Il compartimento naturale dell’immunità innata Dr. Luigi Lembo Fazio Sapienza Università di Roma...

Il compartimento naturale dell’immunità innata

Dr. Luigi Lembo FazioSapienza Università di RomaDipartimento di Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin”

Riconosce gli organismi estranei “invasori”

Previene/limita la loro diffusione

Eradica la loro presenza nell’organismo

Ritorna ad uno stato quiescenteinstaurando una condizione di protezione duratura(memoria immunologica)

Il sistema immunitario: la funzione

Ma non solo….

È un sistema integrato di cellule professionali che collaborano e comunicano al fine di mantenere l’omeostasi

• Esistono due fondamentali sistemi di riconoscimento e di difesa, correlati tra loro: quello dell’immunità innata, detta anche naturale o nativa, in quanto pre-esistente all’esposizione agli agenti microbici o alle macromolecole estranee, e quello dell’immunità adattativa.

• La combinazione di questi due sistemi fornisce un’efficiente difesa contro i microrganismi patogeni o più in generale contro qualsiasi agente che venga riconosciuto come “non-self”

I due tipi di immunità…un po’ di storia Immunita’ innata o naturale controllo/pronta risposta (fase precoce) limitazione dell’infezione

Immunita’ adattativa o acquisita eradicazione più lenta (fase tardiva) dell’infezione Immunità di lunga durata

Innata AdattativaAPC

Immunità innata

• È un meccanismo di difesa dell’ospite contro le infezioni, altamente conservato

• Si ritrova in tutti gli organismi pluricellulari (al contrario dell’immunità adattativa che è presente solo nei vertebrati)

• Prima linea di difesa sempre attiva che può indurre l’attivazione del compartimento dell’immunità adattativa

• Fornisce protezione verso una grande varietà di patogeni in quanto manca di specificità

• È in grado di distinguere tra self e non-self

Immunità innata e adattativaProprietà Innata Adattativa

Recettori Fissati nel genomaNon è necessario il riarrangiamento

Codificati in segmenti geniciIl riarrangiamento è necessario

Distribuzione Non clonaleTutte le cellule di una classe identica

ClonaleTutte le cellule di una distinta classe

Ligandi Molecole conservate Singoli elementi di molecole

Discriminazione self-non self

Perfetta: selezionata durante l’evoluzione

Imperfetta: selezionata nelle cellule somatiche dell’individuo

Tempo di azione Immediata attivazione degli effettori Ritardata attivazione degli effettori

Risposta Molecole co-stimolatorieCitochine (IL-1b, IL-6)Chemochine (CXCL-8)

Espansione clonaleCitochine effettrici (IL-4, IFN-g)

Innata Acquisita

• Barriere chimico-fisiche Epiteli

Muco

pH

Temperatura

Complemento Anticorpi

Recettori circolanti

Recettori di membrana

Recettori intracellulari

• Molecole circolanti

Fagociti: Macrofagi Linfociti T e B

cellule dendritiche (DC)

PMN’s, cellule NK

• Componente cellulare

Citochine Citochine

(IL-1, IL-6, TNF-α) (IL-2, IFN-γ)

• Mediatori solubili

Tessuti linfoidi associate alle mucose (MALT)

Anticorpi nelle secrezioni

L’immunità innata e l’immunità adattativa: similitudini e differenze

I meccanismi dell’immunità innataImmunità

innata

Barriere Chimico-fisiche

e strutturali

Epiteli Cellule ciliate

MucopH

Cellule

Fagociti

MacrofagiPMN’s

MonocitiCellule NK

Mediatori solubili

Citochine eProteine della fase

acuta

IFN-α IL-1 IL-6

TNF-α

Molecole Circolanti e

Recettori

Complemento e

PRRs

PRRs di membrana

PRRs circolantiPRRs citosolici

Le strutture batteriche

Rappresentazione schematica delle componenti batteriche: i PAMPs e i fattori di virulenza

LPS

Peptidoglicano / Lipoproteine

CpG DNA Flagelli

LPS

CpG DNA

Flagelli

Tossine

Plasmide

Sistema di secrezione

PAMPs Fattori di virulenza

A B

Quali le strutture di interesse?

La parete batterica

• Protezione dai danni di tipo osmotico (più importante)

• Determina e mantiene la forma del batterio• Protegge dalle offese meccaniche• Funzione immunitaria

Il batterio non

scoppia!!

