il flusso delle informazioni che parte dal DNA nel nucleo ... · il flusso delle informazioni che...
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il flusso delle informazioni che parte dal DNA nel nucleo cellulare
e si concretizza nella sintesi proteica all’interno del citoplasma,
passando per l’intermediario fondamentale mRNA
RNA
Le due piante in alto sono petunie wild-type; mentre le due in
basso contengono transgeni che inducono soppressione sia
del gene endogeno che del transgene, generando zone
bianche prive di pigmento nel fiore.
produzione di fiori di petunia
con una colorazione più
vivace e intensa.
Per raggiungere questo
scopo, introdussero in petunie
rosa alcune copie aggiuntive
del gene decodificante la
chalcone synthase, un
enzima chiave per la
pigmentazione dei fiori nelle
petunie normalmente colorate
in rosa o viola.
molte piantine transgeniche
non avevano gli intensi colori
attesi ma presentavano fiori
con petali parzialmente o
completamente bianchi
la down regulation è dovuta ad un’inibizione
post-trascrizionale dell’espressione genica
tramite un aumento della velocità di
degradazione dell’mRNA
Effetto fenotipico dopo l’iniezione di RNA unc-22 a singolo o doppio filamento nella
gonade di C. elegans. Il gene unc-22 codifica per una proteina contenuta nelle
miofibrille muscolari. È noto che una diminuzione dell’attività di unc-22 provochi una
forte contrazione nei movimenti. L’iniezione di dsRNA, ma non di ssRNA, ha indotto le
contrazioni nella progenie
Iniettarono dsRNA all’interno di
Caenorhabditis elegans, un verme
nematode, individuando un potente
effetto di silenziamento.
Il termine RNA interference fu coniato
in questa occasione. Il C. elegans era un
sistema sperimentale utile poiché
l’origine evolutiva di tutte le cellule di
questo organismo è nota ed è possibile
iniettare RNA in embrioni ai primi stadi
ed osservare i cambiamenti rispetto al
modello durante lo sviluppo.
I principali risultati di tali esperimenti possono essere così
riassunti:
a)il silenziamento genico è indotto efficacemente mediante iniezione di dsRNA, invece
solo debolmente o per nulla in seguito all’iniezione di ssRNA senso o antisenso;
b) il silenziamento è specifico per l’mRNA omologo al dsRNA iniettato, altri mRNA non
sono coinvolti;
c)il dsRNA deve corrispondere alla sequenza dell’mRNA maturo, né la sequenza del
promoter né quelle relative agli introni inducono una risposta. Ciò indica
presumibilmente un meccanismo citosolico post-trascrizionale;
c)l’mRNA selezionato, ovvero omologo al dsRNA esogeno, scompare suggerendo una
sua degradazione;
c)soltanto poche molecole di dsRNA per cellula sono sufficienti a realizzare un
silenziamento totale. Ciò indica che il dsRNA è amplificato e/o agisce cataliticamente
piuttosto che in modo stechiometrico;
c)gli effetti del dsRNA possono diffondersi tra i tessuti e persino alla progenie,
suggerendo una trasmissione dell’effetto tra le cellule.
