, anche nel contesto dell’infezione virale

gBPPSA accumula a livello di vescicole allargate (Figura 4.8.1)

Il ruolo importante giocato dall’ubiquitinazione nel corretto trafficking di gB, che

le consente di entrare in contatto con i componenti dei MVB, è avvalorato anche

dai risultati da noi ottenuti impiegando i costrutti che esprimono AMSH e UBPY,

due enzimi a funzione de-ubiquitinasica. Le proteine ubiquitinate destinate

all’incorporazione nei MVB subiscono prima della degradazione uno step di

deubiquitinazione. Tra le deubiquitinasi che sembrano avere un ruolo importante

nell’ambito del pathway dei MVB vi sono per l’appunto AMSH e UBPY (Clague

and Urbe S., 2006), anche se in letteratura il loro ruolo rimane controverso. In

alcuni lavori recenti è stato ipotizzato un modello in cui le due deubiquitinasi

sarebbero coinvolte in due differenti eventi e con due ruoli diversi lungo il

pathway dei MVB: AMSH sarebbe coinvolta nella deubiquitinazione delle

proteine destinate al reciclo, mentre UBPY deubiquitinerebbe le proteine cargo

prima della loro incorporazione nei MVB (Welchman et al., 2005; Clague and

Urbe S., 2006; McCullough et al., 2008). In questo lavoro abbiamo dimostrato che

in presenza di AMSH e UBPY il livello di ubiquitinazione di UL55 diminuisce,

mentre la forma dominante negativa AMSHD348A e il mutante UBPYC786S ne

aumentano l’ubiquitinazione. Inoltre AMSH, e in misura ancora più marcata

AMSHD348A, causano l’accumulo intracellulare di UL55, mentre la

sovraespressione di UBPY ne determina la degradazione, coerentemente al ruolo

122

___________________________________________________________________Discussione

proposto per questa deubiquitinasi di rimuovere l’ubiquitina dalle proteine target

prima della loro entrata e degradazione attraverso le ILV. Al contrario in presenza

di UBPYC786S vi è un rescue della glicoproteina (Figura 4.9.1). Questi risultati

sono, pertanto, coerenti con il modello prevalente in letteratura relativo alla

funzione delle due proteine e ribadiscono ancora una volta che l’ubiquitinazione

di gB mediata dalle ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 indirizza la proteina

virale verso i MVB.

I nostri dati, quindi, supportano l’ipotesi che effettivamente vi sia un legame tra

HCMV e i MVB durante il ciclo replicativo e che gB possa essere uno degli anelli

di congiunzione, come nel caso di HSV-1. Anche in questo caso l’ubiquitinazione

della proteina sarebbe uno dei meccanismi attraverso i quali gB viene direzionata

ai MVB. A questo punto è possibile ipotizzare, vista anche la localizzazione di gB

durante il ciclo replicativo virale, ovvero nei siti di assemblaggio noti come

assembly compartment (AC), già dimostrata in letteratura e da noi confermata

(Sanchez et al., 2000), che diversi componenti dei MVB siano reclutati a questo

livello, proprio grazie ad interazioni con proteine virali. Questa conclusione è

supportata dal lavoro di altri gruppi di ricerca ed in particolare da Fraile-Ramos e

colleghi che hanno dimostrato, attraverso immunogold-labelling e microscopia

elettronica che CD63, un tipico marker dei MVB, è incorporato nell’envelope di

HCMV (Fraile-Ramos et al., 2003), dato confermato anche più recentemente

(Capeda et al., 2009). In quest’ultimo lavoro viene anche dimostrato che il livello

del trascritto e della proteina di CD63 diminuiscono durante l’infezione virale e

che i virioni positivi per CD63 sono infettivi. Questi dati nel complesso

suggeriscono che componenti endosomiali e tra questi le membrane dei MVB si

localizzano nei siti intracellulari in cui il virus si assembla durante l’infezione

