METAFASE(Allineamentodei cromosomiall'equatoredel fuso)

DECISIONEDI INIZIARELA MITOSI

(//r %rosi

PROFASE(Demolizione dell'involucronucleare; formazione del fuso:condensazione dei cromosomi)

DUPLICAZIONEDEL DNAE DEL CENTROSOMA

CROMOSOMA

FUSOMITOTICO

DNA

ANAFASE(Segregazionedei cromosomi)

TELOFASE E CITOCHINESI(Divisione detnuclecr e del resto della cellula)

' «START»(La cellula decidese duplicare il DNA)

SINTESI PROTEICAE CRESCITA ININTERROTTA

SINTESI PROTEICAE CRESCITA CELLULARE

CENTROSOMA(Centro di organiz-zazione del fuso)

Il ciclo cellulare, che culmina nella riproduzione delle cellule, com-prende tipicamente due fasi: l' interfase, durante la quale la cellulaaumenta di dimensioni, e la mitosi, durante la quale il nucleo e poiil resto della cellula si dividono. (Sotto il profilo temporale. la mi-tosi occupa circa il 40 per cento del ciclo nelle cellule di embrioninelle fasi iniziali dello sviluppo e meno del 10 per cento nella mag-

•

gior parte delle altre cellule.) Sovente il ciclo include due punti ditransizione, sottoposti a una regolazione ben precisa. In uno diquesti punti, la transizione START («partenza»), la cellula stabi-lisce se deve duplicare o meno il proprio DNA. Nell'altro pun-to la cellula decide quando entrare in mitosi. La proteina cdc2 èla principale regolatrice del passaggio attraverso entrambi i punti.

Il controllo del ciclo cellularePur conoscendo bene i processi biologici che danno origine a nuovecellule, si comincia solo ora a capire che il principale fattore di regolazionedel ciclo cellulare è un'unica proteina presente in tutti gli organismi

sultati di Masui e Smith, è necessariodescrivere sommariamente lo sviluppodelle uova di anfibio (si veda l'illustra-zione alle pagine 34 e 35). I precursoridelle cellule uovo, gli oociti, si formanonell'ovaio e hanno piccole dimensioni.Nell'ovaio avviene anche la duplicazionedei cromosomi e una crescita senza divi-sione che accresce di parecchie volte lamassa dell'oocita. A questo punto gli oo-

citi possono restare «congelati» in que-sto stadio fino a quando un segnale or-monale non li stimola inducendoli acompiere gli stadi iniziali della meiosi.Divenuti cellule uovo, vengono liberatidall'ovaio. Se avviene la fecondazioneda parte degli spermatozoi, la meiosi vie-ne completata e subito dopo comincia averificarsi una successione di cicli mito-tici cellulari.

Masui e Smith scoprirono che gli oo-citi di Xenopus che subiscono la meiosicontengono una sostanza in grado di in-durre lo stesso processo anche in oociti«immaturi», cioè in quegli oociti chehanno completato la crescita, ma nonhanno ancora ricevuto il segnale ormo-nale che dà il via alla meiosi. Dato chela meiosi viene spesso indicata come pro-cesso di maturazione, Masui denominò

di Andrew W. Murray e Marc W. Kirschner

G

ià all'inizio di questo secolo gliscienziati avevano identificatogli eventi fondamentali del ci-

clo cellulare: la crescita e la divisione diuna singola cellula in cellule figlie. Ep-pure ancora di recente sapevano ben po-co su che cosa regolasse quel ciclo, chenegli esseri umani ha un'importanza vi-tale non soltanto per la riproduzione, maanche per la crescita, la riparazione deitessuti, l'immunità e per un'infinità dialtri processi.

Ma negli ultimi cinque anni si è giuntia un sorprendente risultato: sembra chela regolazione del ciclo negli eucarioti(gli esseri viventi le cui cellule sono do-tate di nucleo vero e proprio, diversi cioèdai batteri e dai virus) dipenda in note-vole misura da modificazioni dell'attivitàdi un'unica molecola, la proteina cdc2.

Questa scoperta è emozionante nonsolo perché pone in una nuova luce unproblema che per decenni ha disorienta-to i biologi molecolari, ma anche perchéuna comprensione più completa della re-golazione del ciclo cellulare potrebbeavere profonde implicazioni in medici-na. Da una parte, la ricerca potrebbemettere a punto nuovi procedimenti perindurre la proliferazione cellulare, ne-cessaria per ricostruire organi o tessutilesi (inclusi, forse, i neuroni che dopo ladifferenziazione embrionale perdono lacapacità di dividersi). Dall'altra, la mi-glior comprensione del ciclo potrebbecontribuire alla messa a punto di metodiper arrestare la riproduzione indiscrimi-nata delle cellule neoplastiche.

In un certo senso, la storia recente del-la ricerca sul ciclo cellulare ricorda la co-struzione negli Stati Uniti della ferroviatranscontinentale, durante la quale duegruppi separati procedettero faticosa-mente per unire finalmente i loro binaricon un bullone d'oro a PromontoryPoint, nello Utah, nel 1869. Nel casodella cellula, biochimici e fisiologi dauna parte e genetisti dall'altra hannofinito per raggiungere una soddisfacen-te concordanza d'idee una ventina d'an-

ni dopo essersi avventurati su filonidi ricerca distinti.

uando i due gruppi di scienziati co-minciarono le ricerche sul ciclo cel-

lulare, avevano una base di conoscenzacomune. Per esempio, nel XIX secolomicroscopisti e altri ricercatori avevanostabilito che il ciclo consiste di due fasiprincipali: l'interfase e la mitosi (si vedal'illustrazione nella pagina a fronte).

Durante l'interfase il nucleo cellularerimane intatto. La cellula continua a cre-scere accumulando una quantità di ma-teriale sufficiente per due cellule; poi,poco prima di dividersi, duplica anchei propri cromosomi che, costituiti daDNA e racchiusi nel nucleo, sono la sededei geni.

