1

Contaminazione da tossine di Contaminazione da tossine di FusariumFusarium (DON, T(DON, T--2 e HT2 e HT--2) 2)

nel grano duro nazionalenel grano duro nazionale

Michelangelo Pascale

“IL MONITORAGGIO DELLE PRODUZIONI NAZIONALI”Bologna, 30 Settembre 2010

Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA) - Bari

• FHB è una malattia causata da diverse specie fungine appartenenti al genere Fusarium e Microdochium

• Colpisce frumento, orzo, segale, triticale, mais, sorgo ………

• Condizioni ideali per l’insorgenza della malattia: andamenti climatici piovosi e/o caldo umidi, in coincidenza con le fasi fenologiche comprese tra la spigatura e la maturazione latteo-cerosa

FUSARIOSI DELLA SPIGA (FHB) e MICOTOSSINE

• FHB sta ricevendo particolare attenzione in

Italia negli ultimi anni per le conseguenze che

la malattia può avere su:

� resa in granella� qualità della granella � contaminazione delle cariossidi con

micotossine (di Fusarium)

�� Fusarium graminearumFusarium graminearum(DON, AcDON, NIV, FUS, ZEN)(DON, AcDON, NIV, FUS, ZEN)

�� F. culmorumF. culmorum(DON, AcDON, NIV, ZEN, ZOH)(DON, AcDON, NIV, ZEN, ZOH)

�� F. avenaceumF. avenaceum(MON, BEA, enniatine)(MON, BEA, enniatine)

�� F. poaeF. poae(DAS, NIV, FUS, T(DAS, NIV, FUS, T--2)2)

�� Microdochium nivaleMicrodochium nivale

�� Fusarium graminearumFusarium graminearum(DON, AcDON, NIV, FUS, ZEN)(DON, AcDON, NIV, FUS, ZEN)

�� F. culmorumF. culmorum(DON, AcDON, NIV, ZEN, ZOH)(DON, AcDON, NIV, ZEN, ZOH)

�� F. avenaceumF. avenaceum(MON, BEA, enniatine)(MON, BEA, enniatine)

�� F. poaeF. poae(DAS, NIV, FUS, T(DAS, NIV, FUS, T--2)2)

�� Microdochium nivaleMicrodochium nivale

� F. cerealis (NIV, FUS, ZEN, ZOH)

� F. sporotrichioides (T-2, HT-2, NEO)

� F. tricinctum (MON, BEA, ENS)

� F. acuminatum (T-2, NEO, MON, ENS)

� F. subglutinans (MON, BEA, FUP)

� F. oxysporum (MON, BEA, ENS)

� F. equiseti (DAS, ZEN, ZOH)

SPECIE FUNGINE ASSOCIATE ALLA SPECIE FUNGINE ASSOCIATE ALLA FUSARIOSI DELLA SPIGAFUSARIOSI DELLA SPIGA

First Report of Fusarium langsethiae on Durum Wheat Kernels in Italy

Infantino et al., Plant Disease, 2007, 91, 1362

Tricotecene Prodotto contaminato (percentuale di campioni positivi)*

Deossinivalenolo mais (89%), frumento (61%)

Nivalenolo mais (35%), avena (21%), frumento (14%)

3 Acetil-DON mais (27%), frumento (8%)

Tossina T-2 mais (28%), frumento (21%), avena (21%)

Tossina HT-2 avena (41%), mais (24%), segale (17%), frumento (12%)

DON campioni analizzati:DON campioni analizzati:NIVAc-DON TT--2 2 HTHT--22

11022 (57% positivi)11022 (57% positivi)4166 (16% positivi) 3721 (8% positivi)3490 (20% positivi) 3490 (20% positivi) 3032 (14% positivi)3032 (14% positivi)

*

TRICOTECENI TRICOTECENI -- Prodotti a rischio contaminazioneProdotti a rischio contaminazioneScientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003

“Wheat and wheat containing products (like bread and

pasta) represent for DON, NIV, T-2 toxin and HT-2 toxin the major source of intake”

2

6358 campioni analizzati61% positivi (2 – 50000 µg/kg)6358 campioni analizzati61% positivi (2 – 50000 µg/kg)

