Il Laboratorio del Il Laboratorio del CSOxCSOx

Moderno ausilio per la Moderno ausilio per la diagnosi ed il diagnosi ed il

monitoraggio clinicomonitoraggio clinicoAndrea BolnerAndrea Bolner

Villa Margherita, 27 settembre 2014Villa Margherita, 27 settembre 2014

Equilibrio Equilibrio Ossigenato/OssidatoOssigenato/OssidatoOssigeno: indispensabile per la vita, condiziona i Ossigeno: indispensabile per la vita, condiziona i

viventi che devono adattarsi a uno stato pro-viventi che devono adattarsi a uno stato pro-ossidanteossidante

GOOD

BAD

ROSROS

Gli ossidantiGli ossidanti Radicali liberiRadicali liberi: : instabili, altamente reattivi, instabili, altamente reattivi,

ad emivita bassissima (10ad emivita bassissima (10-5-5-10-10-9-9 sec), sec), responsabili del danno ossidativo a carico di responsabili del danno ossidativo a carico di macromolecole biologiche (DNA, lipidi, macromolecole biologiche (DNA, lipidi, carboidrati, proteine)carboidrati, proteine) ROSROS = specie reattive dell’ = specie reattive dell’ossigenoossigeno RNSRNS = specie reattive dell’ = specie reattive dell’azotoazoto RGSRGS = specie reattive = specie reattive glucosio-derivateglucosio-derivate

Pro-ossidanti non radicaliciPro-ossidanti non radicalici: : HH22OO22

IDROPEROSSIDIIDROPEROSSIDI

Principali radicali liberiPrincipali radicali liberiROSROS RNSRNS

Ossigeno Ossigeno singolettosingoletto

1O2Monossido di Monossido di azotoazoto

NO

Anione Anione superossidosuperossido

O2- Diossido di Diossido di

azotoazotoNO2

Radicale Radicale idrossileidrossile

HO• PerossinitritoPerossinitrito NO3-

Radicale Radicale peridrossileperidrossile

HO2•

Radicale Radicale alcossilealcossile

RO•

Radicale Radicale idroperossileidroperossile

RO2•

Acido ipoclorosoAcido ipocloroso HClOAcido Acido ipobromosoipobromoso

HBrO

OzonoOzono O3

Stress ossidativo: ruolo fisiologicoStress ossidativo: ruolo fisiologico

Principali sorgenti dei ROSPrincipali sorgenti dei ROS

1.1. Enzimi di membrana NADPH Enzimi di membrana NADPH dipendentidipendenti (Nox 1-5 e Duox 1-2) (Nox 1-5 e Duox 1-2)

2.2. MitocondriMitocondri

3.3. Enzimi intracellulariEnzimi intracellulari: xantina : xantina ossidasi, cicloossigenasi, ossidasi, cicloossigenasi, lipossigenasilipossigenasi

Radicali liberiRadicali liberiLA REAZIONE REDOX (1)LA REAZIONE REDOX (1)

Reazione di OSSIDAZIONE

Reazione di RIDUZIONE

Per ogni specie che si OSSIDA c’è un’altra specie che si RIDUCELe specie che si RIDUCONO sono OSSIDANTILe specie che si ossidano sono RIDUCENTI O ANTIOSSIDANTI

Il ruolo cruciale del LABIl ruolo cruciale del LAB11++22 = = 33

ossidanti + antiossidanti ossidanti + antiossidanti = effetti= effetti

?

SPECIE OSSIDAN

TI

BARRIERA ANTIOSSIDANT

E

12 3

AZIONI DEGLI AZIONI DEGLI OSSIDANTIOSSIDANTI

Uno stress ossidativo è causa di Uno stress ossidativo è causa di ALTERAZIONI MOLECOLARIALTERAZIONI MOLECOLARI

fosfolipidi di membranafosfolipidi di membrana modificazioni delle membranemodificazioni delle membrane capacità di capacità di

compartimentazionecompartimentazione capacità di trasporto selettivocapacità di trasporto selettivo distruzionedistruzione

acidi nucleiciacidi nucleici mutazioni mutazioni alterazioni espressione genicaalterazioni espressione genica

proteineproteine alterazioni di struttura alterazioni di struttura perdita funzioni enzimaticheperdita funzioni enzimatiche perdita funzioni di trasportoperdita funzioni di trasporto perdita funzioni recettorialiperdita funzioni recettoriali