Organizzazione della parete dei batteri Gram+ e Gram-

Organizzazione della parete dei batteri Gram-

Organizzazione della parete dei batteri Gram+ e Gram- [1]

GRAM+

• Spesso peptidoglicano; anche 40 strati concentrici 40-80% del peso secco

• Altri componenti oltre al peptidoglicano: acidi teicoici, acidi teicuronici, proteine, carboidrati intercalati nel peptidoglicano

GRAM –

• Sottile peptidoglicano; pochi strati concentrici (2-3) 5% del peso secco pochi legami crociati

• Altri componenti oltre al peptidoglicano: organizzati a formare una struttura complessa all’esterno della mureina: la membrana esterna

Il lipopolisaccaride (LPS)

L’LPS: un po’ di storia [1]

Klebs

Postula l’esistenza di una sostanza pirogena in microrganismi da lui indicati

come “Microsporon septicum” responsabili della maggior parte dei decessi dei

militari.

Panum

Ipotizza l’esistenza di una tossina pirogena, nel materiale in putrefazione,

non volatile, resistente al calore e solubile in acqua.

L’LPS: un po’ di storia [2]

Richard Pfeiffer (1858–1910)Lisati di batteri precedentemente uccisi al calore (V. cholerae) erano in grado di indurre una reazione di shock tossico quando somministrati nel modello del guinea pig.

Postula l’esistenza di un principio tossico, resistente al calore, che definisce Endotossina

William B. Coley (1862–1936)Trattamento del sarcoma mediante somministrazione Streptococci Gram positivi e batteri Gram negativi (S. marcescens) vitali o inattivati con il calore.

Tossina di Coley: questo primo tentativo di terapia vaccinale portava a una completa remissione dei tumori.

L’LPS: generalità

Endotossine (per distinguerle dalle esotossine)

Molecole anfifiliche stabili al calore (massa di 10 kDa)

Componente essenziale della membrana esterna di batteri Gram-negativi,

commensali e patogeni:

E. coli, S. typhimurium, N. meningitidis, H. influenzae, B. pertussis, P.

aeruginosa, H. pylori, K. pneumoniae, L. pneumophila, C. trachomatis

Diverse specie del genere Sphingomonas non possiedono LPS ma

glicosfingolipidi (GSL)

L’LPS: la struttura [1] Regione lipofilica, il Lipide A Regione oligo/polisaccaridica idrofilica legata covalentemente

Porzione oligo/polisaccaridica Lipide A

Stabilizzazione delle molecole di LPS mediante il legame con cationi divalenti

Funzione di barriera impermeabile

(Polimixine, poliamine, peptidi e proteine cationiche, agenti chelanti [EDTA])

L’LPS: la struttura [2]

L’architettura strutturale dell’LPS è molto conservata e comparabile

nell’ambito delle Enterobacteriaceae (Salmonella spp., E. coli, Shigella)

In questo modulo comune si ritrovano varianti strutturali:

1. Diversità nella composizione chimica della regione

polisaccaridica

2. Diversità nella struttura del Lipide A

In E. coli sono presenti circa 3 x 106 molecole di LPS (4,9 mm2 vs 6,7 mm2)

Principale componente della membrana (45 %); il 75 % della superficie

della membrana esterna è occupato dall’LPS

I lipopolisaccaridi tendono a formare aggregati

Lipide A: struttura delle Enterobacteriaceae

• lo scheletro è costituito da un disaccaride con legame b,1-6

• sono presenti due gruppi fosforici (solitamente il Lipide A è monofosforilato)

• sono presenti fino a 4 catene aciliche che a loro volta possono essere sostituite da ulteriori acidi grassi fino a 7 sostituenti acidi

Legame a-glicosidico

Legameestere

Scheletro di D-glucosamine

Posizione di attacco della regione polisaccaridica

Lipide A: il caso di E. coli

Il lipide A di E. coli viene generalmente riportato come esa-acilato; in quantità più o meno variabili anche le specie penta e tetracilate.