DONDONDONDON

Deossinivalenolo Deossinivalenolo -- Prodotti a rischio contaminazioneProdotti a rischio contaminazione

Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003

DONDON –– numero di campioni positivi per nazionenumero di campioni positivi per nazione

Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003

Tossina TTossina T--2 2 -- numero di campioni positivi per nazionenumero di campioni positivi per nazione

Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003

TT--22405 campioni analizzati94% positivi (2 – 280 µg/kg)Metodo di analisi: ELISAMetodo di analisi: ELISA

* nessun campione analizzato per HT-2

*

253 campioni frumento e prodotti derivati

(2-160 µg/kg)

O

O

OHOH

O

OH

Dessinivalenolo

FUNGHIFUNGHI PRODUTTORIPRODUTTORIFusariumFusarium graminearum,graminearum, FF.. culmorumculmorum

DERRATAfrumentofrumento, mais, orzo, segale,avena, birra

EFFETTIEFFETTI TOSSICITOSSICIvomitovomitorifiutorifiuto didi cibociboridottoridotto pesopeso corporeocorporeoimmunosoppressioneimmunosoppressione

LIVELLI MASSIMI AMMISSIBILILIVELLI MASSIMI AMMISSIBILIRegRegolamenti (CE) n. 1881/2006 e olamenti (CE) n. 1881/2006 e (CE) n. 1126/2007 (CE) n. 1126/2007

Deossinivalenolo (vomitossina, DON)

3

Livelli max. Livelli max. (µg/kg)(µg/kg)

PRODOTTO DONDON

Cereali non processati diversi da frumento duro, avena e

mais1250

Frumento duro e avena (non processati ) 17501750

Cereali destinati al consumo umano diretto, farina di cereali, crusca, germe

750

Pasta (secca) 750

Pane (compresi piccoli prodotti da forno), prodotti della

pasticceria, biscotteria, merende a base di cereali e cereali da

colazione

500

Alimenti a base di cereali trasformati e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini

200

Regolamento (CE) N. 1181/2006 e 1126/2007

PRODOTTI A RISCHIO

FUNGHI PRODUTTORI

EFFETTIEFFETTI TOSSICITOSSICI

O

O

H3C

H

H

CH2

OH

H

CH3

H

OCOCH3OCOCH3

(CH3)2CHCH2OCO

Tossina T-2

9

16 10

87

6

11

1

15

12

13

2

3

45

14

O

O

H3C

H

H

CH2

OH

H

CH3

H

OHOCOCH3

3 2 2(CH ) CHCH OCO

Tossina HT-2

9

16 10

87

6

11

1

15

12

13

2

3

45

14

•• avena,avena, mais,mais, frumento,frumento, orzo,orzo,segalesegale ee prodottiprodotti derivatiderivati

•• FusariumFusarium sporotrichioides,sporotrichioides, FF.. poae,poae,FF.. langsethiae,langsethiae, FF.. acuminatumacuminatum

•• attivitàattività immunosoppressivaimmunosoppressiva•• citotossicitàcitotossicità•• attività dermotossica ed emorragicaattività dermotossica ed emorragica•• inibizione della sintesi proteicainibizione della sintesi proteica•• leucopenia tossicoleucopenia tossico--alimentare (ATA)alimentare (ATA)

Rispetto al DON, la tossicità delle tossine T-2 e HT-2 è 20 volte più elevata nel topo e 100-1000 volte più elevata in linee cellulari (in vitro).

Tossine T-2 e HT-2

”Stime sull'assunzione indicano che la presenza delle tossine T-2 e HT-2 può essere preoccupante per la salute pubblica. È quindi necessario e altamente prioritario sviluppare un metodo di analisi sensibile e affidabile, raccogliere ulteriori dati sull'occorrenza e svolgere ulteriori maggiori indagini/ricerche sui fattori che incidono sulla presenza delle tossine T-2 e HT-2 nei cereali e nei prodotti a base di cereali, in particolare nell'avena e nei prodotti a base di avena”.