(AC). Più significativamente lavori recenti stanno cercando di capire quali

proteine dei complessi ESCRT siano reclutate a questo livello e se siano coinvolte

con ruoli strutturali. In questo contesto, Tandom e colleghi hanno riportato che sia

le forme wt sia quelle dominanti negative di CHMP1 e di Vps4, entrambe proteine

coinvolte nella biogenesi dei MVB, localizzano all’AC durante l’infezione e

colocalizzano con la glicoproteina di HCMV gM. I nostri dati e quelli di altri

gruppi ancora in corso di pubblicazione, confermano il reclutamento di Vps4 ma

non quello della sua forma dominante negativa (Figura 4.3.4). Inoltre, i risultati di

123

_______________________________________________________________________________

Tandom e colleghi sembrano suggerire che il blocco dei MVB, ottenuto tramite

l’espressione della forma dominante negativa Vps4E228Q, non comprometta la

formazione dell’AC. Al contrario, nei nostri esperimenti in queste condizioni gB

rimane dispersa nel citoplasma delle cellule infettate (Figura 4.3.4). Stiamo

attualmente valutando se anche le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4

localizzino all’AC durante l’infezione, magari proprio grazie all’interazione con

gB. Significativamente, invece, i nostri risultati dimostrano chiaramente che

Tsg101 è una delle proteine ESCRT reclutata all’AC (Figure 4.11.2 e 4.11.3).

Abbiamo anche dimostrato che Tsg101 interagisce fisicamente con gB. Tuttavia,

se il suo reclutamento dipenda da questa interazione è tuttora in corso di

valutazione. L’analisi della sequenza aminoacidica di UL55 rivela l’assenza di un

motivo amminoacidico di tipo P(T/S)AP, che tradizionalmente si ritrova nelle

proteine virali e in alcune proteine cellulari che interagiscono con Tsg101.

Abbiamo anche potuto escludere che questa interazione sia mediata indirettamente

dalle ubiquitino ligasi Nedd4, che oltre gB legano anche Tsg101 (Figura 4.10.4).

Inoltre, nessuno degli adattatori molecolari che interagiscono con Tsg101 e che

reclutano cargo ubiquitinati ai MVB da noi testato (Hrs, GGA1 o Tom)

interagisce con UL55 (Figura 4.10.1). Attraverso specifiche mutazioni puntiformi

(N45A e M95A) a livello del dominio ubiquitin E2 variant (UEV) abbiamo anche

valutato la possibilità che il legame sia mediato dall’ubiquitina legata a gB o da

analoghi del motivo P(T/S)AP. I risultati ottenuti sembrerebbero indicare che né

l’ubiquitina né motivi amminoacidici reminiscenti del P(T/S)AP siano coinvolti

nel legame (Figura 4.10.5). Nonostante questo, però, bisogna, sottolineare che i

due residui del UEV da noi mutati sono quelli a più alta affinità ma non gli unici

coinvolti nell’interazione rispettivamente con l’ubiquitina e con il P(T/S)AP

(Pornillos et al., 2003). Inoltre, non possiamo escludere che il legame possa

dipendere da una sequenza ricca in prolina in grado di sostituire il motivo

P(T/S)AP. In questo contesto, la sequenza aminoacidica di UL55, infatti, contiene

entro gli ultimi 73 aminoacidi che abbiamo deleto e responsabili dell’interazione

con Tsg101, un sito ricco in prolina (PPY, residui 837-839), che potrebbe

rappresentare un L-domain non convenzionale, capace di svolgere una funzione

analoga al L-domain canonico P(T/S)AP per il reclutamento di Tsg101. Per

verificarlo abbiamo mutagenizzato questo sito in AAY e AAA e sono attualmente

in corso esperimenti di co-IP con questi due mutanti. In alternativa a questo, altri