Nella mitosi il nucleo si divide in due.In primo luogo, l'involucro che proteg-ge il nucleo si rompe e i cromosomi du-plicati si muovono lungo una struttura,il fuso mitotico, che ha la funzione disegregare i cromosomi, assicurando aogni nucleo figlio una copia di ciascuncromosoma. In seguito intorno ai duenuovi corredi cromosomici si forma uninvolucro nucleare, dopodiché il restodella cellula, compreso il citoplasma, sidivide formando due cellule figlie com-plete, geneticamente identiche alla cel-lula madre (si veda l'articolo I! fuso mi-totico di J. Richard McIntosh e Kent L.McDonald in «Le Scienze» n. 256, di-cembre 1989).

Nelle cellule sessuali (gameti) un altroprocesso, la meiosi, prende il posto dellamitosi. Nel corso della riproduzione ses-suale si forma un nuovo individuo perfusione di una cellula uovo con uno sper-matozoo. Pertanto, se le generazionisuccessive delle cellule di un organismodevono contenere lo stesso numero dicromosomi delle cellule dei genitori, lacellula uovo e lo spermatozoo devonoavere un numero di cromosomi dimez-zato. Questo dimezzamento è realizzatodalla meiosi, processo in cui i precursoridelle cellule uovo e degli spermatozoi

subiscono per due volte, in rapida suc-cessione, la segregazione dei cromoso-mi, senza che nell'intervallo questi ulti-mi si duplichino. Nei maschi i precursorisi dividono simmetricamente, dando ori-gine a quattro spermatozoi, mentre nellefemmine la divisione è asimmetrica e dàorigine nella maggior parte dei casi a unagrossa cellula uovo e a tre cellule picco-lissime che vengono eliminate.

Già vent'anni fa era inoltre chiaro cheil ciclo cellulare deve essere soggetto auna mirabile regolazione. Un tipo di re-golazione consiste nel controllo delle di-mensioni cellulari. Alla fine della mitosile cellule somatiche figlie appena forma-te hanno le stesse dimensioni che avevala cellula madre nel momento della suaformazione, il che significa che questacellula è in grado di controllare la pro-pria divisione in modo che essa abbialuogo proprio quando la massa cellularesi è raddoppiata.

Le cellule devono anche coordinare idiversi eventi del ciclo. Per esempio, de-vono evitare di entrare in mitosi o inmeiosi fino a quando i loro cromosominon si sono duplicati; in caso contrario,potrebbero generare cellule mancanti diun cromosoma particolare, aberrazioneche può provocare la morte delle celluleoppure talvolta dare il via a una loro de-generazione maligna. Quello che rima-neva poco chiaro era il modo in cui lecellule siano in grado di coordinare lasegregazione dei cromosomi con la loroduplicazione e, inoltre, a sincronizzarequesti due processi con la crescita dellacellula.

Nel 1971 Yoshio Masui, allora allaYale University, e L. Dennis Smith, al-lora all'Argonne National Laboratory,compirono un passo da gigante verso lasoluzione di questo problema: indipen-dentemente l'uno dall'altro, identifica-rono nelle uova del rospo africano Xeno-pus laevis una sostanza che sembra con-trollare sia l'inizio della mitosi sia quellodella meiosi.

Perché possano essere compresi i ri-

LE SCIENZE n. 273, maggio 1991 3332 LE SCIENZE n. 273, maggio 1991

CRESCITA SENZA DIVISIONE;DUPLICAZIONE DEL DNA

N, i• • FEMMINA,-.;, DI XENOPUS.„..tru

CROMOSOMA

9OOCITA

DISTACCO DEL PRIMOGLOBULO POLARE

SEGNALEORMONALE

GLOBULOPOLARE

L'OOCITA ATTRAVERSA PARTE DELLA MEIOSI CICLI MITOTICI SENZA CRESCITADELLE CELLULE REINTEGRANO LE DIMENSIONICELLULARI ORIGINALI

I NUCLEI DELL'UOVOE DELLO SPERMATO-ZOO SI FONDONO

LA MEIOSISI COMPLETA

LIBERAZIONEDALL'OVAIO:FECONDAZIONE

SPERMATOZOO

DISTACCO DEL SECONDOGLOBULO POLARE

GIRINO

) CICLI MITOTICINORMALI CON CRE-SCITA CELLULARE

EMBRIONE

L'uov o di Aenopus si contrae, aumentando la propria altezza,quando comincia la mitosi (a e c); quindi, durante l'interfase (b ed), la contrazione scompare. Essa si verifica anche se viene rimosso

il nucleo, a dimostrazione che, almeno in certi tipi di uova, il ciclocellulare è regolato da un «oscillatore» autonomo, una serie direazioni chimiche autoperpetuantisi che avvengono nel citoplasma.

Nello sviluppo di Xenopus si hanno due tipi di cicli cellulari. Le cel-lule che diventeranno uova, gli oociti, sono prodotte nell'ovaio do-ve duplicano il loro DNA e si accrescono. Quando un segnale ormo-

nale innesca la meiosi, una divisione cellulare specializzata che dàorigine a cellule con un corredo cromosomico dimezzato rispetto alnormale, gli oociti si dividono asimmetricamente. Metà dei cromo-

somi si dirige verso una minuscola cellula, il globulo polare, che vie-ne eliminata. Quindi l'oocita inizia una nuova serie di divisioni edè emesso dall'ovaio come cellula uovo matura, la quale, se viene fe-

condata, completa la meiosi, eliminando un secondo globulo pola-re. Successivi cicli mitotici portano alla formazione del girino e poidell'adulto. Mitosi e meiosi sono controllate dalle stesse molecole.

la sostanza «fattore che promuove la ma-turazione» (MPF, dall'inglese matura-tion promoting factor).

