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Il monitoraggio biologico della popolazione generale nella stima dellesposizione ad inquinanti atmosferici Prof. Patrizia Corsi

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Gli studi di mutagenesi ambientale sono finalizzati in gran parte all identificazione e quantificazione di agenti genotossici diffusi nell ambiente e potenzialmente pericolosi per l uomo. Gli approcci di biologia molecolare hanno aperte nuove frontiere e potenzialit nel campo del biomonitoraggio ambientale e biologico

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CANCEROGENO CHIMICO IN ANIMALI SOSPETTO CANCEROGENO UMANO / LEGAME CON MALATTIA IDENTIFICAZIONE E SVILUPPO DI METODOLOGIE PER MISURARE BIOMARKERS CHEMIO-SPECIFICI DETERMINAZIONE DELLA RELAZIONE DEI BIOMARKER TRA ESPOSIZIONE E MALATTIA IN ESPERIMENTI ANIMALI RELAZIONE TRA BIOINDICATORI E MALATTIA IN STUDI SU ANIMALI STUDIO TRASVERSALE SUI LIVELLI DI BIOMARKER NEGLI UOMINI ESPOSTI STUDIO LONGITUDINALE SUI BIOMARKER NEGLI UOMINI STUDI CASO-CONTROLLO STUDI A COORTE TRIALS CLINICI MARKER DI RISCHIO VALIDATO MARKER DI ESPOSIZIONE VALIDATO Modello per la validazione di biomarker chemio-specifici

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MONITORAGGIO AMBIENTALE Misurazioni degli agenti mediante campionamenti ambientali allo scopo di determinare il livello di esposizione per via inalatoria e studiare lefficacia delle misure di prevenzione adottate. MONITORAGGIO BIOLOGICO Valutazione dell'esposizione ad agenti cancerogeni presenti nell'ambiente attraverso la misura di indicatori selezionati in campioni biologici prelevati negli esposti secondo precise modalit. Lindicatore pu essere rappresentato dalla sostanza chimica tal quale, da un suo metabolita, da una modifica biochimica di tipo reversibile indotta dall'esposizione all'agente nocivo.

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Il monitoraggio biologico di una popolazione esposta a potenziali agenti genotossici comprende lo studio di diversi biomarcatori (di esposizione, di effetto e di suscettibilit), in riferimento ai vari momenti che intercorrono tra lesposizione e la manifestazione clinica della patologia (Modificata, da Rdiger, 1999.)

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Obiettivi specifici della ricerca sui biomarkers Sviluppo e validazione dei biomarkers RIFLETTERE SPECIFICHE ESPOSIZIONI PREDIRE IL RISCHIO DI MALATTIA NEGLI INDIVIDUI Decaprio AP Biomarkers: Coming of Age for Environmental Health and Risk Assessment Environ Sci Tec 31 (7): 1837-1847, 1997

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VALIDAZIONE DEI BIOMARKERS Relazione dose-risposta Interazione Gene-Ambiente Variabilit inter e intra-individuale Molteplici vie di assorbimento Materiali biologici surrogati/organo bersaglio Relazione temporale Miscele complesse Molteplicit degli addotti

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Le principali vie di esposizione agli xenobiotici

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-The ability of PAH-containing mixtures to induce human cancer has been known since 1775, when the British surgeon Sir Percival Pott demonstrated a correlation between the exposure of chimney sweeps to soot and the incidence of scrotal cancer (Quoted in Natl. Cancer Inst. Monogr. 1963,10:7). -The main sources of human exposure to PAHs are occupation, passive and active smoking, food and water and air pollution - There is a high variation in atmospheric PAHs levels across geographical areas with B(a)P concentrations ranging from 0.01 to 100ng/m 3. The level of exposure to PAHs through this source is low compared to other sources such as diet, occupation or tobacco smoke. -The total intake of carcinogenic PAHs in the general population has been estimated to be 3g/day (Mumtaz MM et al., 1996, Toxicol Ind Health, 12:742 - 971) - Levels of occupational exposure of B(a)P, one of the main PAH compounds, vary widely in different industrial activities and job titles, ranging from 0.1 to 48 000 ng/m 3. -Such elevated exposure are associated with increased risks of lung, skin and bladder cancer (Mastrangelo et al., 1996, Environ. Health Perspect. 104:1166-1170). -In smokers, B(a)P levels range from 0,5 to 7,8 g/100 cigarettes when exposure is from mainstream smoke and from 2,5 to 19,9 g/100 cigarettes when it comes from side-stream smoke. -Levels from passive smoking are lower, ranging from 0.0028 to 0,76 g/m 3 of B(a)P (IARC 1983, Monogr. Eval Carcinog. Risk Chem. Hum. 32:1-453) -Dietary intake of total PAHs has been estimated to be almost 2g/Kg food (IARC 1983, Monogr. Eval Carcinog. Risk Chem. Hum. 32:1-453) with high levels of B(a)P found especially in charcoaled broiled- meat (8g/kg) while in a variety of other food products B(a)P levels from 0.09 to 30g/kg have been reported (Scherer G et al., 2000, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9:373-380)

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La formazione del benzo [a] pirene-7,8-diidrodiolo-9,10-epossido (BPDE), il principale metabolita cancerogeno del benzo [a] pirene, e iI suo addotto al DNA

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Schema del metabolismo ossidativo del benzene

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Le principali vie di eliminazione degli xenobiotici

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La suscettibilit genetica condiziona la risposta di soggetti egualmente esposti