Gli acidi grassi principali hanno un numero di atomi di carbonio compresi tra C10 e C16C18 e C21 in H. pylori e C. trachomatis

Il numero di catene aciliche varia considerevolmente e ha un effetto diretto sulla tossicità dell’LPS

Gli acidi grassi idrossilati sono legati allo scheletro glucidico mediante legami esterici o amidici in posizione 2 e 2’ e 3 e 3’

Lipide A: variazioni nei gruppi fosforici

N. meningitidis LipideA

Fosfatidil-etanolamina

Le principali sostituzioni presenti nel Lipide A dei Gram-negativi sono:1. Gruppi pirofosforici (PP), 2. etilamina, etanolamina, difosfoetanolamina3. Residui saccaridici: L-arabinosio; L,D-glicero-D-manno-eptosio; acido D-

galatturonico

Lipide A: variazioni del pattern di acilazione

Le principali variazioni

riguardano:1. Il numero delle catene di

acidi grassi

2. La posizione relativa delle catene di acidi grassi

3. La natura dei gruppi acilici

- acido miristico

- acido palmitico

- acido stearico

- acido laurico


Legameestere


Lipide A: variazioni nei gruppi fosforici e nel pattern di acilazione

Acido galatturonico

-b idrossibutirrato al C28

La regione del “Core”[1]

1. Sulla base della composizione in zuccheri

(monosaccaridi) nelle Enterobacteriaceae si

distinguono:

CORE ESTERNO

CORE INTERNO

2. Core esterno: consiste prevalentemente di ESOSI (D-glucosio, D-galattosio, D-glucosamina, N-acetilglucosamina, N-acetilgalattosamina)

Il numero delle unità può variare da 8 a 12

3. Core interno: presenza di un caratteristico monosaccaride, il Kdo (acido 3-deossi-D-manno-octolusonico)

Gli eptosi del core interno possono essere sostituiti con gruppi fosforici, pirofosforici, e fosforiletanolamina (Salmonella spp., Shigella, E. coli)

La regione del “Core” [2]

Alcune eccezioni

- Francisella tularensisManca completamente degli eptosi del core esterno; il solo residuo di Kdo presente è legato a un disaccaride di mannosio [b-mannosio (1–4) –a mannosio]

- Legionella pneumophilaCome per F. tularensis non vi sono eptosi ma residui di mannosio

….e ancora Acinetobacter, Chlamydia, Moraxella, Rhizobium

La regione minima dell’LPS richiesta in E. coli è costituita dal lipide A e da due unità di Kdo


Alcune eccezioni

Alcune specie batteriche, Acinetobacter haemolyticus, B. cepacia, Y. Pestis, incorporano analoghi del Kdo, l’acido D-glicero-D-talo-octulosonico (Ko).

La presenza del Kdo e dei residui di eptosio è stata (e tuttora è in uso) considerata un marker di identificazione dell’LPS. Nella clinica rappresenta un importante marker diagnostico per il rilevamento delle infezioni da parte di batteri Gram negativi.

Patogeni non enterici, quali N. meningiditis, mancano dei residui di eptosio e incorporano il Ko in sostituzione del Kdo.


Eterogeneità della composizione del core

Il grado di diversità osservato nella regione del core dell’LPS dipende in buona parte da due fattori:

1. Presenza di sostituenti in rapporto non stechiometrico2. Meccanismi genetici, primo fra tutti la variazione di fase

Variazione di fase: scivolamento della polimerasi, durante il processo della replicazione in piccole sequenze nucleotidiche ripetute, all’interno di geni codificanti gli enzimi del macchinario biosintetico dell’LPS.

H. influenzae, Neisseria spp., Campylobacter

In N. meningiditis aggiunta di gruppi di acido sialico che correla con una più spiccata invasività e persistenza nei tessuti dell’ospite.

L’antigene somatico o Antigene-O [1]

1. L’antigene somatico è la regione dell’LPS che entra a diretto contatto con le membrane dell’ospite

3. Rappresenta una sorta di fingerprint del batterio.

2. Regione fortemente antigenica; la caratterizzazione della composizione in zuccheri rappresenta la base per una classificazione sierologica dei diversi sierotipi

4. Queste catene saccaridiche aiutano il batterio a sfuggire all’azione litica da parte delle molecole del complemento, in un processo che viene definito “shielding”.

