• In realtà gli spettri di standard e campione non sono identici

• Si usa l’integrale spettrale• L’integrale va calcolato in l!

dcc

dd2

dF

0

)(

Osservabili: spettro di emissione• ecc. fissa.• em. variabile.• F in funzione di em..

Rilassamento del solvente

Ehn hn

S0

S1S1’

S0’

Ass.Em.

H2OEtOHDMFc-Hex

6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene(PRODAN)

d = 2.8 Debye

d = 10 Debye

Rilassamento del solvente

H, hexane; CH, cyclohexane; T, toluene; EA, ethyl acetate; Bu, n-butanol.

4-dimetilammino-4'-nitrostilbene (DNS)

Rilassamento del solvente

Denaturazione proteica

The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. Biophys. J. 1994 66: 482.

Partizione acqua-membrana

Orioni et al., BBA 2009.

350 400

Flu

ores

cenc

e (

a.u

)

Wavelength (nm)

Lipidconcentration

360

365

0 100 200A

vera

ge

Wa

vele

ngth

(nm

)Lipid (M)

KP

Transizioni di fase in membrana

Transizioni di fase in membrana

Biophys. J. 2000, 78: 290

400 450 500 550

DMPC vesicles

6 C

24

31

36

52

60

Flu

ore

sce

nce

(a

.u.)

(nm)Bocchinfuso et al., J. Pept. Sci., 2009

-0.6

-0.3

0

0.3

0.6

0.9

0 20 40 60 80

GP

=[F

(440

nm)-

F(4

90nm

)]/[F

(440

nm)+

F(4

90n

m)]

T, °C

Red-edge excitation

Eccezione alla regola di Kasha!

Red-edge excitation

Segnale di fondo:diffusione elastica ed anelastica della luce

Perché vediamo la luce del laser anche osservando a 90°?

Scattering Rayleigh

È una diffusione elastica. L’energia e la lunghezza d’onda della radiazione vengono conservate.

4

1

I

Visione quantistica

•Il dipolo indotto oscilla alla stessa frequenza del campo applicato.

•Un dipolo oscillante emette radiazione.•La molecola emette radiazione della stessa frequenza di quella incidente.

Visione classica

Eμ

• Normalmente la diffusione elastica non crea problemi perché è alla lunghezza d’onda di eccitazione (mentre la fluorescenza è a lunghezze d’onda maggiori).

• E’ dovuta essenzialmente al solvente (Csolvente>>Csoluto). Si può sottrarre misurando uno spettro del solo solvente.

300 350 400 450 500

Inte

nsità

(cp

s)

(nm)

300 350 400 450 500

Inte

nsità

(cp

s)

(nm)

Diffusione Raman (anelastica)

Stokes ed anti-Stokes

A T ambiente normalmente la linea anti-Stokes non si vede.

Visione classica

Se la molecola vibra, con frequenza wm, la sua polarizzabilità cambierà con la stessa frequenza.

Il dipolo oscillante emetterà a wp, wp-wm,, wp+wm.

• L’energia persa dipende dai livelli vibrazionali della molecola coinvolta.

hc

EV cost.11

0

380 390 400 410

MethanolWater

Inte

nsità

(u.

a.)

(nm)

ecc. 350 nm

• La differenza in energia (non l) tra luce incidente e diffusa è costante.

300 350 400 450 500

ecc. 350 nmecc. 400 nm

Inte

nsità

(u.

a.)

(nm)

hc

EV cost.11

0

Raman e fluorescenza• Come la fluorescenza è a lunghezze d’onda maggiori dell’eccitazione

• A differenza della fluorescenza si sposta al variare della lunghezza d’onda di eccitazione.

• Può essere spostata a lunghezze d’onda diverse da quelle di emissione cambiando lunghezza d’onda di eccitazione.

• È dovuta essenzialmente al solvente e può essere sottratta.

Osservabili: spettro di eccitazione• em. fissa.• ecc. variabile.• F in funzione di ecc..

Se:unico fluoroforo

F indipendente da ecc.

(unico stato eccitato).A<<1

Allora F(ecc.) A(ecc.)

•Altrimenti: separazione dei diversi cromofori

exc=variable, em= fixed

exc=510 nm

exc=480 nm

em=525 nm

em=540 nm