In seguito altri ricercatori hanno tro-vato che lo stesso fattore è attivo in tuttele cellule in mitosi studiate, incluse quel-le dei lieviti, degli invertebrati marini edei mammiferi. Pertanto è risultato evi-dente che I'MPF, il cui isolamento è av-venuto solo nel 1988, è una sostanza re-golatrice importante sia della mitosi siadella meiosi.

Considerando che la mitosi e la meiosicomportano un gran numero di cambia-menti nel nucleo (per esempio, la forma-zione del fuso), è parso ragionevole sup-porre che gli eventi che si svolgono nelnucleo possano influenzare i meccanismiresponsabili del ciclo cellulare, tra i qua-li l'attività dell'MPF. Tuttavia, KokiHara e Peter Tydeman del LaboratorioHubrecht di Utrecht, nei Paesi Bassi, euno di noi (Kirschner) hanno trovatoelementi che sembrano contraddire que-sta ipotesi.

I dubbi sono sorti quando i ricercatorihanno tentato di scoprire la causa di unaspettacolare contrazione che ha luogonelle uova di Xenopus non appena iniziala mitosi. Si è pensato che la contrazionesia legata al processo di divisione cellu-lare , ma sorprendentemente essa conti-nua a intervalli regolari anche quando lamitosi viene arrestata. Questa periodi-ca ricomparsa della contrazione non vie-ne bloccata né se si impedisce la forma-zione del fuso mitotico né se si rimuoveil nucleo.

Queste osservazioni hanno fatto con-cludere al gruppo di ricerca che il ciclocellulare nelle uova dell'anfibio non sitrova sotto il controllo di eventi che sisvolgono nel nucleo. Al contrario essoprocede grazie a un «oscillatore» (odorologio) autonomo, un insieme di rea-zioni chimiche che si svolgono nel cito-plasma e che, proprio con la regolaritàdi un orologio, producono le contrazioniperiodiche della cellula uovo, control-

lando anche presumibilmente altri a-spetti della mitosi.

Questo oscillatore controlla realmen-te l'attività dell'MPF? John C. Gerharte Michael Wu dell'Università della Cali-fornia a Berkeley, assieme a uno di noi(Kirschner), hanno dimostrato che ef-fettivamente I'MPF ha un'attività flut-tuante: è sempre riconoscibile durante lamitosi ma non appare mai durante l'in-terfase. Inoltre l'oscillazione dell'attivitàsi mantiene anche quando i processi nelnucleo vengono sconvolti.

Ulteriori studi hanno fornito indizi sucome avvenga la regolazione dell'MPF.I primi esperimenti hanno dimostratoche le uova di Xenopus appena feconda-te contengono riserve dei materiali ne-cessari per la duplicazione del DNA e lacostruzione del fuso mitotico; pertanto,durante un certo numero di cicli mitoticiche seguono immediatamente la fecon-dazione, non hanno la necessità di pro-durre ex novo queste sostanze. Nono-stante le riserve è comunque necessarioche durante l'interfase le cellule produ-cano determinate proteine citoplasmati-che, altrimenti la mitosi non può pren-dere il via. Sperimentalmente è stato pe-rò dimostrato che, nelle cellule bloccatein interfase per inibizione della sintesiproteica, l'introduzione di un estrattogrezzo di MPF attivo può ovviare allamancanza della sintesi proteica e dareugualmente il via alla mitosi.

Quest'ultimo risultato ha contribuitoa confermare che l'MPF è l'induttorenormale della mitosi. Ha anche indicatoche l'una o l'altra delle proteine sinte-tizzate nel citoplasma durante l'interfaseè essenziale per l'attivazione di questofattore.

Mentre gli studiosi di biologia cellula-re raccoglievano prove in favore

dell'ipotesi che l'alternanza di interfasee di mitosi fosse generata da reazioni chi-miche attivate autonomamente nel cito-plasma, i genetisti accumulavano altre

prove in favore di un quadro totalmentediverso. Secondo i loro dati, il ciclo cel-lulare deve essere considerato come unacatena di montaggio accuratamente re-golata. In un sistema lineare di questogenere il completamento di un evento,come la duplicazione del DNA nel nu-cleo, sarebbe necessario per innescarel'evento successivo (per esempio l'iniziodella mitosi), proprio come, in una seriedi tessere del domino, la caduta di unatessera dipende da quella delle tessereprecedenti. Le due teorie, chiamate tal-volta teoria dell'orologio e teoria del do-mino, sembravano incompatibili tra lo-ro, ma alla fine i dati contraddittori chele sostenevano hanno trovato un puntod'incontro.

Una ventina d'anni fa, Leland FI.Hartwell dell'Università di Washingtonaprì la strada all'indirizzo genetico del-le ricerche sul ciclo cellulare compien-do esperimenti con il lievito Saccharo-myces cerevisiae. Questo organismo u-nicellulare differisce da molte altre cel-lule per il fatto che non si divide stroz-zandosi a metà. Al contrario, dopo averduplicato il proprio DNA nel corso del-l'interfase, emette una gemma e in que-sto modo dà inizio alla mitosi. La gemmacresce ininterrottamente, così come fa lacellula madre, e quindi si separa, deter-minando la fine del ciclo cellulare dellievito.

Hartwell cominciò il suo studio iden-tificando forme mutanti di Saccharo-myces cerevisiae «bloccate» in punti spe-cifici del ciclo cellulare e suppose checiascuna di esse riflettesse un'alterazio-ne a carico di un gene il cui prodottodoveva essere d'importanza cruciale nelsuperare il punto di arresto. (Ciascun ge-ne contiene istruzioni per sintetizzareuna determinata proteina.) Tutti questigeni di grande importanza sono oggi de-nominati collettivamente «geni del ciclodi divisione cellulare» (geni cdc).

Ordinando i mutanti in base al mo-mento in cui si blocca il loro ciclo cellu-

lare, Hartwell chiarì quale debba esserela sequenza normale secondo cui i genicdc entrano in azione. Dimostrò inoltreche l'inizio di certe fasi dipende dal com-pletamento di una o più fasi precedenti;per esempio, riuscì a stabilire che la finedella mitosi dipende dall'assemblaggiodel fuso.