5. Proteggono la cellula batterica dall’azione di numerosi antibiotici

6. Possono funzionare anche come importanti sistemi di adesione (Acinetobacillus pleuropneumoniae).


50 unità oligosaccaridiche ripetute costituite da 2-8 monosaccaridi variabili Si conoscono almeno 20 residui saccaridici che possono entrare nella composizione dell’O-chain, molti dei quali presentano caratteristiche uniche (dideossi-esosi): colitosio, paratosio… alcuni sierotipi di E. coli (O8 e O9), di K. pneumoniae (O3 e O5) e L. pneumophila contengono omopolimeri (mannosio)

Estrema variabilità nella composizione anche all’interno della stessa specie

La sintesi dell’antigene-O è determinata dal cluster genico wb (rfb)

Mutanti difettivi nel cluster wb o mutanti di delezione Dwb presentano una morfologia

diversa:

R-mutants (R: rought)

batteri wild-type: S (S: smooth)


1. I mutanti R sono in grado di crescere in brodocoltura

2. La porzione dell’antigene-O è dispensabile per la crescita batterica

Nel caso delle specie patogene (Salmonella, Shigella, E. coli EPEC) la mancanza

della regione somatica rende i batteri più suscettibile alla fagocitosi e all’attacco

delle proteine del complemento.

Patogeni batterici come N. meningitidis, H. influenzae, B. pertussis, H.

influenzae, e C. trachomatis mancano dell’antigene-O (LPS a basso peso

molecolare o lipooligosaccaridi [LOS])


Lo scheletro dell’antigene somatico può presentarsi in forma lineare o ramificata, dipendente dalla presenza di gruppi sostituenti.

I più comuni sostituenti sono: gruppi fosfato e fosforil-etanolammina; gruppi acetili. Meno frequenti: gruppi formilici, e acido glicerico.

Durante il pathway biosisntetico le singole unità saccaridiche vengono polimerizzate in

blocchi e aggiunte alla regione del core.

Le molecole di LPS sono dunque formate da catene saccaridiche di diverse lunghezza

(elettrofresi SDS).

Funzioni dell’LPS

Nel caso delle specie patogene (Salmonella, Shigella, E. coli EPEC) l’LPS è fondamentale per l’interazione ospite-patogeno

Difesa dall’attacco del complemento: a seconda della lunghezza delle catene polisaccaridiche l’LPS può inibire la formazione del MAC e quindi la lisi batterica

Consente una maggiore protezione dal processo di fagocitosi

Mimetismo molecolare: H. pylori (composizione dell’LPS che ricalca gli acidi di Lewis)

Campilobacter jejuni (simile ai gangliosidi delle cellule eucariotiche); disordini autoimmunitari neurodegenerativi, sindrome di Guillan Barré

Neisseria meningiditis aggiunta di residui di acido sialico ai LOS con conseguente inattivazione del complemento

La diversa struttura tridimensionale influenza il potenziale immunogenico

Struttura conica struttura cilindrica

Agonista TLR4 Antagonista TLR4

Lipide A: struttura delle Enterobacteriaceae

• lo scheletro è costituito da un disaccaride con legame b,1-6

• sono presenti due gruppi fosforici (solitamente il Lipide A è monofosforilato)

• sono presenti fino a 4 catene aciliche che a loro volta possono essere sostituite da ulteriori acidi grassi fino a 7 sostituenti acidi


Legameestere


Posizione di attacco della regione polisaccaridica

Francisella tularensis

F. tularensis è un cocco bacillo Gram negativo, non mobile, aerobio

Agente eziologico della tularemia: infezione/infiammazione della vie aeree che può

evolvere verso broncopolmoniti.

Patogeno umano e animale.

La trasmissione avviene attraverso il morso degli artropodi, il contatto con tessuti

animali infetti, via aerosol, acqua e cibo contaminati.

Diffusione dei batteri a livello dei linfonodi e disseminazione

per via ematica ai polmoni, pleura, milza, fegato e reni.

Modificazioni del Lipide A: il caso di Francisella tularensis [1]

F. tularensis sintetizza quantità relativamente scarse di LPS

l’LPS di F. tularensis contiene quantità notevoli di lipide A libero

1. Mancanza del Kdo

2. Mancanza di molte specie di zuccheri nella regione del core interno

Quale sia il significato biologico delle modificazioni del lipide A di F. tularensis non è

noto. Nel genoma sono infatti presenti tutti gli enzimi per la biosintesi del Kdo e per

l’aggiunta degli zuccheri del core.

Possibile esistenza di un’idrolasi di membrana ?


Quali sono le reazioni enzimatiche responsabili di queste modifiche del lipide A?

Presenza di due specifiche fosfatasi di membrana:

1. LpxE

2. LpxF

Presenza di una trasferasi:

3. ArnT (PmrK)

In F. tularensis catalizza l’aggiunta del residuo di galattosamina al gruppo fosfato C1.

Lo stesso enzima funziona anche nel pathway biosintetico dell’LPS delle

Enterobacteriaceae.