124

___________________________________________________________________Discussione

residui potrebbero costituire un nuovo dominio di interazione non ancora

identificato. E’ interessante notare, in questo contesto, che UL55833 non

interagisce più con Tsg101 (Figura 4.10.3), ma l’ubiquitinazione di questo

mutante non è totalmente compromessa e UL55833 continua ad interagire con le

ubiquitino ligasi Nedd4-like, la sua localizzazione in trasfezione non appare

visibilmente diversa da quella della glicoproteina wt e rimane sensibile alla

presenza di Vps4E228Q. Questi risultati farebbe pensare che la parziale delezione

della coda non comprometta l’entrata della forma tronca di gB nel pathway dei

MVB. Questa analisi è coerente col nostro risultato che mostra che il mutante

gBPPSA continua ad interagire con Tsg101 (Figura 4.10.4 C) ed è, inoltre,

supportata dall’osservazione recente, riportata nel lavoro di Tandom e colleghi,

che Tsg101 e le ubiquitino ligasi della famiglia Nedd4 agiscano in modo

indipendente e con un meccanismo compensatorio nel mediare l’ingresso di

proteine virali, quali gB, nel pathway dei MVB. Nel lavoro di Tandom e

collaboratori si dimostra che nè il dominante negativo di Tsg101 né il mutante a

livello del PTAP di pp150 (pp150EFAP) influenzano il livello di progenie rilasciata,

suggerendo che HCMV sfrutti il macchinario ESCRT in modo Tsg101

indipendente. Un simile risultato è stato ottenuto utilizzando le forme dominanti

negative di AIP1 e di WWP1. Nel lavoro si dimostra che la distruzione degli

ESCRT coinvolti nel reclutamento delle proteine cargo (attraverso i dominanti

negativi di Tsg101, AIP1 o WWP1) non ha effetto sulla maturazione virale,

mentre la distruzione di proteine ESCRT coinvolte in assemblaggio (CHMP1) o

recycling dei complessi (Vps4) mostrano un marcato effetto. Nel complesso i dati

di letteratura (Hurley and X. Ren., 2009) e i nostri indicano che mentre le proteine

che intervengono precocemente nel pathway di biogenesi dei MVB sembrano

lavorare in parallelo, compensandosi l’una con l’altra, quelle a valle (come Vps4)

lavorano in serie.

E’ chiaro che la rilevanza biologica delle interazioni tra UL55 e ubiquitino

ligasi/Tsg101 potrà essere avvalorata solo da esperimenti condotti in cellule

infettate. A questo scopo sono stati ottenuti attraverso la tecnologia BAC HCMV

ricombinanti caratterizzati dalle mutazioni già descritte a livello di gB, o privi

delle sequenze codificanti la glicoproteina virale. Con questi virus ci proponiamo

di analizzare l’effetto dell’interruzione delle interazioni nel contesto del ciclo

replicativo virale.

125

_______________________________________________________________________________

Dobbiamo dire, tuttavia, che abbiamo già ottenuto dati in infezione a supporto

dell’effettivo ruolo di UL55 nel mediare l’ingresso di HCMV nel pathway dei

MVB. In particolare sono significativi i risultati che dimostrano la localizzazione

agli AC di Tsg101 e la perturbazione dei siti di assemblaggio virale in presenza

del blocco dei MVB o quando UL55 non sia più in grado di interagire con le

ubiquitino ligasi Nedd4. Recentemente Moorman e colleghi hanno mostrato che la

proteina del tegumento pp28 colocalizza con l’ubiquitina e con Hrs e Tsg101 a

livello dell’AC (Moorman et al., 2009). Gli autori approfondiscono l’analisi della

formazione dell’AC, in modo coerente al modello di Pellet (descitto nel paragrafo

1.4 dell’introduzione). Prendendo come riferimento tre proteine di HCMV (pp28,

pp150 e gB), il lavoro dimostra che a stadi precoci di infezione le tre proteine

localizzano distintamente, utilizzando nel trafficking intracellulare vescicole di

natura diversa, mentre man mano che l’infezione procede i loro segnali via via si

sovrappongono fino a convergere nell’AC. Pertanto, questo compartimento

nascerebbe dal contributo di almeno tre o forse più vie di trafficking distinte, che

utilizzerebbero sistemi diversi di trasporto vescicolare quali clatrina o proteine

ESCRT, e gB potrebbe rientrare in quest’ultimo.

