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Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos
Il citoscheletro
Il citoscheletro è più sviluppato in cellule eucario<che animali, che non possiedono una parete cellulare esterna come ba@eri e cellule delle piante. Ruoli del citoscheletro: -‐ Mantenere la forma della cellula (collegata alla sua funzione) e dotarla di resistenza meccanica -‐ Mo<lità cellulare -‐ Organizzazione interna della cellula
Riguardo a forma e movimento, è allo stesso tempo ossatura e muscolatura della cellula, molto dinamico e in con<nuo cambiamento per soddisfare i bisogni cellulari. Riguardo a l’organizzazione, è impalcatura per tuJ gli organuli ma anche autostrada per il collegamento fra di loro.
Il citoscheletro è formato da tre <pi diversi di proteine che fanno filamen<: -‐ Filamen( di ac(na -‐ Microtubuli -‐ Filamen( intermedi
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I filamen< intermedi sono come ‘corde’ molto for< che rendono le cellule resisten< agli stress di <po meccanico (s<ramento). Sono il <po di filamen< più durevole, resistono cambiamen< osmo<ci e detergen<. Sono faJ da proteine filamentose di <pi molto diversi (famiglia eterogenea), che formano fibre di 10 nm di diametro, a metà fra i filamen< di ac<na e i microtubuli.
FILAMENTI INTERMEDI
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Formano una rete traverso il citosole e intorno al nucleo, che collega fra di loro i pun< di ancoraggio della cellula con altre cellule (desmosomi).
Si trovano pure al interno del nucleo di tu@e le cellule eucario<che, formando un re<colo che rafforza l’involucro nucleare dal lato interno: la lamina nucleare.
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Monomero con teste globulari e regione allungata a elica alfa. Dimero ad alfa elica superavolta. Tetramero formato da due dimeri inver<< e sfalsa<.
Due tetrameri associa< da interazioni non covalen<.
O@o tetrameri associa< dagli stremi e lateralmente per formare un filamento.
Regioni globulari: molto variabili. Regioni filamentose: molto conservate.
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Tipi di filamen< intermedi Ogni <po di filamento è fa@o di unità proteiche cara@eris<che. Le chera<ne sono di tan< <pi, a seconda del <po di epitelio.
Negli epiteli. Anche in peli, unghie, penne
Nel tessuto conne=vo,
cellule muscolari e gliali
Nelle cellule nervose
In tu@e le cellule eucario(che
Chera(ne Vimen(ne e
simili Neurofilamen( Lamine nucleari
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I filamen< intermedi interagiscono con altre proteine, sopra@u@o tramite le teste globulari di ogni subunità, che sporgono dal filamento intrecciato. Ad esempio, sono collega< fra di loro, agli altri filamen< del citoscheletro e ai pun< di adesione fra le cellule (desmosomi) da molecole come la plec(na.
Micrografia di microscopia ele@ronica colorata: blue: filamen< intermedi; rosso: microtubuli; verde: plec<na; giallo: an<corpi contro la plec<na marca< con par<celle di oro. L’ac<na è stata rimossa per vedere gli altri componen<.
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La presenza di filamen< intermedi è fondamentale per la resistenza meccanica degli epiteli allo s<ramento. Senza i filamen< intermedi gli epiteli sono molto fragili e si rompono (malaJa). Senza plec<na, i topi muoiono poco dopo la nascita, con problemi epiteliali, muscolari e nervosi.
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La lamina nucleare è formata da proteine de@e lamine (non laminine!) che formano filamen< intermedi che si organizzano in rete per rinforzare l’involucro nucleare. Queste lamine si possono modificare per fosforilazione per farli separare durante la mitosi, quando l’involucro nucleare si rompe per far dividere il materiale gene<co fra le cellule figlie. Successivamente, le lamine si defosforilano e ricos<tuiscono la lamina nucleare. Mutazioni delle lamine causano una grave malaJa del <po delle progerie, dove il paziente invecchia prematuramente, ma le ragioni per questo effe@o non sono chiare.
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MICROTUBULI
I microtubuli sono il componente del citoscheletro più coinvolto nelle funzioni di organizzazione degli organuli e nella comunicazione fra di loro (il traffico vescicolare), grazie alla interazione con proteine motrici. Il suo diametro è di 20 nm circa.
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I microtubuli della cellula in riposo (interfase) si organizzano in maniera radiale, partendo del centrosoma, verso il centro della cellula.
Durante la divisione cellulare (mitosi), i microtubuli si riorganizzano e formano il fuso mito(co, una stru@ura che distribuisce i cromosomi fra le due cellule figlie.
I microtubuli sono pure il citoscheletro fondamentale di certe stru@ure come ciglia e flagelli, allungamen< a forma di peli che sporgono da un lato della cellula (di solito apicale) e fanno di propulsione per spostare la cellula o il fluido a conta@o.