Ceppi di Salmonella che esprimono la fosfatasi LpxE presentano un Lipide A monofosforilato (monofosforil Lipide A). Importanti nell’ambito clinico come adiuvanti vaccinali e per lo sviluppo di vaccini orali.

Ceppi di F. novocida che mancano della fosfatasi LpxF mostrano un fenotipo attenuato nei modelli murini di infezione. Maggiore suscettibilità a peptidi cationici antimicrobici


Legameestere


Modificazioni del Lipide A: il caso delle Enterobacteriaceae [1]


E coli K12 e S. typhimurium codificano numerosi enzimi responsabili delle

modificazioni del Lipide A

Ma quali sono queste modifiche?

1. Sostituzione dei gruppi fosfato al C1 e al C4’ con gruppi fosfoetanolamminici

2. Sostituzione e aggiunta al C4’ di un residuo di 4 ammino-arabinosio (L-Ara4N)

3. Modifiche nelle catene aciliche primarie, incorporazione di palmitato

4. Idrossilazione delle catene aciliche primarie

5. Modifiche delle catene aciliche secondarie

Molte delle modifiche osservate nella composizione chimica del lipide A rispondono a

cambiamenti delle condizioni di crescita


C16 acido palmitico

C14 acido miristico

Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [1]

Il sistema meglio conosciuto è quello PagP/PagL

PagP: Lipide A palmitoleil transferasi

PagL: Lipide A deacilasi (lipasi della membrana esterna)

Il sistema PagP/PagL permette la rimozione della catena acilica di idrossimiristato (PagL)

dal C3e conseguentemente l’aggiunta di palmitato (PagP)

Le modificazioni del pattern di acilazione rispondono al sistema a due componenti

PhoP/PhoQ

PagL3-O-deacilasi

Mutanti di S. typhimurium incapaci di aggiungere palmitato al Lipide A diventano più suscettibili all’azione di alcuni

peptidi cationici con attività antibatterica ma non alle polimixine.

Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [2]sistemi di percezione sensoriale a due componenti

PERIPLASMA

CITOPLASMA

NH-2

COOH

Caratterizazione in seguito

all’individuazione di mutazioni pleiotropiche

in E. coli, Salmonella.

Due componenti:

1. Sensore (proteina di membrana)

2. Regolatore di risposta (citosolico)

Sensore: dominio sensoriale e un

dominio del trasmettitore

Regolatore: Dominio di ricezione e un

dominio di legame al DNA

NH-2COOH

Modificazioni del Lipide A: il caso di Salmonella [3]Il sistema PhoP/PhoQ

PhoP: attivatore/repressore trascrizionale

PhoQ: protein chinasi

Il complesso PhoP/PhoQ può regolare (attivare o reprimere) simultaneamente più di 40

geni differenti

Fattore ambientale

Percezione del segnale

Informazione di tipo

trascrizionale al genoma

In particolare:Idrossilazione in

posizione 2 dell’acido miristico

Basse concentrazioni

di Mg++

Attivazione del sistema

PhoP/PhoQ

Modificazioni strutturali del

Lipide A Attivazione del sistema PagP/PagL


Il sistema PhoP/PhoQ

Il sistema PmrA/PmrB


C16 acido palmitico

C14 acido miristico


1. Aggiunta dell’L-Ara4N

Il residuo di L-Ara4N è caricato positivamente e neutralizza la carica negativa dei gruppi

fosforici presenti al C1. Questa modifica del Lipide A riduce la sensibilità dei batteri a

diverse classi di peptidi cationici ad attività antibatterica (defensine e catelecidine) e

alle polimixine.

2. Aggiunta di due gruppi fosfoetanolammina

Due sono gli enzimi coivolti in questo tipo di modifica del Lipide A: EptA e EptB. EptA

catalizza l’aggiunta della fosfoetanolammina prevalentemente al C1. In particolari

condizioni di crescita o in condizioni limitanti di arabinosio la modifica del gruppo

fosforico può interessare anche il C4’. Ancora non si conosce il motivo di questi

cambiamenti.

Il sistema PagP/PagL

L. pneumophila e B. bronchiseptica

PagP è essenziale per l’infezione degli animali. L’aggiunta di palmitato promuove la

resistenza ai peptidi antimicrobici e alla lisi del complemento mediata da anticorpi.