L’interferenza dell’RNA o RNAi Processo mediante il quale RNAds silenzia, in maniera sequenza-specifica, l’espressione di geni omologhi attraverso l’appaiamento con mRNA bersaglio seguito dalla sua degradazione: silenziamento post-trascrizionale
Meccanismo biochimico conservato (dalle piante ai funghi, agli animali) Probabilmente coinvolge più di 10 geni (analisi genetica) e gruppi di proteine correlate
Funzioni biologiche: -Resistenza ai virus -Silenziamento trasposoni -Regolazione dell’espressione genica
La sua funzione antivirale è dimostrata chiaramente in piante (e insetti) dalla presenza nei virus di geni che codificano soppressori dell’RNAi, importanti per la virulenza, mentre non è ancora provata nei vertebrati
La sua funzione di silenziamento dei trasposoni è dimostrata dall’osservazione che l’inattivazione di geni coinvolti nell’RNAi nei nematodi causa l’attivazione di molti trasposoni della linea germinale
Cosa sono i miRNA
• Sono piccoli RNA non codificanti costituiti da circa 22 nucleotidi
• La loro scoperta risale al 1993
• Il primo mi-RNA fu identificato nel nematode C.elegans
• Successivamente furono ritrovati sia nelle piante che negli animali
• Oggi si ritiene che il numero complessivo di geni codificanti per mi-RNA rappresenti circa lo 0.5-1% del numero di geni codificanti per proteine
Funzione
• Agiscono a livello post-trascrizionale
• Inibiscono la traduzione dei propri bersagli
Biogenesi
• Generalmente i geni codificanti per miRNA sono trascritti nel nucleo dalla RNA-polimerasi II che dà vita a lunghi trascritti,i pri-miRNA,che presentano il cap e la poliadenilazione
• Questi ultimi vengono processati da un’RNasi III,Drosha,e dal suo cofattore,Pasha
• Si ottengono così trascritti di circa 70 nucleotidi,detti pre-miRNA
• Successivamente le proteine RAN-GTP ed exportin 5 trasportano i pre-miRNA dal nucleo al citoplasma,dove un’altra RNasi III,Dicer,li processa per generare molecole di RNA duplex di circa 22 nucleotidi,dette miRNA:miRNA*
• Queste molecole vengono,poi,caricate nel complesso miRISC (miRNA-associated multiprotein RNA-induced silencing complex)
• I miRNA maturi a singolo filamento vengono poi mantenuti all’interno del complesso
Meccanismo d’azione
• I miRNA possono avere due modi diversi d’agire a seconda della complementarietà che vi è tra il miRNA e il suo target
1.Complementarità imperfetta
• I miRNA bloccano l’espressione dei loro geni target a livello post-trascrizionale
• Per inibire la traduzione legano solitamente le regioni non tradotte al 3’(3’ UTR), per le quali presentano omologia
2.Complementarità perfetta
• I miRNA che legano i loro RNA bersaglio con complementarietà perfetta inducono il taglio del bersaglio che,quindi,non può più essere tradotto
• In questo caso i miRNA trovano la loro regione di omologia o nell’ORF(open reading frame) o nella sequenza codificante
siRNA e miRNA
• GLI siRNA rappresentano un’altra classe di piccoli RNA non codificanti
• Gli siRNA e i miRNA,pur presentando numerose analogie in termini di struttura e biogenesi,svolgono funzioni essenzialmente diverse
• Gli siRNA agiscono principalmente determinando la degradazione del mRNA bersaglio attraverso un meccanismo definito RNA interference(RNAi)
• Molecole di siRNA si producono a partire da lunghe molecole di RNA bicatenario prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula,quali trasposoni,virus o transgeni.
• RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l’invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma
• siRNA agiscono solo per complementarietà perfetta per cui ogni siRNA può avere un unico mRNA bersaglio
• Diversamente,i miRNA costituiscono una numerosa classe di geni endogeni filogeneticamente conservati,la cui funzione è di inibire l’espressione genica principalmente attraverso l’inibizione della traduzione
• Ogni miRNA,per il suo caratteristico meccanismo d’azione può avere più di un mRNA bersaglio
• L’espressione temporale e tessuto-specifica di miRNA suggerisce che i miRNA svolgono un importante ruolo in svariati processi biologici,quali sviluppo e differenziamento cellulari.
• Inoltre alcuni possono avere una funzione oncogena ed altri oncosoppressoria
DICER Le ribonucleasi III sono enzimi della classe delle idrolasi, che catalizzano il taglio endonucleolitico di un 5'-fosfo-monoestere
DICER è coinvolta nella degradazione di lunghe molecole di RNA a doppio filamento (dsRNAs) e di pre-microRNA (miRNA) in filamenti di 21 nucleotidi (gli siRNA) durante il processo della RNA interference
Ognuno presenta almeno cinque regioni specifiche: una regione amminoterminale dipendente da ATP; una regione a piattaforma carica positivamente (rosso); una regione PAZ (Giallo), che si associa alla proteina Argonaute2; due o più domini RNAsi III (verde); una regione carbossiterminale in grado di legare molecole di dsRNA.