Il ruolo cruciale del LABIl ruolo cruciale del LAB

Radicali ROS, RNS, Radicali ROS, RNS, RGS Non radicali RGS Non radicali HH22OO22

Antiossidanti Antiossidanti ENZIMATICIENZIMATICINON ENZIMATICI endogeniNON ENZIMATICI endogeniNON ENZIMATICI esogeniNON ENZIMATICI esogeni Perossidazione Perossidazione

LIPIDILIPIDIOssidazione Ossidazione PROTEINE PROTEINE Ossidazione DNAOssidazione DNA

12 3

Misura della Misura della Capacità Ossidante TotaleCapacità Ossidante Totale

d-ROMS d-ROMS (Diacron International, (Diacron International, Grosseto)Grosseto)

FORT FORT (Callegari, Parma)(Callegari, Parma)

Capacità ossidante totaleCapacità ossidante totale

Radicals Oxygen Radicals Oxygen Metabolites Test Metabolites Test

(d-ROMs test) (d-ROMs test) Diacron International – Grosseto, ItalyDiacron International – Grosseto, Italy Reazione di FentonReazione di Fenton: i metalli di transizione (es. : i metalli di transizione (es.

Fe) catalizzano la scissione degli idroperossidi Fe) catalizzano la scissione degli idroperossidi (ROOH) in derivati radicalici secondari (ROOH) in derivati radicalici secondari ((alcossilici ROalcossilici RO•• e e perossilici ROOperossilici ROO•• ): questi ): questi reagiscono con un derivato amminico che si reagiscono con un derivato amminico che si trasforma in un catione radicalico colorato.trasforma in un catione radicalico colorato.

ROOH + FeROOH + Fe2+2+ RORO•• + OH+ OH-- + Fe+ Fe3+3+ ROOH + FeROOH + Fe3+3+ ROOROO•• + H+ H++ + Fe+ Fe2+2+ RORO•• + ROO+ ROO•• ++ A-NHA-NH22

RORO-- + ROO + ROO- - + H+ H+ + + [A-NH+ [A-NH22••++]]

Calibrazione con HCalibrazione con H22OO22: risultato in unità CARR o : risultato in unità CARR o mg Hmg H22OO22 /dL equivalenti /dL equivalenti

HCY, DANNO VASCOLARE e HCY, DANNO VASCOLARE e STRESS OSSIDATIVOSTRESS OSSIDATIVO

Meccanismi di istolesività non del tutto notiMeccanismi di istolesività non del tutto noti Dimostrati:Dimostrati:

Antagonismo sintesi e funzione dell’NO Antagonismo sintesi e funzione dell’NO endoteliale (riduzione azione vasodilatante)endoteliale (riduzione azione vasodilatante)

Formazione di anione superossido (OFormazione di anione superossido (O22--)e )e

conseguentemente di perossinitrito conseguentemente di perossinitrito (NO(NO33

--)) Proliferazione fibre muscolari lisce, aumento Proliferazione fibre muscolari lisce, aumento

adesione endoteliale e deposizione LDL adesione endoteliale e deposizione LDL ((correlazione iperHcy e aumento oxLDLcorrelazione iperHcy e aumento oxLDL))

Attivazione piastrinica con adesione e Attivazione piastrinica con adesione e aggregazioneaggregazione

Attivazione fattore V endotelialeAttivazione fattore V endoteliale

ANTIOSSIDANTI ANTIOSSIDANTI ENZIMATICIENZIMATICI o PRIMARIo PRIMARI

Detossificano la cellula Detossificano la cellula dai ROS con reazioni dai ROS con reazioni in cui le in cui le specie specie radicaliche perdono la radicaliche perdono la loro reattivitàloro reattività e e vengono trasformate vengono trasformate in sostanze innocuein sostanze innocue

ANTIOSSIDANTI ANTIOSSIDANTI NON NON ENZIMATICIENZIMATICI o SECONDARIo SECONDARI

Implementano le difese antiossidanti (es. Implementano le difese antiossidanti (es. ripristinando il pool dei tioli) ed agiscono ripristinando il pool dei tioli) ed agiscono di per sé come di per sé come scavengersscavengers

Gli antiossidanti Gli antiossidanti ENZIMATICIENZIMATICI SODSOD OO22

••--

Catalasi, PerossiredoxinaCatalasi, Perossiredoxina HH22OO22 GSH perossidasiGSH perossidasi idroperossidi idroperossidi organiciorganici