�

Paragrafo 31

REGOLAMENTO (CE) N. 1881/2006che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti

nei prodotti alimentari

UEUE: livelli massimi ammissibili in discussione

Annata

Frumento tenero Frumento duro

Campioni positivi

(%)

Valore medio (µg/kg)

Valore massimo (µg/kg)

Campioni positivi

(%)

Valore medio (µg/kg)

Valore massimo (µg/kg)

1997-98 30 140 1000 92 200 1540

1998-99 61 220 960 83 250 1200

1999-2000 38 610 30003000 61 1100 64206420

2000-01 50 150 480 28 90 250

2001-02 100 590 18601860 79 420 39003900

2002-03 16 180 350 5 80 110

2003-04 4 110 110 5 170 850

Totale campioni analizzati 945; 1997-98: 155; 1998-99: 268; 1999-2000: 88; 2000-01: 109;2001-02: 154; 2002-03: 89; 2003-04: 82.

Campagna et al., 2005Campagna et al., 2005

LIVELLI DI LIVELLI DI DONDON IN FRUMENTO IN FRUMENTO PRODOTTO IN ITALIA PRODOTTO IN ITALIA (1998-2004)

(analisi HPLC-IMA/DAD, LOD = 20 ppb)

4

LIVELLI DI LIVELLI DI DONDON IN FRUMENTO DURO IN FRUMENTO DURO PRODOTTO IN ITALIA PRODOTTO IN ITALIA

aziende eaziende e centri di stoccaggio centri di stoccaggio (2006-2008)

Risultati del Progetto MICOCERRisultati del Progetto MICOCER

ANNI

CENTRO SUD-ISOLE

n. camp.

n.pos.

Media pos.

(µg/kg)

max.(µg/kg)

n. camp.

n. pos.

Media pos.

(µg/kg)

max.(µg/kg)

2006 15060

(40%)84 449 299

74(25%)

54 906

2007 15286

(57%)286 43514351 254

89(35%)

48 422

2008 134114

(85%)477 1356113561 98

28(29%)

45 329

totale 436260

(60%)- - 651

191(30%)

- -

metodo di analisi ELISA, LOD = 18,5 ppb

Aureli et al., 2009Aureli et al., 2009Totale campioni analizzati: 1087

LIVELLI DI LIVELLI DI DONDON IN FRUMENTO DURO IN FRUMENTO DURO PRODOTTO IN ITALIA PRODOTTO IN ITALIA rete nazionale rete nazionale (2006-2008)

Risultati del Progetto MICOCERRisultati del Progetto MICOCER

ANNI

NORD CENTRO SUD-ISOLE

n. cam.

n.pos.

Media pos.

(ppb)

max.(ppb)

n. cam.

n.pos.

Media pos.

(ppb)

max.(ppb)

n. cam.

n. pos.

Media pos.

(ppb)

max.(ppb)

2006 8455

(65%)291 1280 258

129(50%)

225 791 29746

(15%)62 219

2007 135131

(97%)174 502

264 189(72%)

155 1285 305173

(57%)88 459

2008 6666

(100%)(100%)22112211 67646764 102

81(80%)

480 46134613 13244

(33%)57 233

totale 285252

(88%)- - 624

399(64%)

- - 734263

(36%)- -

metodo di analisi ELISA, LOD = 18,5 ppb

Aureli et al., 2009Aureli et al., 2009

Totale campioni analizzati: 1643

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

ELISA DON (ng/g)

HP

LC D

ON

(ng

/g)

range 18,5 range 18,5 –– 13600 ng/g13600 ng/g

n = 256

y = 1,0162x – 68,017r = 0,98885

FFRUMENTO RUMENTO DDUROUROCCORRELAZIONE ORRELAZIONE EELISA/LISA/HHPLCPLC

Risultati del Progetto MICOCERRisultati del Progetto MICOCER20082008 20092009

Numero di campioni analizzatiNumero di campioni analizzati 136136 9393

Numero di campioni positiviNumero di campioni positivi 99 99 (73%)(73%) 67 67 (72%)(72%)

< 20 µg/kg < 20 µg/kg (LOD)(LOD) 37 37 (27%)(27%) 26 26 (28%)(28%)

