In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici Si usa l’integrale spettrale
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• In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici • Si usa l’integrale spettrale • L’integrale va calcolato in l! l l l d c c d d 2 l l d F 0 ) (
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In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici Si usa l’integrale spettrale L’integrale va calcolato in l !. Osservabili: spettro di emissione. ecc. fissa. em. variabile. F in funzione di em. Rilassamento del solvente. S 1. S 1 ’. E. Em. Ass. h n. h n. - PowerPoint PPT Presentation
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• In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici
• Si usa l’integrale spettrale• L’integrale va calcolato in l!
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dF
0
)(
Osservabili: spettro di emissione• ecc. fissa.• em. variabile.• F in funzione di em..
Rilassamento del solvente
Ehn hn
S0
S1S1’
S0’
Ass.Em.
H2OEtOHDMFc-Hex
6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene(PRODAN)
d = 2.8 Debye
d = 10 Debye
Rilassamento del solvente
H, hexane; CH, cyclohexane; T, toluene; EA, ethyl acetate; Bu, n-butanol.
4-dimetilammino-4'-nitrostilbene (DNS)
Rilassamento del solvente
Denaturazione proteica
The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. Biophys. J. 1994 66: 482.
Partizione acqua-membrana
Orioni et al., BBA 2009.
350 400
Flu
ores
cenc
e (
a.u
)
Wavelength (nm)
Lipidconcentration
360
365
0 100 200A
vera
ge
Wa
vele
ngth
(nm
)Lipid (M)
KP
Transizioni di fase in membrana
Transizioni di fase in membrana
Biophys. J. 2000, 78: 290
400 450 500 550
DMPC vesicles
6 C
24
31
36
52
60
Flu
ore
sce
nce
(a
.u.)
(nm)Bocchinfuso et al., J. Pept. Sci., 2009
-0.6
-0.3
0
0.3
0.6
0.9
0 20 40 60 80
GP
=[F
(440
nm)-
F(4
90nm
)]/[F
(440
nm)+
F(4
90n
m)]
T, °C
Red-edge excitation
Eccezione alla regola di Kasha!
Red-edge excitation
Segnale di fondo:diffusione elastica ed anelastica della luce
Perché vediamo la luce del laser anche osservando a 90°?
Scattering Rayleigh
È una diffusione elastica. L’energia e la lunghezza d’onda della radiazione vengono conservate.
4
1
I
Visione quantistica
•Il dipolo indotto oscilla alla stessa frequenza del campo applicato.
•Un dipolo oscillante emette radiazione.•La molecola emette radiazione della stessa frequenza di quella incidente.
Visione classica
Eμ
• Normalmente la diffusione elastica non crea problemi perché è alla lunghezza d’onda di eccitazione (mentre la fluorescenza è a lunghezze d’onda maggiori).
• E’ dovuta essenzialmente al solvente (Csolvente>>Csoluto). Si può sottrarre misurando uno spettro del solo solvente.
300 350 400 450 500
Inte
nsità
(cp
s)
(nm)
300 350 400 450 500
Inte
nsità
(cp
s)
(nm)
Diffusione Raman (anelastica)
Stokes ed anti-Stokes
A T ambiente normalmente la linea anti-Stokes non si vede.
Visione classica
Se la molecola vibra, con frequenza wm, la sua polarizzabilità cambierà con la stessa frequenza.
Il dipolo oscillante emetterà a wp, wp-wm,, wp+wm.
• L’energia persa dipende dai livelli vibrazionali della molecola coinvolta.
hc
EV cost.11
0
380 390 400 410
MethanolWater
Inte
nsità
(u.
a.)
(nm)
ecc. 350 nm
• La differenza in energia (non l) tra luce incidente e diffusa è costante.
300 350 400 450 500
ecc. 350 nmecc. 400 nm
Inte
nsità
(u.
a.)
(nm)
hc
EV cost.11
0
Raman e fluorescenza• Come la fluorescenza è a lunghezze d’onda maggiori dell’eccitazione
• A differenza della fluorescenza si sposta al variare della lunghezza d’onda di eccitazione.
• Può essere spostata a lunghezze d’onda diverse da quelle di emissione cambiando lunghezza d’onda di eccitazione.
• È dovuta essenzialmente al solvente e può essere sottratta.
Osservabili: spettro di eccitazione• em. fissa.• ecc. variabile.• F in funzione di ecc..
Se:unico fluoroforo
F indipendente da ecc.
(unico stato eccitato).A<<1
Allora F(ecc.) A(ecc.)
•Altrimenti: separazione dei diversi cromofori
exc=variable, em= fixed
exc=510 nm
exc=480 nm
em=525 nm
em=540 nm
