Impiego di metodiche computazionalinella progettazione di farmaci

Alessandro Pedretti

Università degli Studi di MilanoFacoltà di Farmacia

Drug discovery

Il termine di drug discovery viene utilizzato per indicare tutti quei processi che portano all’identificazione o allo sviluppo di un nuovo farmaco.

Identificazione di un bersaglio (target) a cui è correlata una certa patologia su cui intervenire con un farmaco.

Identificazione di una molecola attiva (hit compound) mediante:

screening;

approccio razionale;

fortuna (serendipty).

Studio della molecola attiva al fine di realizzare derivati con un più definito profilo di attività, metabolismo e tossicità (lead compounds).

Studi pre-clinici (animali).

Studi clinici (uomo).

Interazione farmaco-recettore

Perché un farmaco possa esplicare la propria azione deve interagire con un bersaglio chiamato recettore.

Farmaco RecettoreComplesso

farmaco-recettore

Effettobiologico

Tipologie di recettori:

Enzimi Inibizione•Proteine

Recettori per mediatori chimici AttivazioneInibizione

•Acidi nucleici

Affinità Potenza

Forze coinvolte nell’interazione

Forze d’interazione Lipofilia

Interazioni elettrostatiche

Forze ioniche

legami ionici interazioni di trasferimento di carica interazioni interazioni ione - dipolo

(permanente o indotto) legami di idrogeno rinforzati

legami di idrogeno normali

forze di orientazione (dipolo permanente - dipolo permanente)

forze di induzione (dipolo permanente - dipolo indotto)

Polarità

Forze di

Van der

Waals Forze di dispersione

(dipolo indotto - dipolo indotto)

Interazioni idrofobiche

Idrofobicità

Progettazione razionale di molecole bioattive

Può avvenire secondo:

• Approccio indiretto:- la struttura del recettore è ignota;- utilizzo di metodiche QSAR (relazioni struttura-attività quantitative).

• Approccio diretto:- la struttura del recettore è nota;- utilizzo di metodiche di docking molecolare.

L’obiettivo di entrambi gli approcci è quello di ottenere un modello chiamato farmacoforo sulla base del quale verranno progettate le nuove molecole.

Il farmacoforo

E’ l’insieme delle sottostrutture della molecola di un farmaco necessarie all’interazione col recettore.

Gruppo cariconegativamente

Gruppo accettoredi legami d'idrogeno

Spaziatore

Gruppo idrofobico

Tasca recettoriale Farmaco

QSAR - Relazioni struttura-attività quantitative

E’ il processo col quale le proprietà chimico-fisiche sono messe in relazione con l’attività biologica o la reattività chimica.

Attività = f(proprietà chimico-fisiche)

Assunzione fondamentale:molecole con proprietà chimico-fisiche simili fra loro avranno anche attività simile.

Identificazione delle proprietà (descrittori) adatte al problema che si vuole affrontare (es. peso molecolare, area, volume, momento dipolare, flessibilità, capacità di formare legami d’idrogeno, ecc).

Calcolo dei descrittori per un set di molecole per cui è nota sperimentalmente l’attività biologica.

Calcolo dell’equazione correlativa (es. mediante PLS).

Utilizzo dell’equazione per predire l’attività di composti la cui attività sperimentale è ignota.

QSAR – Analisi dei risultati

pEC50 = 6.06 (0.35) – 0.070 (0.01) x Descrittore n = 35; r2 = 0.57; q2 = 0.51 s = 0.29; F = 44.30

7

7.5

8

8.5

9

9.5

10

-50 -40 -30 -20

Descrittore

Att

ività

3D-QSAR1

Si basa sull’impiego di descrittori chiamati campi calcolati proiettando una proprietà della molecola su una griglia 3D.

Prerequisiti:

• Struttura 3D delle molecole.

• Allineamento ottimale delle strutture 3D di tutte le molecole, necessario all’allineamento dei campi.