Stimolati dalle scoperte di Hartwell,Paul Nurse e collaboratori, che lavora-vano allora all'Università di Edimbur-go, effettuarono studi analoghi su un al-tro lievito. Schizosaccharomyces pom-be, che ha un ciclo cellulare molto piùsimile a quello delle cellule somatichedei mammiferi. Nel corso dell'interfasela cellula cilindrica di questo lievitoraggiunge una lunghezza doppia di quel-la originaria; quindi, alla fine della mi-tosi, si divide in due cellule di ugualedimensione.

Come aveva fatto Hartwell in prece-denza, Nurse identificò innanzitutto mu-tanti che si «bloccano» in fasi specifichedel ciclo cellulare; poi decifrò la sequen-za normale di attivazione dei geni cdcassociati a essi.

Uno di questi geni, cdc2, rivestiva unparticolare interesse perché sembravache il corretto svolgimento della sua at-tività avesse un'importanza cruciale per

l'avvio della mitosi. Certe mutazioni delgene cdc2 erano responsabili della pro-duzione di una versione inattiva dellaproteina e quindi impedivano alle celluledi entrare in mitosi. Al contrario, altremutazioni avevano come conseguenza laproduzione di una forma di proteina cheinduce le cellule a entrare in mitosi inanticipo rispetto al normale.

Il prodotto del gene cdc2 si ponevaindubbiamente come valido candidatoalla qualifica di regolatore principaledella mitosi; forse era addirittura lo stes-so MPF. Poiché questo fattore non eraancora stato isolato, Nurse non poté sta-bilire se esso coincidesse o meno con laproteina cdc2. Tuttavia poteva tentare distabilire se anche il gene cdc2 fosse im-portante in altre cellule, il che avreb-be indicato che la proteina cdc2 potes-se essere un regolatore universale dellamitosi.

Nurse e David H. Beach, entrambi in

I I quel periodo all'Università del Sus-sex, in Inghilterra, iniziarono a studiareuno per uno i geni di Saccharomyces ce-revisiae per vedere se qualcuno di essifosse in grado di «soccorrere» mutantidi Schizosaccharomyces pombe, bloccatiin interfase dall'inattivazione del gene

cdc2. In effetti, l'introduzione di uno diquesti geni permise a quei mutanti di en-trare in mitosi. È risultato poi che il «soc-corritore» era già stato identificato inSaccharomyces cerevisiae da Hartwellcome membro della famiglia cdc.

A questo punto Nurse effettuò unesperimento ancora più ambizioso, in-troducendo segmenti di DNA umano incellule di Schizosaccharomyces pombeche contenevano geni cdc2 inattivi. L'in-serimento di un segmento particolare diDNA umano indusse la mitosi, indican-do così che anche le cellule umane pos-siedono una forma del gene cdc2. Quan-do, nel 1987, sono state finalmente defi-nite le sequenze amminoacidiche deiprodotti dei geni cdc2 umano e di lievito,è risultato che esse erano notevolmentesimili. Un miliardo di anni di evoluzioneha conservato questa proteina di fonda-mentale importanza, producendo lievicambiamenti nella sua struttura, ma nonmodificandone affatto la funzione.

Si sa oggi che la proteina cdc2 haun'importanza decisiva per la mitosi intutti gli eucarioti. Tutte le sue versionisono chiamate allo stesso modo, indi-pendentemente dagli organismi dai qualiprovengono.

In base alla loro struttura chimica, le

34 LE SCIENZE n. 273, maggio 1991

LE SCIENZE n. 273, maggio 1991 35

ISOLAMENTODELCITOPLASMA

NUCLEO

NUCLEOIN INTERFASE

DIVISIONENUCLEARE

37 GRADICELSIUS BLOCCO DEL CICLO CELLULARE

n

MITOSI INTERFASE

(

e

\ MUTANTICDC28 _J

CICLINAALTREPROTEINE

MITOSI INTERFASE MITOSI INTERFASEINTERFAS

Oscillazioni nel livello della ciclina sono state identificate nelle uova di riccio di mare, incui la proteina aumenta nell'interfase e diminuisce nella mitosi. La scoperta che la ciclinaè l'unica proteina il cui livello oscilla durante il ciclo cellulare ha fatto pensare che essa pos-sa contribuire a regolare l'inizio della mitosi. In effetti la ciclina è un regolatore: influen-za l'attività della proteina cdc2, che insieme con la ciclina fa entrare in mitosi le cellule.

25 GRADI CELSIUS

LIEVITONORMALE

proteine cdc2 sono state identificate co-me proteinchinasi, ossia enzimi che tra-sferiscono gruppi fosfato dall'ATP (ade-nosintrifosfato), un importante traspor-tatore di energia, alle proteine. Recen-temente è stato chiarito che l'aggiunta erimozione di gruppi fosfato è un mezzomolto importante per regolare l'attivi-tà delle proteine cellulari. La rimozio-

BLOCCODEL CICLOSUBITO DOPOLA MITOSI

ne viene effettuata da enzimi particolari,le fosfatasi.

A mano a mano che progredivano glistudi genetici, anche gli studi sull'MPFfacevano segnare progressi. In partico-lare Manfred J. Lohka e James L. Mallerdella Medical School dell'Università delColorado si sono dedicati con molto im-pegno al tentativo di purificare tale fat-

tore. Molti, prima di loro, avevano fal-lito, ma nel 1988 essi riuscirono a isolar-ne una piccola quantità e a stabilire chela sostanza è formata da due molecoleproteiche.

A questo punto, benché la sequenzaamminoacidica delle due molecole pro-teiche non fosse ancora nota, diversi ri-sultati indicavano che una delle proteinefosse proprio la proteina cdc2. Per esem-pio, la cdc2 aveva lo stesso peso mole-colare di una delle due componenti del-I'MPF la quale, a sua volta, era ricono-sciuta da anticorpi specifici per le protei-ne cdc2 umana e di lievito.