In conclusione, l’analisi dei meccanismi molecolari che permettono a HCMV di

sfruttare il pathway dei MVB e la caratterizzazione di UL55 ha portato fino a

questo momento all’ottenimento dei seguenti risultati:

UL55 è ubiquitinata in cellule trasfettate ed infettate

UL55 colocalizza con le membrane dei MVB

il corretto trafficking di UL55 richiede la corretta biogenesi dei MVB

forme funzionali delle ubiquitino ligasi E3 della famiglia Nedd4 sono

coinvolte nell’ubiquitinazione e nella degradazione di UL55 attraverso la

via MVB/lisosomi ed interagiscono con la glicoproteina attraverso il suo

dominio PPSY.

UL55PPSA accumula a livello di endosomi precoci aberranti

le deubiquitinasi AMSH e UBPY rimuovono l’ubiquitina da UL55 per

permetterne, rispettivamante, reciclo o degradazione

UL55wt, ma non la forma parzialmente deleta a livello della coda

citoplasmatica UL55833, interagisce con Tsg101

la proteina Tsg101 è reclutata al AC.

126

___________________________________________________________________Discussione

Attualmente stiamo valutando la rilevanza biologica e funzionale delle interazioni

di gB con le ubiquitino ligasi Nedd4 e con Tsg101 mediante i due virus

ricombinanti vUL55PPSA e vUL55833, ottenuti attraverso la tecnologia del BAC.

Verranno, pertanto, analizzati, mediante titolazione su coltura cellulare e nuove

tecniche di microscopia elettronica, gli effetti di queste mutazioni su

assemblaggio e gemmazione virali. Abbiamo ottenuto, inoltre, anche un virus

ricombinante privo di gB (v∆UL55), che stiamo utilizzando in saggi di

complementazione per analizzare gli effetti della totale assenza di UL55.

Saranno, inoltre, necessarie ulteriori evidenze sperimentali che chiariscano il ruolo

dei MVB nella formazione dell’AC e quali altri proteine ESCRT ne siano

reclutate. Nel caso in cui l’AC si formi anche senza una biogenesi dei MVB

funzionale, rimane comunque da valutare se vi siano delle alterazioni nella sua

formazione e nell’accumulo di proteine del tegumento e dell’envelope. Inoltre,

rimane da chiarire in modo più completo quali siano le modificazioni indotte dal

blocco dei MVB sulla gemmazione virale, per esempio analizzando mediante la

microscopia elettronica se il virus rilasciato acquisisca o meno l’envelope o se e in

che misura sia infettivo.

127

____________________________________________________________________Biblografia

6 BIBLIOGRAFIA

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RINGRAZIAMENTI

Questo lavoro è veramente dedicato a tutte le persone che in questi tre

anni…e molte anche prima…mi sono state vicine e mi hanno aiutata. Senza

tutti voi non ci sarebbe stato tutto questo… Alcune lo hanno letteralmente

visto formarsi insieme a me, passo dopo passo, e tra queste soprattutto Enrico.

Grazie di cuore!

Sono stati tre anni molto intensi grazie ai quali ho iniziato a capire cosa

significa fare scienza, ma soprattutto ho capito quanto mi piace farla!

Per queste ragioni desidero ringraziare il Prof. Palù, per avermi dato la

possibilità di svolgere il mio dottorato presso il Dipartimento di Istologia,

Microbiologia e Biotecnologie Mediche.

Il mio grazie va soprattutto alla Dott.ssa Calistri, che mi ha seguito

costantemente nel mio percorso e che ha creduto in me prima ancora che

cominciassi a farlo io! Grazie per ogni parola e ogni insegnamento.

Grazie alla Prof.ssa Parolin, per il suo sostegno e i suoi incoraggiamenti.

Un ringraziamento va a tutte le persone che ho conosciuto nel

Dipartimento…alcune le desidero ringraziare per il loro aiuto lavorativo, altre

per il loro sostegno morale, altre per le risate e le chiacchere, altre…per tante

altre cose.

Inoltre vorrei ringraziare il Prof. Mertens e il Dott. von Einem per avermi dato

la preziosa possibilità di proseguire il mio progetto nel loro laboratorio e tutte

le persone che ho incontrato e che mi sono state vicine nella mia esperienza a

Ulm.

Un grazie particolare va ai miei genitori., alle nonne e a tutti i parenti per

avermi sempre sostenuto ed incoraggiato e a tutti gli amici vecchi e nuovi!

Grazie di cuore a tutti!