Tipologie di campi:

• Sterici

• Elettrostatici

• Lipofilici

• Basati su legami d’idrogeno

3D-QSAR – Visualizzazione dei campi

Farmaco

Interazioni sterichefavorevoli

Interazioni sterichesfavorevoliInterazioni elettrostatiche

favorevoli

Interazioni elettrostatichesfavorevoli

Il docking molecolare

Si tratta di un approccio computazionale per lo studio delle interazioni fra un generico ligando e una biomacromolecola bersaglio.

E’ necessario conoscere la struttura tridimensionale sia del ligando, sia della biomacromolecola bersaglio.

Le informazioni estrapolabili da uno studio di docking possono servire per:

l’identificazione degli elementi strutturali chiave per l’interazione sia del ligando, sia del recettore (modello farmacoforico);

la progettazione di nuovi ligandi con maggiore affinità e, conseguentemente con maggiore potenza;

ipotizzare un plausibile meccanismo d’azione.

Applicazioni del docking molecolare

Il docking molecolare permette lo studio di complessi:

• Recettore macromolecolare - ligando a basso PM*recettore/enzima – attivatore/inibitore

• Recettore macromolecolare - ligando a basso PM*proteina – proteina, DNA – proteina, DNA – DNA.

• Recettore a basso PM – ligando a basso PM*inclusi (es. beta-ciclodestrine), sali binari.

Il primo caso è quello più frequente in chimica farmaceutica poiché la stragrande maggioranza dei farmaci è a basso PM.

*PM = peso molecolare

Struttura 3D del ligando

C19H23NO5

COc1cccc(OC)c1OCCNCC3COc2ccccc2O3

1D

O

O

NH

O

OMe

MeO

2D

3D

Conversione 2D →3D:

• Meccanica molecolare(MD, conformational search)

• Quantomeccanica

Struttura 3D del recettore

Può trattarsi di un problema estremamente complesso soprattutto se non si dispongono di informazioni sperimentali sufficienti, viste le elevate dimensioni che un recettore presenta (> 50.000 atomi).

Difrattometria a raggi X

Risonanza magnetica nucleare

Predizione della struttura 3D

Accuratezzadella struttura 3D

•Metodica sperimentale•Metodica computazionale

Difrattometria a raggi X

E’ la miglior metodica attualmente disponibile per la risoluzione di strutture tridimensionali.

E’ necessario disporre del cristallo della molecola da analizzare, cosa non sempre facile da ottenere.

Il cristallo si deteriora durante l’analisi per via dell’alta energia dei raggi X.

Fornisce un’immagine statica di una realtà fisica (cristallo) che non coincide con quella biologica.

I cristalli delle macromolecole possono contenere un elevato numero di molecole d’acqua.

Molecole d’acqua

Struttura secondaria

Risonanza magnetica nucleare - NMR

Si basa sul fatto che i nuclei atomici essendo costituiti da protoni e neutroni hanno un intrinseco momento magnetico ed angolare.

Non permette di risolvere completamente la struttura 3D di una macromolecola.

E’ possibile eseguire l’analisi in soluzione, quindi in un ambiente più simile a quello biologico.

Come risultato fornisce dei parametri geometrici (distanze interatomiche) che possono essere usate per creare il modello 3D mediante l’impiego della meccanica molecolare (MM) e della dinamica molecolare (MD).

Predizione della struttura 3D

Si può parlare anche di predizione del folding di una proteina.

Assunzione:

Proteine con sequenza aminoacidica simile (struttura primaria) hanno anche una disposizione spaziale degli atomi simile (sequenza secondaria e terziaria).

Ciò è comprovato da un’evidenza sperimentale:

ProteinadenaturataProteina

denaturataProteina

allo stato nativoProteina

allo stato nativoProteina

allo stato nativoProteina

allo stato nativoDenaturazione Rinaturazione

pHTemperaturaForza ionica

Le informazioni per il folding sono contenute nella struttura primaria della proteina.

Predizione del folding proteico

Sequenza aminoacidica

…AYDKLATT…

Etot=WVdWEVdW+WhbEhb+…

Ab-initio Comparative modelling

Confronto con modelli a struttura

3D risolta

Uso di parametri e “regole” dedotte da strutture 3D

Funzione di scoreFunzione di score

Predizione del folding

Docking manuale

L’operatore è guidato dalla grafica computerizzata.