GSH reduttasiGSH reduttasi idroperossidi organiciidroperossidi organici GSH S-transferasiGSH S-transferasi substrati substrati ossidatiossidati

Tioredoxina reduttasi, Glutaredoxina e Tioredoxina reduttasi, Glutaredoxina e NucleoredoxinaNucleoredoxina omeostasi redoxomeostasi redox

+ + trasduzione trasduzione + + modulazione modulazione del del segnalesegnale

La nutrizione svolge un ruolo fondamentale nel La nutrizione svolge un ruolo fondamentale nel mantenere l’efficacia delle difese enzimatiche mantenere l’efficacia delle difese enzimatiche

antiossidantiantiossidanti Oligoelementi essenziali (selenio, rame, manganese e zinco) sono Oligoelementi essenziali (selenio, rame, manganese e zinco) sono

coinvolti nella struttura molecolare o nell’attività cataliticacoinvolti nella struttura molecolare o nell’attività catalitica

Gli antiossidantiGli antiossidanti NON ENZIMATICI ENDOGENINON ENZIMATICI ENDOGENI

Glutatione (GSH)Glutatione (GSH) Coenzima Q10 Coenzima Q10

(Ubichinone)(Ubichinone) Acido uricoAcido urico BilirubinaBilirubina MelatoninaMelatonina TioredoxinaTioredoxina

Gli antiossidantiGli antiossidanti NON ENZIMATICI ESOGENINON ENZIMATICI ESOGENI

Vitamine liposolubiliVitamine liposolubili Vitamina AVitamina A (retinolo + 3-deidroretinolo) e (retinolo + 3-deidroretinolo) e

carotenoidi (luteina, zeaxantina)carotenoidi (luteina, zeaxantina) Vitamina EVitamina E ( (-tocoferolo) + famiglia dei -tocoferolo) + famiglia dei

tocoferoli e tocotrienolitocoferoli e tocotrienoli Vitamina K Vitamina K (fitil-menachinone)(fitil-menachinone)

Vitamine idrosolubiliVitamine idrosolubili Vitamina C Vitamina C (acido ascorbico) (acido ascorbico) Acido LipoicoAcido Lipoico

Polifenoli e FlavonoidiPolifenoli e Flavonoidi Micronutrienti (selenio, rame, zinco)Micronutrienti (selenio, rame, zinco)

Misura della Misura della Capacità Antiossidante Capacità Antiossidante

Totale (TAC)Totale (TAC) Liquidi biologiciLiquidi biologici

PlasmaPlasma SalivaSaliva Liquido Liquido

seminaleseminale AlimentiAlimenti

BevandeBevande OliOli Frutta e Frutta e

vegetalivegetali

Antiossidanti non enzimatici endogeniAntiossidanti non enzimatici endogeni

Glutatione (GSH)Glutatione (GSH) tripeptide Glu-Cys-Glytripeptide Glu-Cys-Gly biodisponibilità: dipende da azione biodisponibilità: dipende da azione

di enzimi (GRed, GPx, G6PDH) e di enzimi (GRed, GPx, G6PDH) e disponibilità di cofattori (NADPH, disponibilità di cofattori (NADPH, da vit. PP)da vit. PP)

deficit congenito di G6PDH o GSH deficit congenito di G6PDH o GSH = gravi alterazioni membrana RBC= gravi alterazioni membrana RBC

in molte vie metabolichein molte vie metaboliche coenzimacoenzima substratosubstrato trasporto (aminoacidi, gruppi NH2, trasporto (aminoacidi, gruppi NH2,

peptidi)peptidi) azioniazioni

antiossidanteantiossidante detossificante (alcool, additivi, coloranti, detossificante (alcool, additivi, coloranti,

derivati toluolo, benzolo, etc.)derivati toluolo, benzolo, etc.) chelante (metalli pesanti)chelante (metalli pesanti)

nella frutta e vegetali crudinella frutta e vegetali crudi (avocado, (avocado, cocomero, asparagi, pompelmo, patate, cocomero, asparagi, pompelmo, patate, fragole, pomodori, arance, melone, carote, fragole, pomodori, arance, melone, carote, spinaci, pesche)spinaci, pesche)

Antiossidanti non Antiossidanti non enzimatici esogenienzimatici esogeni

Vitamina Vitamina CC

Vitamina A Vitamina A beta beta CaroteneCarotene

LicopeneLicopene

Perossidazione lipidica Perossidazione lipidica (1)(1)