Più o meno nel medesimo periodo,Beach e collaboratori dimostrarono chein cellule umane in coltura la proteinacdc2 è attiva durante la mitosi. In seguitonumerosi altri gruppi, servendosi di me-todi diversi, hanno confermato l'uno in-dipendentemente dall'altro che la pro-teina cdc2 è di fatto una componentedell'MPF. Quest'ultimo risultato è statoil «bullone d'oro» che ha permesso dicollegare i due filoni di ricerca, quellosulle uova di Xenopus e quello sui mu-tanti dei lieviti, e ha prospettato la pos-sibilità che la regolazione a livello fon-damentale del ciclo cellulare sia simile intutti gli eucarioti.

I a convergenza era soddisfacente, ma1--a non del tutto. La scoperta che laproteina cdc2 è una componente del-l'MPF non spiegava perché questo fatto-re sia attivo durante la mitosi, ma nondurante l'interfase.

In tutti i tipi cellulari studiati si eratrovato che la concentrazione della mo-lecola cdc2 rimane costante per tutto ilciclo cellulare. Questa costanza signifi-cava che qualcos'altro - forse la secondacomponente dell'MPF - attiva e inattivala cdc2 e pertanto regola l'attività del-I'MPF. Presumibilmente quest'altra so-stanza viene sintetizzata ex novo duranteogni interfase; come abbiamo già accen-nato all'inizio, si era in effetti notato chela sintesi proteica è essenziale per l'atti-vazione dell'MPF.

Questa linea di ragionamento era cer-tamente una base razionale per indagaresul problema dell'attivazione dell'MPF.Ma, in realtà, l'identificazione della mo-lecola attivante è stata possibile a seguitodi una fortunata scoperta fatta casual-mente anni prima che la proteina cdc2fosse riconosciuta come una componen-te dell'MPF.

All'inizio degli anni ottanta Tim Huntdell'Università di Cambridge stava te-nendo il corso annuale di fisiologia alMarine Biological Laboratory di WoodsHole, nel Massachusetts. Insieme ai suoiallievi, egli stava indagando sui cambia-menti spettacolari nei livelli di sintesiproteica che hanno luogo dopo la fecon-dazione delle uova di riccio di mare.

Il gruppo di Hunt trovò che la quantitàdi quasi tutte le proteine neosintetizzateaumenta ininterrottamente dopo la fe-condazione. Una proteina invece scom-

CENTRIFUGA-ZIONE DEL-L'ESTRATTO

CELLULAUOVO

SOLUZIONETAMPONE

pare improvvisamente a ogni mitosi, peraccumularsi di nuovo durante l'interfa-se. Hunt chiamò ciclina questa stranasostanza.

Il gruppo dimostrò in seguito che laciclina viene prodotta a velocità costantedurante tutto il ciclo cellulare. Scomparealla fine della mitosi perché viene de-gradata rapidamente, mentre nell'inter-fase si accumula perché è demolita mol-to più lentamente di quanto venga pro-dotta. Questo andamento fluttuante fa-ceva pensare che proprio la ciclina po-tesse essere la molecola che regola l'at-tività dell'MPF.

Esperimenti eseguiti nel 1986 da JoanV. Ruderman della Harvard Universityhanno avallato questa ipotesi. Utilizzan-do molluschi bivalvi della famiglia deimactridi, il gruppo della Ruderman haestratto l'RNA messaggero per la cicli-na, cioè copie di RNA del gene per que-sta proteina che servono da stampi perla sua sintesi. Quindi questo RNA mes-saggero è stato iniettato in oociti diXenopus immaturi. Gli oociti andavanoincontro alla meiosi, il che implicava duecose: che l'RNA veniva tradotto in cicli-na e (dato ancora più significativo) chela proteina poteva di fatto contribuire aregolare il ciclo cellulare.

Oggi si sa che la ciclina è la secondacomponente dell'MPF e che partecipaall'attivazione della proteina cdc2 e dun-que dell'MPF. Rimaneva però ancora dastabilire il ruolo esatto che essa ha nelciclo cellulare.

pe r poter fare passi avanti nella ricerca

sulla ciclina, i biologi dovevano in-nanzitutto rendere più accessibile allamanipolazione sperimentale il ciclo cel-lulare. Attorno al 1987 il nostro grup-po e, indipendentemente, ChristopherC. Ford e collaboratori dell'Universitàdel Sussex hanno escogitato un modoper raggiungere questo scopo. Entrambihanno ottenuto estratti di uova di Xeno-pus in grado di svolgere, in provetta, tut-te le fasi di numerosi cicli cellulari, ivicomprese la duplicazione del DNA. lamitosi e le oscillazioni dell'attività del-I'MPF a esse associate (si veda l'illustra-zione in questa pagina).

Se il ciclo cellulare è davvero semplice

CENTRIFUGA-ZIONE DELLEUOVA

CITOPLASMA

TUORLO

al punto che la ciclina è l'unica proteinaoscillante che deve essere prodotta dinuovo a ogni ciclo perché questo possacontinuare a funzionare, bisognava riu-scire a dimostrare che lo svolgimento delciclo prosegue anche quando la sintesi ditutte le proteine, esclusa la ciclina, vienebloccata e, d'altra parte, che l'inibizionedella sola produzione di ciclina è in gra-do di bloccare il ciclo cellulare a livellodell'interfase.

Abbiamo verificato la prima ipotesidistruggendo tutto l'RNA messaggeropresente negli estratti di uova di Xeno-pus. Poiché le proteine sono sintetizzatea partire dall'RNA messaggero che fun-ge da stampo, il sistema non solo non èpiù riuscito a produrre nuove proteine,ma non è neppure stato in grado di av-viare la mitosi. A questo punto doveva-mo verificare se la reintegrazione dellaproduzione della sola ciclina era suffi-ciente ad avviare la mitosi.

