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Importanza dello studio del modelloanimale con Glicogenosi di Tipo IIIMichela Ripolone, Raffaella Violano, Serena Pagliarani,Maurizio Moggio

Convegno AIG 2015 – 20/21/22 Novembre - Rimini

Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015

Glicogenosi


Glicogenosi di tipo III-GSDIII

La GSDIII è una rara malattia del metabolismo che causa un accumulo di glicogeno

s0prattutto nel fegato, nel muscolo scheletrico e nel cuore.

I pazienti affetti da GSDIII presentano epatomegalia, ipoglicemia, iperlipidemia e

ritardo della crescita. I pts adulti mostrano inoltre un progressivo coinvolgimento

muscolare.

La cardiomiopatia sintomatica non è comune ma la maggior parte dei pazienti

mostra un’ipertrofia ventricolare sinistra.

La gravità clinica nei pazienti GSDIII è molto variabile.


Enzima Deramificante GDE

L'enzima deramificante, insieme con la glicogeno fosforilasi, degrada il

glicogeno in molecole di glucosio, rendendolo così disponibile per le

necessità energetiche del metabolismo cellulare.


Mutazioni del gene AGL nella Popolazione Italiana

ATG TAG

3513 14 15 26 27 31 32 33 34

c.100G>Tc.112A>Tc.276delG

c.293+2T>A c.664+3A>G

c.442delA

c.672insTc.700T>Cc.753_756delGACA

c.757G>C

c.853C>T

c.1571G>Ac.1589G>C

c.1264A>Tc.1283G>A

c. 2023C>Tc. 2147delG

c.2590C>T

c.2681+1G>A

c.2728C>T

c. 2929C>T

c.3258_3259AG>CC

c.3355G>Cc.3358G>C

c.3464G>Ac.3512_3549dup+3512_3519del

c.3362+1G>C

c.3652C>T

c.3912insA

c.3980G>Ac.3963delG

c.4193G>A c.4324insA

31

Glycogen

binding

domainGlucosidase

domain

Transferase

domain

TG PAS

Esame Istologico di muscolo scheletrico di un paziente affetto da GSDIII

40X


Esame Ultrastrutturale di muscolo scheletrico di un paziente affetto da GSDIII

12000X 7000X



Glicogenosi in animali domestici (cani e gatti)

Brooks & Koeberl J Inherit Metab Dis 2014

Le glicogenosi che colpiscono gli animali dacompagnia sono state ben caratterizzate, e aiutanonella comprensione dei meccanismi patologici dellemalattie e lo sviluppo di terapie mirate alla loro cura

Modelli Animali nella Ricerca Scientifica

Sono utili perché:

sono biologicamente simili agli uomini

possono interagire e reagire a determinati stimoli

riproducendo quello che succede nell’uomo

aiutano nella comprensione dei meccanismi patologici

di molte malattie e nello sviluppo di terapie.



Modelli Animali di Glicogenosi


Vettore di Clonaggio per la generazione di un topoAgl knock out


Topo KO di 18 mesi


Analisi Western blot

+/+ +/− −/−

Muscle 216.25±36.40 134.23±13.51 2.30±1.25

Liver 37.23±1.45 23.37±6.34 5.58±1.65

GDE activity

pmole glucose/min/mg protein

Attività Enzimatica

Muscolo Scheletrico

Cuore Fegato Cervello

-175kDa-175kDa

Uomo WT HET KO Uomo WT HET KO WT HET KOWT HET KO


Gli animali KO sono vitali e non differiscono in dimensioni e peso dailoro fratelli WT ed eterozigoti sia alla nascita sia durante la crescita

Wild Type -

Heterozygote -

Knockout -

Weight

0

5

10

15

20

25

30

35

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

Days

Weig

ht

(g)

KO mice

WT mice

Hete mice

Età: 4 giorni


Kaplan-Meier survival plot

Survival Plot (PL estimates)

0 200 400 600 800

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Survivor

Times

WT

ETE

KO

N = 10 per ciascun genotipo

KO

+/++/-

Valutazione funzionale:hind print test


KOWT

I topi KO, a tutte le età, mostrano difettidell’andatura dovutiall’estroflessione dellezampe.