Polo del fuso mito(co
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I microtubuli sono faJ da due piccole unità di tubulina, una alfa e una beta, che si legano non covalentemente in un eterodimero. Gli eterodimeri si legano alternando per formare protofilamen(, che hanno così due estremi diversi: sono polarizza(, con un estremo alfa e uno beta. Tredici protofilamen< si legano lateralmente, tuJ orienta< nella stessa direzione, formando un tubo vuoto: il microtubulo, che ha un estremo alfa (estremità meno) e uno beta (estremità più). Gli stremi sono funzionalmente diversi, quello più si allunga più velocemente che quello meno, dunque il microtubulo cresce dal lato più (per addizione di eterodimeri). Le conseguenze funzionali sono molto importan<.
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I microtubuli si organizzano radialmente partendo da un centro organizzatore, che nelle cellule animali è il centrosoma, e crescendo verso l’esterno dalle estremità più. Nel centro del centrosoma ci sono due cilindri di microtubuli, i centrioli, di funzione sconosciuta, ma molto simili o iden<ci ai corpuscoli basali che organizzano i microtubuli di ciglia e flagelli. In torno ci sono anelli di tubulina gamma, che funzionano come centri di nucleazione: essenziali per la polimerizzazione della tubulina in microtubuli alle concentrazioni citosoliche si tubulina.
Si( di nucleazione Anelli di tubulina gamma
Coppia di centrioli
Matrice del centrosoma
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Ricostruzione dello scheletro di microtubuli che partono dal centrosoma di una cellula di C. elegans.
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Il citoscheletro
Come fanno i microtubuli in realtà?
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Come fanno i microtubuli in realtà?
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I microtubuli si allungano e si accorciano in maniera repen<na, è la instabilità dinamica. Si basa nel legame di GTP ai dimeri di tubulina: il dimero-‐GTP si lega forte all’estremità più e la fa crescere, formando un cappuccio a GTP. Se il GTP della estremità s’idrolizza a GDP, i legami s’indeboliscono e il microtubulo si disfà: è una catastrofe. Questo processo man<ene i livelli di dimeri di tubulina al< nel citosole, per la nuova polimerizzazione.
Microtubulo in allungamento Microtubulo in accorciamento
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La importanza di ques< fenomeni di polimerizzazione/depolimerizzazione è dimostrata dal fa@o che i farmaci che arrestano la polimerizzazione (come la colchicina) o la depolimerizzazione (come il taxolo) causano l’arresto della mitosi durante la fase del fuso mito<co. Si usano come an<tumorali.
La instabilità dinamica fa che i microtubuli siano molto dinamici, si formano e si sfanno in con<nuazione, e così esplorano dove c’e bisogno di nuovi microtubuli. Ma la cellula può regolare la intensità del fenomeno per i propri fini. I microtubuli necessari a stabilizzare una stru@ura o creare un collegamento si agganciano a proteine di ancoraggio dal lato più e rimangono stabili, o delle proteine specializzate si legano al estremo più, o lungo i microtubuli, e li stabilizzano, mentre altre li collegano ad altri componen< del citoscheletro o agli organuli.
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Un esempio molto chiaro sono le cellule polarizzate, dove c’e una stre@a organizzazione polare dei componen< (stru@ura) e della aJvità (funzione) cellulare. I microtubuli sono fondamentali per mantenere questa organizzazione di organuli e vescicole.
I componen< del citoplasma si spostano usando il citoscheletro di microtubuli e ac<na come delle strade, grazie a proteine motrici, che usano ATP per generare un movimento di <po saltatorio e direzionato. Diversi motori si associano a diversi <pi di filamento, si muovono in diverse direzioni e trasportano diversi cariche.
Trasporto centripeto
Trasporto centrifugo
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Le proteine motrici che si spostano lungo i microtubuli sono di due <pi: chinesine (verso il lato più) e dineine (verso il meno). Tu@e e due sono dimeri di proteine con una testa globulare e una coda allungata.
Le due teste legano il microtubulo in maniera orientata e idrolizzano ATP, generando cambiamen< conformazionali e movimento. Le due code si uniscono in una sola che lega il carico da trasportare.
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Diversi <pi di chinesine e dineine si specializzano nel trasporto di diversi carici.
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Trasporto di vescicole lungo i microtubuli
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Organizzazione degli organuli: RE-‐chinesina, Golgi-‐dineina
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Due stru@ure cellulari organizzate dai microtubuli:
Ciglia: protrusioni piliformi di ˜0.25 µm di diametro, che propulsano il fluido esterno (epitelio respiratorio, ovidu@o) o le cellule in ambiente fluido (protozoi).
Flagelli: organi propulsori di organismi unicellulari e spermatozoi, più lunghi e aziona< da un movimento ondulatorio.
I microtubuli al loro interno crescono a par<re di un organizzatore che è il corpusculo basale, nel citoplasma.
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La stru@ura interna di tuJ e due è la stessa, molto conservata (protozoi al uomo): una coppia di microtubuli centrali e nove coppie a@orno, legate fra di loro da diverse proteine. Fra queste è importante la dineina ciliare, che si lega a due microtubuli (dalla testa e la coda) e li fa scorrere fra di loro, generando la flessione del ciglio o flagello. Mutazioni di questa proteina: sindrome di Kartagener (infezioni bronchiali e sterilità maschile).