1)1) Sottrazione HSottrazione H++ da un da un gruppo metilenico adiacente gruppo metilenico adiacente a un doppio legame di un a un doppio legame di un PUFAPUFA

2)2) Formazione di Formazione di radicaleradicale centrato su un atomo centrato su un atomo C•C•

3)3) Riarrangiamento del doppio Riarrangiamento del doppio legame con formazione di un legame con formazione di un dienediene coniugatoconiugato

4)4) Reazione OReazione O22 con radicale C• con radicale C• e formazione di e formazione di radicale radicale perossileperossile ROO• ROO•

5)5) Reazione del radicale Reazione del radicale perossile con altro PUFA e perossile con altro PUFA e formazione di un formazione di un idroperossidoidroperossido (ROOH) + un (ROOH) + un altro radicale centrato sul C•altro radicale centrato sul C•

Perossidazione lipidica Perossidazione lipidica (2)(2)

6)6) Gli Gli idroperossidi idroperossidi lipidicilipidici possono reagire possono reagire ulteriormente e ulteriormente e formare:formare:

perossidi cicliciperossidi ciclici aldeidi aldeidi ---insature -insature

(MDA, acroleina, 4HNE)(MDA, acroleina, 4HNE) pentano ed etanopentano ed etano dieni 2,3 trans-coniugatidieni 2,3 trans-coniugati isoprostaniisoprostani colesterolo-ossidicolesterolo-ossidi

Le aldeidi prodotte da LPO sono chimicamente Le aldeidi prodotte da LPO sono chimicamente reattive vs proteine ed acidi nucleici: reattive vs proteine ed acidi nucleici:

contribuiscono ad amplificare ulteriormente il contribuiscono ad amplificare ulteriormente il danno radicalicodanno radicalico

Misura della Misura della Perossidazione lipidicaPerossidazione lipidica

TBARSTBARS ee MDA MDA fotometria (fotometria (TBA testTBA test), ), HPLC-FL (HPLC-FL (TBA TBA testtest), ELISA, ), ELISA, immuno-istochimicaimmuno-istochimica

4-HNE4-HNE HPLC-FL, immuno-HPLC-FL, immuno-istochimica istochimica ELISA ELISA

F2-isoprostaniF2-isoprostani GC-MS, ELISA, RIAGC-MS, ELISA, RIA Dieni coniugatiDieni coniugati spettrofotometriaspettrofotometria LipoperossidiLipoperossidi GC-MS, GC-MS,

spettrofotometriaspettrofotometria Lp-CHOLOXLp-CHOLOX spettrofotometriaspettrofotometria LDL oxLDL ox ELISA, immuno-istochimicaELISA, immuno-istochimica

Ossidazione proteica (1)Ossidazione proteica (1) Ossidazione di Ossidazione di residui aminoacidiciresidui aminoacidici

Alifatici Alifatici → Gruppi carbonilici→ Gruppi carbonilici

→ → Idroperossidi e perossidi di Idroperossidi e perossidi di Val, Leu, LysVal, Leu, Lys

Aromatici Aromatici → Tyr-derivati→ Tyr-derivati

→ → Trp-derivati (chinurenina)Trp-derivati (chinurenina) Tiolici Tiolici → Met-sulfossido e Met-sulfone → Met-sulfossido e Met-sulfone

→ → Cys disolfuriCys disolfuri Le modificazioni ossidative causano: Le modificazioni ossidative causano:

frammentazioneframmentazione alterazione strutturale alterazione strutturale aggregazioneaggregazione perdita di funzionalitàperdita di funzionalità

Misure di ossidazione Misure di ossidazione proteicaproteica

Carbonili Carbonili spettrofotometria, spettrofotometria, immunoistochimica, immunoistochimica, ELISA, Western ELISA, Western BlotBlot

Prodotti di ossidazione della TyrProdotti di ossidazione della Tyr NONO22-Tyr-Tyr GC-MS, HPLC-UVGC-MS, HPLC-UV Cl-TyrCl-Tyr ELISAELISA Br-TyrBr-Tyr Western Blot, immunoistochimicaWestern Blot, immunoistochimica Tyr-TyrTyr-Tyr LC-MS/MSLC-MS/MS

Prodotti di glicazioneProdotti di glicazione ELISAELISA

Neo-epitopiNeo-epitopi Western Blot, Western Blot, immunoistochimicaimmunoistochimica