3 mo

Valutazione funzionale: treadmill


0

50

100

150

200

250

300

350

400

+/+ −/−

Dis

tan

ce (

m) *

Run test

Long walk

30cm/s

5 min

15cm/s

350 m

0

50

100

150

200

250

300

350

2 mo 3 mo

Seco

nd

s (

s)

9 mo

Valutazione funzionale: Rotarod


0

50

100

150

200

250

300

350

+/+ −/−

Late

ncy

to fa

ll (s

)

*

9 mo


Glicemia

*** P<0.0001

* P<0.05

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

+/+ +/− −/−

Glu

cose

(m

g/d

l)

Basal glycemia

16 h fasting

*

***

WT HETE KO


Analisi biochimiche

AST

0

100

200

300

400

500

600

700

3 mo 12 mo

U/L

ALT

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

3 mo 12 mo

U/L

ALP

0

20

40

60

80

100

120

3 mo 12 mo

U/L −/−

+/+

*

***** ***

AST ALT ALP

Cholesterol

0

20

40

60

80

100

3 mo 12 mo

mg/

dl

Triglycerides

0

20

40

60

80

100

120

140

3 mo 12 mo

mg/

dl

CK

0

50

100

150

200

250

300

350

3 mo 12 mo

U/L −/−

+/+

****

Cholesterol Triglycerides CK*** P<0,005

* P<0.05


Il fegato del topo KO rispetto al WT è di dimensionimaggiori e di colore rosso scuro

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

3 mo 12 mo

Liv

er/b

ody

wei

ght

(%)

−/−

+/+

***

***

Non vi sono segni di cirrosi o adenomi

KO WT

Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III- Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015

Contenuto in glicogeno

Colorazione PAS

4 mo 8 mo 12 mo 18 mo

F: Colorazione di MassonA,B,C,D,E: Colorazione Tricromica di Gomori

WT KO 4mo KO 8mo

KO 12mo KO 18mo KO 18mo

Fegato: epatociti gonfi e allargati

Scale bar: 25 μmImportanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015

Muscolo scheletrico: progressiva vacuolizzazione

Scale bar: 20 μmImportanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015

KO 4m

ANALISI ULTRASTRUTTURALE: muscolo scheletrico

12000x

12000x

7000x

7000x

WT 12m

KO 12m

HT 12m


Contenuto in glicogeno

N=5 per ciascun gruppoP <0.0005

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Skeletal muscle Heart Liver Brain

Gly

cog

en g

/10

0g

tis

sue

+/+

+/-

-/-

Cuore Fegato CervelloMuscolo Scheletrico

Lingua: importante vacuolizzazione


F

I

H

M

DCBA

E G

L

O

N

RQP

Cervello CervellettoW

T−

/− 8

m−

/− 1

2 m

−/−

18

mEE EEPAS PAS

Nervo sciatico: morfologia normale

KO 12mo

WT

KO 12mo

KO 18mo

Colorazione Blu di Toluidina Scale bar: 12.5 μmImportanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III - Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015

Conclusioni


• Abbiamo studiato un topo KO per il gene AGL. L’enzima deramificanteGDE e la sua attività sono completamente assenti in tutti i tessuti

• I topi KO mostrano un’alterata funzione muscolare fin dalla giovane età

• Nel topo KO le transaminasi epatiche e le CK sono aumentate

• Le analisi istologiche hanno rivelato alterazioni nel muscolo scheletrico chepeggiorano progressivamente con l’età.

• I topi KO presentano epatomegalia

• Il fegato, il muscolo scheletrico e il cuore mostrano un aumento del

contenuto in glicogeno

Conclusioni


Il nostro modello murino AGL KO riproduceperfettamente la GSDIII umana

UOMO TOPO KO

Prospettive future


Dieta altamente proteica

Terapia genica con Virus Adeno Associati

NT

DIETAHP

VASTO TIBIALESOLEO-GASTROCNEMIO

EE 20X

MUSCOLO Valutazioni PRE- e POST-DIETA HIGH PROTEIN


KO NON TRATTATOFEGATO

ValutazioniPRE- e POST-DIETA HIGH PROTEIN

KO 3 MESIKO 2 MESI KO 4 MESI

EE 40X

WT

DIETA HIGH PROTEIN



Si ringraziano

l’ Associazione Italiana

Glicogenosi,

i pazienti e le loro famiglie

per il supporto alla realizzazione

di questo progetto.

Importanza dello studio del modello animale con Glicogenosi di Tipo III- Dr. Maurizio Moggio - Rimini 2015

UO Neurologia

Responsabile: Bresolin N, MD

Genetica e Biochimica

Responsabile: Comi GP, MD

Pagliarani S, PhDLucchiari S, PhDUlzi G, PhDBordoni A, BS Fortunato F, BS

Sciacco M, MD, PhDColombo I, MDPeverelli L, MDVilla L, MD

Fagiolari G, BsCiscato P, BSNapoli L, PhDRipolone M, PhDViolano R, BsTironi R, Bs

Valentini P, Dr. Amministrativa

UOD Malattie Neuromuscolari e Rare

Responsabile: Moggio M, MD

Fondazione IRCCS Ca’ GrandaOspedale Maggiore Policlinico-Università degli Studi di Milano

Cuore: nonostante il marcato aumento di glicogeno non si nota ipertrofia o alterazione delle fibre


Colorazione Ematossilina-Eosina

WT

KO

0.00%

0.10%

0.20%

0.30%

0.40%

0.50%

0.60%

3 mo 12 mo

Hea

rt/b

od

y w

eigh

t (%

)

−/−

+/+

Scale bar: 25 μm

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