Doppio microtubulo esterno
Microt. singolo della coppia centrale
Dineina
Dineina
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FILAMENTI DI ACTINA
I filamen< di ac<na, in tu@e le cellule eucario<che, sono i principali responsabili della mo<lità cellulare e dei mo< di superficie. Interagiscono con molte proteine che legano ac<na, per tante funzioni diverse.
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I filamen< di ac<na formano lo scheletro dei microvilli (cellule intes<nali), dei fasci contra=li (i muscoli della cellula) e delle protrusioni superficiali molto dinamiche, e formano pure l’anello contra=le che divide una cellula in due alla fine della mitosi.
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Sono filamen< più soJli, flessibili e cor< dei microtubuli, con circa 7 nm di diametro. Si organizzano in fasci e re< per fare stru@ure più robuste.
Il filamento si forma per addizione di monomeri di ac<na, formando una doppia catena con due filamen< fortemente intreccia<. Gli estremi dei monomeri sono diversi, dunque pure i filamen< di ac<na hanno una polarità stru@urale, con un estremo meno e uno più.
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TuJ i due estremi possono crescere, ma il estremo più lo fa a maggiore velocità. La crescita avviene per aggiunta di monomeri lega< ad ATP. Una volta uni< al filamento, l’ATP si idrolizza ad ADP indebolendo il legame agli altri monomeri. Lo scambio di ADP per ATP accade solo nello stato monomerico. Pure i filamen< di ac<na sono in equilibrio dinamico, fra polimerizzazione e depolimerizzazione, e pure in questo caso ci sono tossine che possono bloccare ogni fenomeno (polim: citocalasine; depolim: falloidina).
Ac(na legata ad ADP
Ac(na legata ad
ATP
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Di solito la metà dell’ac<na è in filamen< e l’altra metà monomerica, in maniera di essere disponibile se c’e bisogno di fare nuovi filamen< velocemente. Ci sono tante proteine che legano l’ac<na, per molte funzioni diverse:
-‐ Proteine che legano l’ac<na monomerica, per tenere la riserva di monomero pronta (profilina). -‐ Proteine che promuovono la polimerizzazione sul fronte di avanzamento di una cellula in movimento (formine; ARP: ac3n related proteins). -‐ Proteine che organizzano i fasci contraJli. -‐ Proteine che formano re<coli di filamen< di ac<na nel cortex cellulare. -‐ Proteine che rompono i filamen< in frammen< cor< (gelsolina). -‐ Proteine motrici che legano i filamen< per generare movimento (miosina). -‐ Proteine che si muovono lungo i filamen< legando carico come organelli.
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Proteina che sequestra i monomeri
Proteina che organiza fasci (filopodia)
Proteina motrice
Proteina cappuccio
Proteina di collegamento
laterale
Proteina di collegamento nel cortex
Proteina di nucleazione
Proteina che frammenta filamen(
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Il cortex cellulare Abbiamo visto che la membrana plasma<ca è rinforzata da una rete di spectrina dal lato citosolico. La maggior parte delle cellule hanno pure una rete di filamen< di ac<na so@o la membrana plasma<ca che forma uno strato che da resistenza meccanica alla cellula, coinvolto nel mantenimento della forma cellulare, nel movimento della cellula e nella formazione di protrusioni mobili di membrana.
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Molte cellule si spostano strisciando sul substrato: -‐ Arriva un segnale che aJva rece@ori. -‐ La cellula eme@e prolungamen< sul fronte aJvato: lamellipodi e filopodi. Polimerizzazione di ac<na verso il fronte, estremo più, 1 µm/sec. -‐ I prolungamen< si a@accano al substrato (integrine) e fanno d’ancora, collegandosi all’ac<na. -‐ Il corpo cellulare viene trascinato usando ques< pun< di ancoraggio per generare movimento: ac<na e miosina.
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Il citoscheletro
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Il citoscheletro
L’ac<na nei lamellipodi
L’ac<na nei filopodi
Proteina cappuccio
Nuovo filamento Fronte avanzamento
Complesso ARP
Monomeri di ac(na
Formina
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Le miosine Sono le proteine motrici che interagiscono con l’ac<na, movendosi verso gli stremi più dei filamen<. Hanno una testa globulare con aJvità ATPasi per generare movimento, e una coda che lega diversi <pi di carico a seconda del <po di miosina.
La miosina I si trova in tu@e le cellule, fa spostare carici lungo i filamen< di ac<na, o pure la membrana plasma<ca rispe@o ai filamen< di ac<na.
La miosina II è la principale miosina del muscolo.
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L’aJvità delle proteine che legano l’ac<na, e quindi del citoscheletro di ac<na, è modificata da segnali intra-‐ ed extracellulari: le proteine che legano l’ac<na sono proteine effe@rici. Così la cellula può rispondere a cer< segnali con movimen< e spostamen<.
Le molecole segnalatrici intracellulari che collegano i segnali con le proteine che legano ac<na appartengono alla famiglia della proteina Rho, e sono interru@ori dipenden< del legame a GTP (GTP: on; GDP: off).
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Rho: fasci contra=li ed spostamento
Cdc 42: filopodi Rac: lamellipodi
Cellula in riposo