Prodotti ossidazione singoli Prodotti ossidazione singoli aminoacidiaminoacidi

Ossidazione del DNAOssidazione del DNA ROS (soprattutto •OH) causano mutazioni ROS (soprattutto •OH) causano mutazioni

di basi e rotture doppia elicadi basi e rotture doppia elica 8-idrossi-deossi-guanosina8-idrossi-deossi-guanosina ( (8-OHdG8-OHdG): ):

marcatore di danno marcatore di danno a carico dei a carico dei solisoli residui di guanina residui di guanina catene nucleotidiche da estratti tissutali: catene nucleotidiche da estratti tissutali: 8OHdG/2dG 8OHdG/2dG

ratioratio plasma: plasma: freefree e e protein-boundprotein-bound urine: urine: freefree

metodi ELISA e HPLCmetodi ELISA e HPLC

Il CSOx LABIl CSOx LABun laboratorio un laboratorio

di di 2° livello2° livello

Il ruolo cruciale del Il ruolo cruciale del CSOx LABCSOx LAB

d-ROMs test Omocisteina

BAP testSODGSH/GSSGVitamina CVitamina EVitamina A-CaroteneLicopene

CHOLOx test 4-HNE3-NT 8-OHdG CoQ10

Quadro Quadro generale generale metabolicmetabolico 35 o 35 parametri parametri + IL-6+ IL-6

1

2

3

Il referto del CSOxIl referto del CSOx

Il referto del CSOxIl referto del CSOx

Il referto del CSOxIl referto del CSOx

Commento Commento al refertoal referto

Stress ossidativo: ruolo fisiologicoStress ossidativo: ruolo fisiologico

Target intracellulari dei Target intracellulari dei ROSROS

I ROS regolano l’attività I ROS regolano l’attività di di tirosina-fosfatasitirosina-fosfatasi per per ossidazione del gruppo –ossidazione del gruppo –SH di alcune Cys reattive:SH di alcune Cys reattive: SulfonazioneSulfonazione (RSO (RSO33H)H) NitrosilazioneNitrosilazione (RSNO) (RSNO) GlutationilazioneGlutationilazione (RSSG)(RSSG) DisolfuriDisolfuri intra- o inter- intra- o inter-molecolari (RSSR)molecolari (RSSR)

Stress ossidativo e tumoriStress ossidativo e tumori

“…“…ROS both accelerate and ROS both accelerate and delay cancer initiation and delay cancer initiation and

progression…”progression…” Azione ossidante-mutagenaAzione ossidante-mutagena = = citotossica, tumorigenica citotossica, tumorigenica

Azione di trasduzione del Azione di trasduzione del segnalesegnale = attivazione di vie = attivazione di vie metaboliche di proliferazione, metaboliche di proliferazione, differenziamento e adattamento differenziamento e adattamento metabolicometabolico

Meccanismo ROS Meccanismo ROS bifasicobifasico: : PRIMAPRIMA citotossico, tumorigenico citotossico, tumorigenico POIPOI di stimolazione e potenziamento di stimolazione e potenziamento

della barriera antiossidante cellulare della barriera antiossidante cellulare (pool GSH e tioredoxina ridotti)(pool GSH e tioredoxina ridotti)

1.1. Lo stress ossidativo è un’ Lo stress ossidativo è un’ alterazione dell’equilibrio alterazione dell’equilibrio omeostaticoomeostatico tra specie ossidanti e barriera tra specie ossidanti e barriera antiossidante;antiossidante;

2.2. Lo stress causa dannoseLo stress causa dannose alterazioni strutturali alterazioni strutturali e e funzionali di proteine, lipidi e DNA;funzionali di proteine, lipidi e DNA;

3.3. Il laboratorio studia e quantifica i Il laboratorio studia e quantifica i 3 elementi in 3 elementi in giocogioco: ROS, barriera antiossidante, danni ossidativi;: ROS, barriera antiossidante, danni ossidativi;

4.4. Valutare i livelli di stress per contrastarne Valutare i livelli di stress per contrastarne l’insorgenza può migliorare lo stato di salute e l’insorgenza può migliorare lo stato di salute e prevenire o rallentare le patologie cronico-prevenire o rallentare le patologie cronico-degenerativedegenerative

GRAZIE PER GRAZIE PER L’ATTENZIONEL’ATTENZIONE

“…Il guerriero della luce presta attenzione alle piccole cose …” Paulo Coelho