Abbiamo così introdotto RNA mes-saggero per la ciclina ottenuto da ricci dimare e cortesemente inviatoci da Hunt.Come prevedevamo, abbiamo potutoosservare che i nuclei entravano in mito-si, indicando così che l'RNA era statotradotto in proteina e che questa protei-na aveva indotto la mitosi negli estrattibloccati all'interfase. Quando veniva ag-giunta un'ulteriore quantità di RNA perla ciclina, la velocità di sintesi di questaproteina aumentava, mentre diminuivala durata dell'interfase.

Hunt e i suoi allievi hanno verificatoinvece la seconda previsione, secondocui l'incapacità di sintetizzare ciclinaprodurrebbe un blocco della mitosi. An-che qui si è avuta una conferma. Quandonegli estratti di uova di Xenopus si im-pediva la produzione della ciclina, manon quella di tutte le altre proteine,gli estratti si fermavano allo stadio diinterfase.

Nei nostri studi abbiamo osservato,proprio come era accaduto a Hunt conle uova di riccio di mare, che la ciclina siaccumula durante l'interfase e viene di-strutta alla fine della mitosi. La sua bru-sca degradazione ci ha fatto ipotizzareche le cellule non siano in grado di por-tare a termine la mitosi fino a quando laciclina non è del tutto scomparsa. In ef-

INSERIMENTODI NUCLEIDI SPERMATOZOI

Il lievito Saccharomyces cerevisiae si moltiplica per gemmazione (in alto). Alcuni suoi mu-tanti sensibili alla temperatura non riescono a completare un certo stadio del ciclo cellularedopo essere stati incubati a 37 gradi Celsius, a causa di un'alterazione in un gene di im-portanza cruciale per il passaggio attraverso questo stadio. Per esempio, il mutante illu-strato nelle due file in basso si blocca in un punto specifico dell'interfase, indipendente-mente dal momento del ciclo cellulare in cui la temperatura è stata aumentata. Studi com-piuti su questi mutanti hanno permesso di identificare la famiglia di geni, denominati cdc(geni del ciclo di divisione cellulare), il cui prodotto controlla l'avanzamento del ciclo stesso.

Estratti ottenuti dalle uova di Xenopus (qui sopra) possono essere indotti a compiere inprovetta tutte le diverse fasi del ciclo cellulare. La validità di questo metodo per studiareil ciclo della cellula è messa chiaramente in luce dalle microfotografie a destra, nelle qualiil nucleo è colto durante l'interfase e nei vari stadi della mitosi. I cromosomi appaionobianchi e blu; il fuso mitotico, che segrega i cromosomi nel corso della mitosi, è rosso.

36 LE SCIENZE n. 273, maggio 1991 LE SCIENZE n. 273, maggio 1991 37

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IL RISCHIO SISMICO, curato da Enzo Boschi,un'équipe interdisciplinare analizza

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In questo numero:

Il rischio sismico di V. PetriniLa difesa dai terremoti di F. BarberiRischio sismico e beni culturali di A. HuberI moti violenti del suolo durante i terremoti di A. RovelliProprietà della litosfera terrestre di R. Sabadini e G. SpadaPlasticità delle rocce e meccanismo dei terremoti di M. Bonafede e M. DragoniI grandi terremoti medievali in Italia di E. Guidoboni ed E. BoschiLa previsione dei terremoti di E. Boschi e M. DragoniLa valutazione della pericolosità sismica in Italia di E. MantovaniLa previsione statistica dei terremoti di F. Mulargia e P. GasperiniDeformazioni crostali e sismicità di V. Achilli e P. BaldiGeografia sismica in Italia di C. Gasparini e A. TertullianiTomografia sismica per l'area italiana di A. Amato e B. AlessandriniMacrozonazione sismica del territorio italiano di P. Favali, G. Scalera e G. SmriglioI nuovi strumenti della sismologia di D. Giardini, A. Morelli e G. RomeoLa rete sismica nazionale di R. Console, B. De Simoni, F. Mele e Q. TaccettiIl controllo delle aree sismogenetiche con reti locali di A. Basili e M. CoccoIl terremoto dell'Irpinia: 10 anni di ricerche di E. Boschi, D. Pantosti e G. ValensiseI maremoti di S. Tinti

Nel modello che rappresenta il meccanismo con cui viene esercita-to il controllo sulla mitosi nelle uova di Xenopus, una forma diciclina si accumula durante l'interfase e si associa con la proteinacdc2 per formare il pre-MPF, una forma inattiva dell'MPF (fattoreche promuove la maturazione). Gli enzimi trasformano poi il com-plesso in MPF attivo, che dà il via alla mitosi e attiva gli enzimi che

degradano la ciclina. Quando quest'ultima proteina è stata distrut-ta, I'MPF scompare e gli enzimi che degradano la ciclina diventanoquiescenti. La ciclina può così accumularsi nuovamente. In diversialtri tipi cellulari studiati, anche il passaggio attraverso la tran-sizione START è sottoposto a una precisa regolazione da parte diun complesso costituito da cdc2 e da una seconda forma di ciclina.

ENZIMACHEDEGRADALA CICLINA,INATTIVO

uMPF ATTIVA GLI ENZIMI —CHE DEGRADANO LA CICLINA

fetti, quando abbiamo indotto le uova diXenopus o gli estratti da esse ottenuti aprodurre una versione incompleta dellaciclina, ancora in grado di indurre la mi-tosi ma non più degradabile, le uova egli estratti hanno perso la capacità diportare a termine la divisione nucleare esono rimasti bloccati alla mitosi.

Così, intorno al 1989, gli esperimenticondotti in vari laboratori lasciavano or-mai ben pochi dubbi sul fatto che la de-gradazione della ciclina sia uno stadioimportante nello svolgimento della mi-tosi e che la ciclina stessa debba essereprodotta ex novo a ogni interfase per at-tivare l'MPF, per indurre la mitosi e perdirigere il ciclo cellulare.