20 20 -- 1750 µg/kg1750 µg/kg 71 71 (52%)(52%) 60 60 (65%)(65%)

> 1750 µg/kg> 1750 µg/kg 28 28 (21%)(21%) 7 7 (7%)(7%)

Media dei positivi Media dei positivi (ppb)(ppb) 11701170 672672

Min Min (ppb)(ppb) 2020 2020

Max Max (ppb)(ppb) 82408240 34603460

2008 = Nord (51), Centro (32), Sud (53)2009 = Nord (35), Centro (31), Sud (27)

Pascale et al., 2010Pascale et al., 2010

Monitoraggio Monitoraggio DONDON grano grano duro nazionale duro nazionale (2008 e 2009)(metodo di analisi HPLC-IMA/UV, LOD = 20 ppb)

5

20082008 20092009

n. n. camp.camp.

< 20 < 20 ng/gng/g

2020--1750 1750 ng/gng/g

> 1750 > 1750 ng/gng/g

Media Media pos. pos.

(ng/g)(ng/g)

n. n. camp.camp.

< 20 < 20 ng/gng/g

2020--1750 1750 ng/gng/g

> 1750 > 1750 ng/gng/g

Media Media pos. pos.

(ng/g)(ng/g)

NORDNORD 515111

(2%)(2%)

2424(47%)(47%)

2626(51%)(51%)

20422042 353500

(0%)(0%)

2828(80%)(80%)

77(20%)(20%)

11381138

CENTROCENTRO 323266

(19%)(19%)

2525(78%)(78%)

11(3%)(3%)

376376 31311010

(32%)(32%)

2121(68%)(68%)

00(0%)(0%)

146146

SUD e SUD e ISOLEISOLE

53534444

(83%)(83%)

88(15%)(15%)

11(2%)(2%)

329329 27271616

(59%)(59%)

1111(41%)(41%)

00(0%)(0%)

191191

metodo di analisi HPLC-IMA/UV, LOD = 20 ng/g

Monitoraggio Monitoraggio DONDON grano grano duro nazionale duro nazionale (2008 e 2009)

20102010

n. n. camp.camp.

< 80 < 80 ng/gng/g

80 80 -- 1750 1750 ng/gng/g

> 1750 > 1750 ng/gng/g

Media Media pos. pos.

(ng/g)(ng/g)

NORDNORD 292911

(3%)(3%)

2222(76%)(76%)

66(21%)(21%)

13391339

CENTROCENTRO 4422

(50%)(50%)

22(50%)(50%)

00(0%)(0%)

610610

SUD e SUD e ISOLEISOLE

73736969

(94%)(94%)

44(6%)(6%)

00(0%)(0%)

105105

Monitoraggio Monitoraggio DONDON grano grano duro nazionale duro nazionale (2010)

Laboratorio accreditato SINAL-ACCREDIA (n. 0975)

metodo di analisi ELISA, LOD = 80 ppb

I livelli di DON e la frequenza di contaminazione dipendono dall’annata agraria

Livelli e frequenza di contaminazione di DON più elevati nei campioni del Nord Italia rispetto a quelli del Sud Italia

DON-

+

MONITORAGGIO grano duro nazionale MONITORAGGIO grano duro nazionale -- DONDON

TT--2 + HT2 + HT--22 20082008 20092009

Numero di campioni analizzatiNumero di campioni analizzati 136136 9393

Numero di campioni positiviNumero di campioni positivi 81 81 (60%)(60%) 54 54 (58%)(58%)

< 3 ppb < 3 ppb (LOD)(LOD) 55 55 (40%)(40%) 39 39 (42%)(42%)

33--100 ppb100 ppb 77 77 (57%)(57%) 53 53 (57%)(57%)

> 100 ppb> 100 ppb 4 4 (3%)(3%) 1 1 (1%)(1%)

Media dei positivi Media dei positivi (ppb)(ppb) 27,327,3 24,824,8

Min Min (ppb)(ppb) 33 55

Max Max (ppb)(ppb) 122122 108108

2008 = Nord (51), Centro (32), Sud (53)2009 = Nord (35), Centro (31), Sud (27) Pascale et al., 2010Pascale et al., 2010

Monitoraggio Monitoraggio TT--2/HT2/HT--22 grano grano duro nazionale duro nazionale (2008 e 2009)

(metodo di analisi HPLC-IMA/FD, LOD = 5 ppb (T-2) e 3 ppb (HT-2)

6

TT--2 + HT2 + HT--22

20082008 20092009

n. n. camp.camp.