E’ necessario postulare un’ipotesi sulla modalità d’interazione.

Si posiziona il ligando mediante rototraslazioni manuali.

Ligando

Recettore

Dockingmanuale

Docking manuale – visualizzazione del recettore

Visualizzazione wireframe

Superficie DEEP

Sito di legame

Docking manuale – visualizzazione del recettore

Superficie MEP

Superficie accettrice di HB

Accettori di HB

Zone cariche +

Zone cariche -

Docking manuale – visualizzazione del ligando

Zona carica -

Superficie donatrice di HB

Superficie MEPSuperficie diVan der Waals

Zona carica +

Donatore di HB

Il docking automatico

Non richiede particolari manualità da parte dell’operatore.

Il ligando è posizionato nel recettore in modo automatico.

La validità del complesso (o orientamento) risultante è stimata mediante un punteggio chiamato score:

Lo score è un valore numerico che permette di stabilire a priori, cioè senza l’ausilio della grafica, se un orientamento è di potenziale interesse:

score interazione ligando recettore

All’operatore resta il compito di giudicare la validità delle soluzioni proposte dal punto di vista chimico-farmaceutico-biologico.

Caratteristiche ideali del docking automatico

Accuratezza dell’attribuzione dello score per ciascun orientamento ligando-recettore calcolato.

Pertinenza delle proprietà considerate nell’attribuzione dello score in relazione allo specifico sistema ligando-recettore.

Rapidità nella generazione dei complessi.

Interfaccia con banche dati di molecole per il virtual screening.

LigandoLigando

RecettoreRecettore

Complessoligando-recettore

Complessoligando-recettore

Algoritmo didocking

Valutazionedello score

Classificazionedel complessoClassificazionedel complesso

Funzione di score

Permette di valutare la complementarità chimico-fisica e geometrica fra ligando e recettore in un complesso.

E’ l’elemento più critico di un metodo di docking.

Score = Cs + Ci + ENB + EDes + ...

Cs = complementarità sterica;

Ci = contributo idrofobico;

ENB = energia di non legame;

EDes = energia di desolvatazione.

Calcolo dell’energia di una molecola

Indispensabile per:

• ottimizzazione delle geometrie di una molecola (minimizzazione energetica);

• analisi conformazionale (evasione dai minimi locali);

• dinamica molecolare;

• docking molecolare.

Calcoli quantomeccanici

Calcoli semi-empirici

Calcoli di meccanica molecolare

Accuratezza Velocità

Meccanica molecolare

Approssima gli atomi a delle sfere rigide e i legami a delle molle.

Etot = Eb + Ea + Et + Ei + EVdW + Ec+ EHB

Energia di legame

Energia di non-legame

Eb = energia di legameEa = energia angolareEt = energia torsionaleEi = energia degli angoli impropriEVdW = energia di Van der WaalsEc = energia elettrostatica (coulombiana)EHB = energia dei legami d’idrogeno

Energia di non legame

ENL = EVdW + Ec+ EHB

Nel caso del campo di forze AMBER:

ij ijij

ij

ij

ij

ij

ji

ij

ij

ij

ij

ijNB

r

D

r

C

r

qq

r

B

r

AE

1012

612

.

.2

Riduzione dei tempi di calcolo

Computo dello score mediante meccanica molecolare o altri metodi empirici.

Riduzione del numero di parametri che costituiscono la funzione di score.

Riduzione delle dimensioni dell’area da esplorare.

Conformazione bloccata del recettore.

Conformazione bloccata del ligando.

Inaccuratezza del complesso generato.

Lo screening virtuale1

Strumento basato su metodiche computazionali atto all’identificazione di composti biologicamente attivi a partire da banche dati di strutture reali o puramente virtuali.