DICER
Si ritiene che la distanza tra la regione PAZ ed i domini RNAsi III sia di 65 angstrom, quanto basta per alloggiare circa 25 nucleotidi. Tale spazio sarebbe costituito proprio dalla regione piattaforma che, carica positivamente, è in grado di instaurare legami elettrostatici con l'RNA. Secondo tale analisi, dunque, la struttura di dicer potrebbe essere quella di una specie di righello molecolare, che permetterebbe all'enzima di produrre frammenti di siRNA di dimensione estremamente regolare.
Ago2 AGO2-contained within the RISC complex-contains two domains:
PIWI: The PIWI domain is a conserved domain within the Argonaute family. The C-Terminus of this domain is required for endonuclease activity.
PAZ: The PAZ domain is also a conserved domain within the Argonaute family. It is located near the center of the AGO2 protein and provides grooves substrate binding
RNA Interference (RNAi) is initiated by DICER an RNase III Enzyme, which uses an RNA endonuclease activity to cleave double stranded RNA into 20-23 nt fragments known as miRNA. This cleavage is important because it provides 3’overhangs on each strand of the miRNA. miRNA binds to a heterodimer of R2D2 and Dcr-2 proteins. Once bound the R2D2/Dcr-2 initiator complex is formed. The 5’end of the RNA interacts with Dcr-2 forming the pre-RISC complex, which is the inactive form. TRBP is an integral component of a Dicer-containing complex. TRBP is required to recruit Ago2 protein to interact with the bound miRNA. Ago2 protein actives the pre-RISC complex, converting it into holo-RISC by binding to the double stranded miRNA, which is double stranded. Once Ago2 is bound, it degrades one strand from the RNA (the passenger strand), while selectively retaining the guide strand. The holo-RISC complex recognizes mRNA with sequences complementary to the guide strand and binds to them. Once mRNA is bound, it is degraded.
Complesso RISC.
Il disegno che mostra l'RNA antisenso (il filo giallo nel
diagramma) legato al dominio PAZ, mentre in arancione si ha
l'mRNA ad esso complementare
microRNA as regulators of signal transduction
miRNA regulation has been described in various physiological and pathological processes, in particular developmental processes and cancer
miRNA are important regulators of all hallmarks of cancer, including cell growth and cell cycle control, evasion of apoptosis, tissue invasion and metastasis, angiogenesis
miRNA are key players in signal transduction and partecipate in various stages of the signal transduction process. Signal transduction mediators respond to signals in a dose-dependent manner. miRNA can serve as mediators of signaling robustness either by amplifying a signal or by buffering and balancing the signal response.
Akt signaling in prostate cancer
Akt, also known as Protein Kinase B
(PKB), is a serine/threonine protein kinase that plays a key role in multiple cellular processes such as glucose metabolism, cell proliferation, apoptosis, transcription and cell migration.
BAD: pro-apoptotica
CDKN1A: cyclin-dependent kinase inhibitor 1A
mTOR: serine/treonine kinase
PTEN: phosphatase
Analisi in silico mediante algoritmo TargetScan 5.1
VHL signaling in renal cell carcinoma
EP300: E1A binding protein p300
CBP: CREB binding protein
HIF1: Hypoxia inducible factor 1
VEGF signaling in renal cell carcinoma
siRNA nella ricerca di base
RNA a doppio filamento viene sintetizzato con una sequenza complementare
al gene d’interesse e introdotto in una cellula o organismo, dove è riconosciuto
come materiale genetico esogeno e attiva il processo della RNAi.
Effetto: drastico calo nell’espressione del gene target e studiando gli effetti di
questa diminuzione si può ricavare il ruolo fisiologico del gene prodotto.
Ovviamente questa tecnica non è applicabile al silenziamento di geni
essenziali la cui inattivazione comprometterebbe la vitalità della cellula. Dal
momento che RNAi non abolisce totalmente l’espressione del gene viene
chiamata tecnica knockdown.
Applicazioni:
siRNA in biotecnologia
sviluppo di piante che producano bassi livelli di tossine
naturali così che possano essere introdotte nell’alimentazione.