< 3 < 3 ng/gng/g

33--100 100 ng/gng/g

> 100 > 100 ng/gng/g

Media Media pos. pos.

(ng/g)(ng/g)

n. n. camp.camp.

< 3 < 3 ng/gng/g

33--100 100 ng/gng/g

> 100 > 100 ng/gng/g

Media Media pos. pos.

(ng/g)(ng/g)

NORDNORD 51513333

(65%)(65%)

1818(35%)(35%)

00(0%)(0%)

13,313,3 35352222

(63%)(63%)

1313(47%)(47%)

00(0%)(0%)

10,310,3

CENTROCENTRO 323299

(28%)(28%)

2121(66%)(66%)

22(6%)(6%)

33,533,5 313199

(29%)(29%)

2121(68%)(68%)

11(3%)(3%)

39,539,5

SUD e SUD e ISOLEISOLE

53531313

(24%)(24%)

3838(72%)(72%)

22(4%)(4%)

30,230,2 272788

(30%)(30%)

1919(70%)(70%)

00(0%)(0%)

17,817,8

LOD = 5 ng/g (T-2), 3 ng/g (HT-2)

Monitoraggio Monitoraggio TT--2/HT2/HT--22 grano grano duro nazionale duro nazionale (2008-2009)

Determinazione LCDeterminazione LC--MS/MSMS/MS

Purificazione su colonne Purificazione su colonne ad immunoaffinitàad immunoaffinità

(T(T--2 Test2 Test™™ HPLC, VICAM)HPLC, VICAM)

Purificazione su colonne Purificazione su colonne ad immunoaffinitàad immunoaffinità

(T(T--2 Test2 Test™™ HPLC, VICAM)HPLC, VICAM)

Estrazione(con metanolo:acqua + NaCl)

Filtrazione (Whatman Nº 4)Diluizione con acqua (1:5)Filtrazione (Whatman GF/A)

Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode(cinque ioni monitorati per ogni tossina)

Uso di Standard Interno13C24 T2 toxin e 13C24 HT2 toxin (Biopure, Austria)

Conferma dei risultati mediante LC-MS/MS(20% dei campioni analizzati)

LOD (LC/MS-MS): T-2 = 0,5 ng/g; HT-2 = 0,7 ng/g

Contemporanea presenza di tossina T-2 e HT-2. Livelli di tossina HT-2 in genere più elevati dei livelli di tossina T-2.

Livelli di contaminazione trascurabili (piu’ del 90% dei campioni analizzati erano contaminati a livelli <50 ng/g).

Livelli di tossine T-2 e HT-2 più elevati nei campioni del centro-sud Italia rispetto a quelli del Nord Italia (da confermare).

T2/HT2

+

-

MONITORAGGIO grano duro nazionale MONITORAGGIO grano duro nazionale –– T2/HT2T2/HT2

??

Correlazione tra il contenuto di DON e T-2 + HT-2 in frumento duro (2008)

1 7

13 19 25 31 37 43 49 55 61 67 73 79 85 91 97

103

109

115

121

127

133

S1 S

2

2000

4000

6000

7000

DON (µg/kg)

125

250

375

500

T2+HT2(µg/kg)

625

750

8000875

1000

5000

3000

1000

campioniDON

T2+HT2

7

DONDON2008 + 20092008 + 2009

semolasemola integraleintegrale

Numero di campioni analizzatiNumero di campioni analizzati 145145 2929

Numero di campioni positiviNumero di campioni positivi 113 113 (80%)(80%) 19 19 (66%)(66%)

< 20 ppb (LOD)< 20 ppb (LOD) 32 32 (20%)(20%) 10 10 (34%)(34%)

2020--750 ppb750 ppb 113 113 (80%)(80%) 19 19 (66%)(66%)