Modello farmacoforicoModello farmacoforico

Database di composti(milioni)

Database di composti(milioni)

Molecole potenzialmenteattive (decine)

Molecole potenzialmenteattive (decine)

Virtuale

Test farmacologicoTest farmacologico

Sintesi chimica(decine)

Sintesi chimica(decine)

Molecole attive(alcune unità)

Molecole attive(alcune unità)

Reale

Lo screening virtuale2

Modello farmacoforicoModello farmacoforico

Database di compostireali (migliaia)

Database di compostireali (migliaia)

Molecole potenzialmenteattive (decine)

Molecole potenzialmenteattive (decine)

Virtuale

Test farmacologicoTest farmacologico

Molecole attive(alcune unità)

Molecole attive(alcune unità)

Reale

Situazione tipica di un’industria farmaceutica.Vantaggi: risparmio di tempo nello sviluppo = risparmio di denaro.

Nuove frontiereper la modellistica molecolare

QSAR 2D½

Le molecole non sono rappresentate come un insieme di atomi ma da dei vettori che ne descrivono le proprietà chimico fisiche (es. momento dipolare, momento di lipofilia, legami d’idrogeno, ecc).

Con i vettori è possibile tener conto della flessibilità della molecola calcolandoli come una media dei diversi conformeri.

Relativa facilità di sovrapposizione dei vari modelli vettoriali.

Possibilità di rappresentare graficamente sia le molecole, sia il farmacoforo in modo comprensibile.

Attualmente non esiste una soluzione accademica di QSAR che possa competere con i programmi commerciali.

Analisi delle dinamiche molecolari

Premessa:

• Le simulazioni di dinamica molecolare permettono di studiare come evolve nel tempo un sistema sottoposto all’effetto dell’energia cinetica.

• Durante la simulazione vengono campionate le coordinate atomiche a salvate in un file di traiettoria (trajectory).

• Il quantitativo di informazioni contenute nella traiettoria è talmente elevato che spesso quelle più importanti sono “coperte” da quelle secondarie.

Analisi dei risultati:

• Si potrebbero considerare i movimenti degli atomi alla stessa stregua di onde e applicare la teoria di del campionamento Shannon.

• I segnali più importanti potrebbero essere filtrati per evidenziarli al meglio (es. FFT, DFT, ecc).

• Analisi dei movimenti dei domini di una proteina.

Fingerprint per il de novo drug design

Fingerprint e similarità:

• Le fingerprint sono stringe di bit comunemente utilizzate per comparare fra loro molecole e nel caso più specifico per il virtual screening.

• La codifica delle strutture in fingerprint comporta un notevole incremento della velocità di interrogazione di una database (indice di similarità di Tanimoto).

Fingerprint e progettazione di nuovi farmaci:

Codifica di strutture biologicamente attive in fingerprint.

Combinazione dei bit (es. mediante operatori logici o algoritmi genetici).

Nuova molecola

Predizione del folding proteico

Si è ben lontani dall’aver compreso le regole codificate nella struttura primaria che determinano la disposizione spaziale degli atomi.

Il campo meno esplorato è quello della predizione ab-initio.

Predizione dei loop.

Ottimizzazione della catene laterali degli aminoacidi.

Automatizzazione della generazione di modelli in forma apo (enzima) ed olo (enzima + cofattore).

Meccanica molecolare

E’ già stato fatto molto ma mancano algoritmi realmente veloci.

Calcolo dell’interazione di non-legame.

Problema della costante dielettrica.

Parallelizzazione del codice.

Rilevamento delle collisioni degli atomi (bump-check) in tempo reale.

GPGPU e stream processing

Vantaggi:

Campo ancora poco esplorato (es. SETI@Home, Folding@home).

Permette di avere prestazioni di calcolo eccezionali a costi bassissimi:

- 8x AMD Opteron 750 2.4 GHz (16 core totali) ~ 20 GFlops (20.000 €)

- 1x AMD/ATI HD3870 (320 stream processor) ~ 60 GFlops (~1.200 €)

Programmazione relativamente semplice grazie al compilatore C/C++ - like Brook+ (AMD).

Non esiste ancora alcun programma di meccanica molecolare.

Svantaggi:

Due standard incompatibili:

• CAL (AMD).

• CUDA (NVIDIA).

Ringraziamenti

Giulio Vistoli Roberto Cordone

www.ddl.unimi.it