1) i semi di cotone sono ricchi delle proteine che devono essere assunte con la dieta,
ma contengono un prodotto tossico, il gossipolo, rendendoli inutilizzabili per il
consumo umano. RNAi è stata utilizzata per produrre stock di cotone i cui semi
contengono ridotti livelli di delta-cadinene synthase, un enzima chiave nella
produzione di gossipolo, senza influenzare la produzione dell’enzima in altre parti
della pianta dove il gossipolo è importante nella prevenzione di danni da parassiti
delle piante .
2) riduzione dei livelli di allergeni nelle piante di pomodoro e la riduzione dei
precursori di carcinogeni nelle piante di tabacco.
3) studio recente di un nuovo un anti-zanzare.
Si utilizzano nanoparticelle per somministrare RNA a doppio filamento alle larve
di zanzara nel momento in cui si cibano. l’interferenza RNA è stata utilizzata per
silenziare il gene responsabile della produzione della chitina, la principale
componente dell’esoscheletro negli insetti, nei crostacei e negli aracnidi.. Poiché il
dsRNA si diluisce velocemente, non può in teoria essere somministrato
direttamente e per questo si ricorre all’utilizzo delle nanoparticelle. Il gruppo ha
notato che facilitano l’ingestione, perché non si dissolvono e stabilizzano anche
siRNA nella ricerca medica
l’interferenza dell’RNA non si verifica direttamente sul DNA, ma
solo sulla sua copia (mRNA): potrebbero essere scavalcati tutti i
problemi legati all’etica
l’intervento non comporterebbe la sostituzione in blocco del gene
malato, ma la distruzione del suo intermedio di RNA, bloccando la
produzione della proteina responsabile della disfunzione.
Interrompendo il flusso dell’informazione “malata” si interverrebbe
pertanto in modo etico e queste terapie farmacologiche sarebbero
considerate alla stregua dei medicinali attualmente in commercio.
Attualmente si stanno sviluppando diverse terapie basate su RNAi
tanto che recentemente sono stati riportati i successi di numerosi
esperimenti pilota. Questi sviluppi recenti nelle applicazioni
terapeutiche di RNAi sono senza dubbio imputabili al
superamento di problematiche correlate con la veicolazione in
vivo dei siRNA.
Problematiche riguardanti la veicolazione in vivo
Un’iniezione di nanoparticelle deve:
evitare la filtrazione, fagocitosi e
degradazione nel flusso sanguigno (a);
essere trasportato attraverso l’endotelio
del vaso sanguigno (b);
diffondere nella matrice extracellulare ©;
essere internalizzato dentro la cellula (d);
evitare l’endosoma (e);
e rilasciare i siRNA (f) [71].
Barriere fisiologiche alla distribuzione
sistemica di nanoparticelle di siRNA.
Varie strategie di veicolazione in vivo di farmaci basati su siRNA sia veicolazione specifica che non specifica.
modificazioni chimiche a livello della posizione 2’ del
ribosio, per esempio mediante metilazione o fluorurazione,
in quanto portano ad un aumento della stabilità dei siRNA
iniezione intravenosa di siRNA chimicamente modificati o
coniugati con il colesterolo o immagazzinati all’interno di
particelle liposomiali protettive:
uptake cellulare del siRNA attraverso il processo di
endocitosi mediata recettorialmente
incorporare l’acido nucleico in una carrier:
Attenzione alle caratteristiche di superficie!
L’aggiunta di PEG può migliorare le interazioni di carica e le
dimensioni per prevenire le aggregazioni.
accoppiamento dei siRNA terapeutici con frammenti di
anticorpi e aptameri o impacchettati in nanoparticelle
rivestite con ligandi che hanno come bersaglio i recettori:
incorporazione dei siRNA tramite l’endocitosi.
È possibile progettare ligandi strutturati di RNA noti come
aptameri che possono legarsi con specifici recettori della
superficie cellulare e coniugarli covalentemente a siRNA per
il rilascio cellulo-specifico in vivo. Le molecole di siRNA
vengono rilasciate dall’aptamero durante il processo di
ingresso all’interno della cellula.
Vectors for shRNA expression
• Plasmid vector
• Lentiviral vector
-genomic insertion
-permanent
The long terminal repeat (LTR) is the control center for gene expression.
• Adenoviral vector
- transient expression
- no genomic insertion