> 750 ppb> 750 ppb 0 0 (0%)(0%) 0 0 (0%)(0%)

Media dei positivi (ppb)Media dei positivi (ppb) 112112 157157

Min (ppb)Min (ppb) 2020 4040

Max (ppb)Max (ppb) 530530 410410

TT--2/HT2/HT--22:: tutti i campioni <LOD tutti i campioni <LOD ((<3 ppb T<3 ppb T--2;<5 ppb HT2;<5 ppb HT--2)2)

ATTIVITÀ MONITORAGGIOATTIVITÀ MONITORAGGIOpastapasta nazionalenazionale

(analisi HPLC-IMA/DAD, LOD = 20 ppb)

Pascale et al., 2010

* Valore medio ± SD (n=9), frumento duro contaminato nell’intervallo 0.3 - 13.1 µg/g; ** calcolato sul peso secco.

DO

N (%

)D

ON

(%

)

100

20**

159

37

77 64

33**

0

50

100

150

200

Frumentonon pulito

Frumento pulito Crusca Farinetta Semola Spaghetti Spaghetti

dopo cottura

scartiscarti didi puliturapulitura 414%414%

* Valore medio ± SD (n=9), frumento duro contaminato nell’intervallo 0.3 - 13.1 µg/g; ** calcolato sul peso secco.

DO

N (%

)D

ON

(%

)

100

20**

159

37

77 64

33**

0

50

100

150

200

Frumentonon pulito

Frumento pulito Crusca Farinetta Semola Spaghetti Spaghetti

dopo cottura

scartiscarti didi puliturapulitura 414%414%

Distribuzione (%) del DON nei prodotti e sottoprodotti di molitura

del frumento duro e negli spaghetti prima e dopo cottura (n=9)*

(Visconti et al., 2004)

100

1

295

48

134

2212

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

grano nonpulito

granopulito

crusca farinaccio farinette semola pasta

T-2

+ H

T-2

(%

)

Scarti di pulitura = 597% Scarti di pulitura = 597%

* I valori rappresentano la media (±SD) di 11 livelli di contaminazione nell’intervallo 97-5954 ng/g (esperimenti in quadruplicato).

Distribuzione (%) della somma delle tossine T-2 e HT-2 nelle frazioni di molitura e nella pasta

T-2 + HT-2

(Pascale et al., 2010)

“Modellizzazione di un Sistema Integrato per la gestione della

SiSicurezza curezza AA limentare della limentare della filiera del filiera del FFrumento durorumento duro”

(SINSIAF)

Piano Operativo Nazionale 2000-2006 Progetto MIUR n. 12792

Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera del FRUMENTO DURO

8

Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera dei cereali

“Valutazione e controllo della contaminazione da micotossine

nelle produzioni cerealicole nazionali” (MICOCER)

Programma Interregionale “Sviluppo rurale”, sottoprogramma “Innovazione

e Ricerca” (MIPAAF)

CRA-QCE, Unità di Ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali, ROMA

Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera del FRUMENTO DURO

Monitoraggio dei livelli di tossina T-2 e HT-2 (e di DON) nel grano duro nazionale e nella pasta.

�

Studio dell’effetto dei processi di molitura e pastificazione sulla contaminazione da tossina T-2 e HT-2 nei prodotti e sottoprodotti derivati del grano duro.

�

Selezione di linee grano duro dotate di resistenza alla “fusariosi della spiga”.

�

“FROM SEED TO PASTA”Filiera di ricerca integrata per la produzione

di grano duro di alta qualità

Coordinatore:Coordinatore: Produttori Sementi di BolognaProduttori Sementi di Bologna

Progetto AGER sullaqualità e sicurezza della

filiera del FRUMENTO DURO

“WP5 “WP5 -- Sicurezza delle materie prime e dei Sicurezza delle materie prime e dei trasformati”trasformati”

ISPA-CNR, Bari

UNI - Parma

Metodi Rapidi per la Determinazione di Micotossine in Grano Duro e Prodotti Derivati

Micotossine Nascoste in Grano Duro e Prodotti Derivati

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Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!

“IL MONITORAGGIO DELLE PRODUZIONI NAZIONALI”Bologna, 30 Settembre 2010