In che modo la ciclina attiva l'MPF o, più specificamente, la frazione cdc2

dell'MPF? Risulta evidente che la purae semplice unione della ciclina e dellaproteina cdc2 non è di per sé sufficientead attivare il complesso. Altre reazionidevono modificare sia la cdc2 sia la cicli-na prima che l'MPF diventi funzionale.

Le proteine coinvolte nel controllo di

queste modificazioni sono state identifi-cate dal punto di vista sia genetico siabiochimico. Una molecola particolar-mente interessante, scoperta con metodigenetici, è la cdc25. È interessante per-ché il suo accumulo, anziché quello dellaciclina, determina il momento in cui haluogo la mitosi in certe cellule, per esem-pio nelle cellule di embrioni di dittero inuna fase tardiva dello sviluppo e nel lie-vito Schizosaccharomyces pombe. Lasintesi della ciclina è ugualmente neces-saria, ma è la velocità di accumulo dellacdc25, e non della ciclina stessa, a deter-minare quando la cdc2 diventa attiva. Lacdc25 è dunque il «fattore che limita lavelocità», fattore che è in grado di rego-lare il momento di inizio della mitosi.

Questo risultato evidenzia un puntoimportante. Anche se la proteinchinasicdc2 è il regolatore fondamentale del ci-clo cellulare nelle cellule eucariote e an-che se le molecole che modificano la pro-teina cdc2 sono apparentemente le stes-se in tutte le cellule, i particolari del mec-canismo di controllo della proteina pos-sono variare da organismo a organismo

e da cellula a cellula all'interno di unsingolo organismo. In alcuni casi lacdc25 può controllare l'attivazione delcomplesso ciclina-cdc2. In altri casi è lastessa ciclina a controllare l'attivazione;in altri casi ancora, la chiave è probabil-mente costituita da modulatori che de-vono essere ancora identificati.

Non possiamo ancora descrivere neiparticolari la regolazione del ciclo cellu-lare in tutti gli organismi, ma possiamoperlomeno proporre un modello per ilcaso più semplice: l'uovo di Xenopus ap-pena fecondato. Il livello della proteinacdc2 viene mantenuto in ogni momentocostante. La ciclina invece viene prodot-ta di continuo, ma la sua concentrazionesi innalza durante l'interfase e si abbassadurante la mitosi. Quando la ciclina siaccumula, si combina con la cdc2 e for-ma il cosiddetto fattore pre-MPF. Que-sta forma non è ancora attiva, cioè nonpuò trasferire gruppi fosfato alle protei-ne né indurre mitosi.

Il pre-MPF viene quindi trasformatoin MPF attivo da enzimi come la cdc25.Una volta attivato, l'MPF funge sia da

umile esecutore sia da deus ex machina,dando inizio direttamente e indiretta-mente a tutti gli eventi della mitosi. Peresempio, si è trovato che avvia la demo-lizione dell'involucro nucleare. Nel pri-mo ruolo fosforila direttamente le pro-teine dell'involucro; nel secondo ordinaad altre molecole di eseguire i suoi ordi-ni: scatena una cascata di interazioni tramolecole che culmina nell'ulteriore tra-sferimento di gruppi fosfato alle protei-ne dell'involucro. La fosforilazione fa sìche queste si dissocino consentendo ladisintegrazione dell'involucro.

L'MPF attivo non solo controlla i pro-cessi che sfociano nella divisione fisicadel nucleo e del resto della cellula (comel'assemblaggio del fuso), ma attiva an-che gli enzimi che degradano la ciclina.La mitosi si conclude quando il livello diciclina scende al di sotto di un valoresoglia ancora da determinare. Senza ci-clina, la proteina cdc2 (e quindi I'MPF)non può rimanere attiva.

A mano a mano che l'MPF perde diefficacia, le fosfatasi hanno la meglio erimuovono qualsiasi gruppo fosfato dicui l'MPF abbia provocato il legame conle proteine durante la mitosi. Nel casodelle proteine dell'involucro, la rimozio-ne dei gruppi fosfato porta alla ricostitu-zione spontanea dell'involucro nucleare.Le fosfatasi inibiscono anche gli enzimiche l'MPF aveva attivato, tra cui gli en-zimi che degradano la ciclina. L'inattiva-zione di quegli enzimi che distruggono laciclina, combinata con la sintesi ininter-rotta di ciclina, permette a questa so-stanza di accumularsi di nuovo durantel'interfase. E il ciclo cellulare può cosìricominciare.

NIelle uova di Xenopus i cambiamenti

nei livelli di ciclina hanno luogo in-dipendentemente da qualunque eventoche si svolga nel nucleo; questo ha fattopensare che in esse esista un oscillatoreautonomo in grado di attivare il ciclo cel-lulare. Ma, come hanno indicato gli stu-di di natura genetica, nella maggior par-te delle altre cellule sono gli eventi chesi svolgono nel nucleo a regolare le fasidel ciclo cellulare. Sia i lieviti sia le cel-lule somatiche degli organismi pluricel-lulari possiedono meccanismi che servo-no a ritardare l'avvio della mitosi fino aquando il DNA non sia stato duplicatoe gli eventuali danni alla sua molecolanon siano stati riparati. Analogamentetali cellule non cominciano a segregare iloro cromosomi durante la mitosi fino aquando ogni cromosoma non si sia di-sposto correttamente all'equatore delRiso mitotico.

Pertanto sia la teoria dell'orologio siaquella del domino sono corrette: dipen-de dal tipo di cellula che si sta esaminan-do. Per le cellule somatiche la secondateoria sembra la più appropriata. In altreparole, l'oscillatore che da solo regola ilciclo cellulare nelle uova di Xenopus èassoggettato a un sistema elaborato dicontrolli e di equilibri.

38 LE SCIENZE n. 273, maggio 1991 LE SCIENZE n. 273, maggio 1991 39

PROTEINADELL'INVOLUCRO

(099..Q.Q_Q_ULQ99..