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CYP1A1 CITOCROMO P450 MONOSSIGENASI Sito di restrizione MspI: sostituzione T C d origine al raro allele m 2 GSTM1 Glutatione-S-transferasi di classe : catalizza la coniugazione del glutatione agli epossidi degli IPA La variante allele nullo determina la mancata produzione dellenzima attivo e ridotta efficienza di metabolizzazione di diversi substrati genotossici INDICATORI DI SUSCETTIBILITA GSTT1 Glutatione-S-transferasi di Classe : responsabile della detossificazione di composti alchilanti reattivi degli IPA XPD Xeroderma pigmentosum di Classe D: Sito di restrizione 312: sostituzione Asp Asn, codifica per un enzima coinvolto nel meccanismo del riparo del DNA. La mutazione determina deficit dellattivit enzimatica

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IL PROGRAMMA DI MONITORAGGIO AMBIENTALE E BIOLOGICO Campionamento personale Indicatori di esposizione indicatore di dose biologicamente efficace Indicatori di suscettibilit

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OBIETTIVI Valutare lesposizione a sostanze tossiche attraverso campagne di Monitoraggio ambientale Monitoraggio biologico Validare i dati del monitoraggio biologico sulla base del monitoraggio ambientale

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Esposizione ad IPA e biomarkers di genotossicit in popolazioni residenti a diversa distanza da un insediamento siderurgico TARANTO- Tamburi STATTE ALBEROBELLO LOCOROTONDO

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Lo stabilimento ILVA di Taranto, realizzato in fasi diverse tra il 1961 ed il 1975, tra i pi grandi complessi siderurgici di Europa, lunico a ciclo integrato, con oltre 10.000 occupati diretti. Il combustibile utilizzato il coke, prodotto a partire dal carbon fossile nelle tre batterie che costituiscono la cokeria.

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Materiali e Metodi MONITORAGGIO AMBIENTALE IPA MONITORAGGIO BIOLOGICO 1-IP Stazioni mobili : macchina caricatrice e sfornatrice Campionamenti darea : piano di carica, lato sfornatrice, inversione termica Campionamenti personali : operatore piano coperchi, addetto bariletti, operatore porte, operatori macchine (caricatrice, guida coke, sfornatrice), inversione termica, attrezzista n. 105 LAVORATORI (batteria 3-4: n. 50; batteria 5-6: n. 55) Raccolta di campioni di urina (prima e dopo il turno) Questionario sulle caratteristiche individuali. (fumo, consumo di carne alla brace, assenza dal lavoro ) Analisi statistiche: statistiche descrittive; t-tests per la valutazione delle differenze tra gruppi, dopo log- trasformazione dei dati;analisi di correlazione.

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FASI DELLO STUDIO FASE 1 Identificazione e arruolamento della popolazione. Consenso informato. Preparazione e codifica del questionario. Predisposizione SOP

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FASI DELLO STUDIO FASE 2 Ottenimento del consenso informato Somministrazione del questionario Misura dei livelli ambientali Raccolta e analisi dei campioni biologici

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FASE 1: QUESTIONARIO

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IPA AERODISPERSI Gli IPA aerodispersi e adesi al particolato presenti nella frazione inalabile vengono misurati con campionatore attivo indossato in zona respiratoria durante il giorno, per una durata media di 6 ore, secondo il metodo NIOSH 5506. Fra i 15 idrocarburi i composti non cancerogeni sono: (acenaftene, fluorene, fluorantene, pirene, antracene, fenantrene, crisene, benzo(g,h,i)terilene; quelli definiti cancerogeni dalla IARC: naftalene, benzo(a)antracene, benzo(a)pirene, dibenzo(a,h)antracene, benzo(k)fluorantene, indeno(1,2,3- cd)pirene. BENZENE AERODISPERSO Il campionamento viene effettuato tramite RADIELLO. L'analisi viene effettuata per desorbimento chimico seguito da GC-MS

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Le operazioni di monitoraggio Inizio attivit ore 8:00: consenso informato prelievo ematico (20 ml) campione di urina aliquotazione per IPA urinari posizionamento pompa Fine attivit ore 14:30rimozione pompa questionario

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FASE 1 - SOP: Procedure Operative Standardizzate

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Indicatore biologico di esposizione: IPA 1-idrossipirene urinario L1-idrossipirene urinario (1-IP) un metabolita del pirene. Viene misurato secondo il metodo descritto da Jongeneelen (1987), dopo idrolisi enzimatica dei -glucuronati e/o solfati coniugati, seguita da analisi HPLC con rivelatore fluorimetrico: i risultati sono corretti per il valore della corrispondente creatinina urinaria e sono espressi come microMol/Molcreat. Indicatore biologico di esposizione: Benzene Benzene urinario Il benzene urinario viene determinato mediante microestrazione in fase solida effettuata nello spazio di testa del campione, seguita da analisi gascromatografica con rivelazione di massa (GC/MS).

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Indicatore di dose biologicamente efficace: IPA Gli addotti totali IPA-DNA Il DNA viene isolato dai linfomonociti di sangue periferico secondo la metodica del kit Extragen (Extragen BC by Talent). La determinazione degli addotti viene effettuata attraverso la multidirectional thin-layer chromatography (TLC), utilizzando substrati di polietilammnina-cellulosa (Gupta et al., 1982; Izzotti, 1998), dopo postmarcatura con 32 P. Indicatore di effetto biologico precoce: BENZENE Conta leucocitaria Viene eseguito su campione ematico lesame emocromocitometrico e la conta leucocitaria e piastrinica

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Mogli di fumatoriMogli di non fumatori Media 1-HOP: 0.27 0.06Media 1-HOP: 0.19 0.02 p=0.17 DNA addotti (n./10 8 ): 2.8 0.8DNA addotti (n./10 8 ): 1.1 0.4 p