Q.Q.Q.Q.Q.Q99.

FOSFORILAZIONEDIRETTA

DI DUE SITICASCATA

INVOLUCRONUCLEARE(PROTEINE

POLIMERIZZATE)

Possiamo avanzare ipotesi sul modo incui, in queste cellule, gli eventi nuclea-ri influenzerebbero l'attività dell'MPF.Per esempio, la duplicazione incompletadel DNA durante l'interfase potrebbegenerare un segnale che blocca l'accu-mulo della ciclina o della cdc25 o diun'altra cdc affine. Così pure, è pensa-bile che un attacco non corretto dei cro-mosomi al fuso durante la mitosi provo-chi un segnale che blocca temporanea-mente la degradazione della ciclina.

Queste retroazioni regolatrici e i pro-cessi biochimici che ne stanno alla basenon sono gli unici perfezionamenti chedevono essere introdotti in un modellocompleto del controllo del ciclo cellula-re. Oggi si sa che nelle cellule somatichee negli embrioni giunti a uno stadioavanzato dello sviluppo la decisione diduplicare il DNA nell'interfase è sogget-ta a una rigida regolazione, proprio co-me la decisione di iniziare la mitosi. Inun modello completo si deve includere ilmeccanismo che consente di prendereanche quest'ultima decisione.

Questa seconda stazione di controlloè stata identificata per la prima volta daHartwell, che l'ha definita transizioneSTART («partenza»). Hartwell ha an-che dimostrato, nel lievito Saccharo-myces cerevisiae, che è proprio durantequesta transizione che la cellula valuta seè cresciuta abbastanza per poter proce-dere senza rischi alla duplicazione delDNA e, da qui, alla mitosi. (Quando lecellule non dispongono di sostanze nu-tritive di solito bloccano il ciclo cellulare

FOSFORILAZIONEDEL TERZO SITO

proprio a livello di questa transizione.)Il passaggio attraverso la transizione

START è controllato così come lo è l'i-nizio della mitosi. Anche qui l'avan-zamento dipende dall'attivazione dellaproteina cdc2 la quale, a sua volta, è le-gata all'accumulo di ciclina. Ma la ciclinacoinvolta in questa transizione non è lastessa che appare nella mitosi. Esistonoin effetti due classi di cicline: una regolal'avvio delle fasi di mitosi e meiosi men-tre l'altra, strutturalmente simile, regolala duplicazione del DNA.

Il passaggio attraverso la transizioneSTART è anch'esso sottoposto al con-trollo di sostanze nutritive, di ormoni edi fattori di crescita, che intervengonosul precedente accumulo di ciclina. Con-trariamente alla situazione che si verificanelle uova di Xenopus, in cui la regola,alla fine di un ciclo mitotico, consiste nelpassare attraverso un altro ciclo di divi-sione, la maggior parte delle cellule con-clude automaticamente il ciclo nell'in-terfase, a meno che non riceva istruzionispecifiche dall'esterno per passare un'al-tra volta attraverso il punto START.

Non deve sorprendere l'esistenza dimolti livelli di controllo del ciclo cellula-re nella maggioranza delle cellule. Gliorganismi pluricellulari, in particolare,devono mantenere controlli ed equilibriper coordinare gli eventi del ciclo cellu-lare e per adeguarli alle esigenze dell'or-ganismo intero. La capacità di regolareil momento in cui le cellule cresceranno,si divideranno e si differenzieranno incellule specializzate ha un'importanza

decisiva per il corretto sviluppo dell'em-brione e per lo stato di buona salute e,in definitiva, la sopravvivenza degli or-ganismi adulti.

progressi realizzati nella ricerca inquesti ultimi vent'anni, e in partico-

lar modo negli ultimi cinque, sono as-solutamente straordinari. I regolatoridel ciclo cellulare nelle uova di Xeno-pus e nei lieviti (cdc2, ciclina e modula-tori come la cdc25) sembrano avere lamedesima funzione in tutte le celluleeucariote.

Eppure le cellule che hanno fornito ilmaggior numero di informazioni sonoper molti aspetti casi particolari. Le uovadi Xenopus sono virtualmente insensibiliai controlli extracellulari che intervengo-no sui cicli di altre cellule. E i lieviti sonoorganismi completi in sé. Ora le indaginidovranno procedere al di là di questi si-stemi semplici per consentire una miglio-re comprensione di come la cdc2, la ci-dia e i loro regolatori interagiscano coni segnali extracellulari negli organismipluricellulari. Solo allora sarà possibilecomprendere malattie come il cancro, incui il controllo sui regolatori in qualchemisura va perso.

Un'altra priorità in questo settore diricerca consiste nell'approfondire il mo-do in cui il complesso ciclina-cdc2 parte-cipa ai vari eventi della divisione cellu-lare: per esempio, come contribuisceesattamente ad avviare l'assemblaggiodel fuso o la condensazione dei cromo-somi? Su quali enzimi agisce il comples-so e che cosa precisamente fanno questienzimi durante la mitosi? Quali sono isegnali che modulano l'attività del com-plesso quando qualcosa va di traversonel nucleo durante la mitosi? Con un po-co di fortuna, queste domande troveran-no una soddisfacente risposta nelle pros-sime ricerche sul ciclo cellulare.

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GRUPPOFOSFATO

S-3,qLE PROTEINE SI DISSOCIANO:

„s'il L'INVOLUCRO VIENE DEMOLITO

"ttts

Uno dei meccanismi con cui I'MPF contribuisce ad avviare la mitosi è la demolizionedell'involucro nucleare. Esso addiziona gruppi fosfato alle proteine polimerizzate checostituiscono l'involucro sia direttamente, fosforilando due siti, sia indirettamente, in-nescando una cascata di reazioni che alla fine inducono un altro enzima a fosforilare unterzo sito. Questa alterazione delle proteine dell'involucro provoca la loro dissociazione.

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