Y. pseudotubercolosis

L’incorporazione di palmitato avviene in misura maggiore in risposta a variazioni della

temperatura (all’interno dell’ospite)

P. aeruginosa

Modificazioni del lipide A oltre che per aggiunta di palmitato (PagP/PagL) anche per

aggiunta di idrossi-laurato e amino-arabinosio


LpxR: lipasi della membrana esterna (deacilasi); è sotto il controllo del sistema

PhoP/PhoQ

LpxO: enzima della membrana interna che idrossila le catene aciliche secondarie

Gli enzimi LpxR, LpxO e PagL non sono

presenti in E. coli K12. Quando

sovrespressi in E. coli K12 determinano

le tipiche modifiche del Lipide A

osservate in Salmonella.

Modificazioni dell’antigene-O [1]

50 unità oligosaccaridiche ripetute costituite da 2-8 monosaccaridi variabili Si conoscono almeno 20 residui saccaridici che possono entrare nella composizione dell’O-chain, molti dei quali presentano caratteristiche uniche (dideossi-esosi): colitosio, paratosio. Molecole eteropolimeriche (o omopolimeriche)

La regione dell’antigene-O dell’LPS è quella sottoposta a maggiori modificazioni- Salmonella: 1000 varianti chimicamente e strutturalmente diverse - E coli: esistenza di 173 diverse molecole di antigene-O

Le molecole di LPS estratte da una singola popolazione batterica sono spesso eterogenee nella struttura: esistenza di un ampio spettro di glicoforme.

Le alterazioni nella struttura dell’LPS avvengono in risposta a variazioni delle condizioni ambientali e nel caso dei patogeni in risposta non solo all’ambiente dell’ospite ma anche ai diversi step della patogenesi.


1. La composizione chimica dell’antigene-O

La composizione in zuccheri: il tipo e il numero di monosaccaridi che entrano nellacomposizione

2. La struttura dell’antigene-O

- Diversità nel tipo di legame glicosidico (cambiamento posizionale e anomerico)- Configurazione degli zuccheri- Presenza di gruppi sostituenti- Lunghezza delle catene dell’antigene-O

Che cosa intendiamo per variazioni dell’antigene-O e a che livello si realizzano?


1. Quali sono le principali variazioni in termini di gruppi sostituenti?

1. Gruppi saccaridici: fucosilazione e glicosilazione2. Gruppi non saccaridici: metilici e acetilici

Generalmente le variazioni non avvengono in maniera stechiometrica!

2. Quali sono i meccanismi attraverso i quali i batteri modificano l’antigene-O?

1. Riprogrammazione dell’espressione genica2. Conversione lisogenica (mediata da fagi)3. Trasferimento genico orizzontale (HGT) anche noto come trasferimento genico

laterale (LGT) seguito da eventi di ricombinazione

Modificazioni dell’antigene-O [4]I meccanismi del trasferimento genico orizzontale (HGT)

Comparazione delle sequenze geniche che codificano gli enzimi del pathway biosintetico dell’antigene-O

Microrganismi modello: S. enterica e E. coli

Organizzazione in cluster Il numero dei geni varia da un minimo di 6 unità fino anche a 9 per ciascun cluster (complessità

della catena dell’antigene-O) Contenuto in G+C diverso rispetto agli altri geni cromosomiali (generalmente inferiore al 40%) All’interno del cluster il contenuto in G+C dei geni è diverso Assemblaggio dei geni in un cluster (come i tasselli di un puzzle) Presenza di regioni più o meno conservate e di regioni variabili che possono favorire eventi di

excisione e di ricombinazione Acquisizione del materiale genetico attraverso plasmidi

Gene A Gene B Gene C Gene D Gene E Gene FCromosoma

Regione variabile

Regione costante Regione costante

Ci sono batteri, H. pylori, nei quali i geni del pathway biosisntetico dell’antigene-O non sono organizzati in cluster ma interspersi nel genoma

Cromosoma

Un altro modo che i batteri sfruttano per acquisire nuovo materiale genetico è il processo della trasduzione, mediata dai fagi.

Alcune proteine che vengono espresse dal fago, durante il suo ciclo lisogenico, entrano a far parte della parete cellulare batterica. In alcuni casi queste nuove proteine possono conferire fenotipi di virulenza

1. Geni lom del fago l che codificano per fattori di adesione di alcuni ceppi di E. coli alle cellule dell’epitelio orale)

2. Geni bor conferiscono una più spiccata resistenza degli E. coli nel siero

L’integrazione di un fago nel genoma batterico può portare alla conversione sierotipica

Conversione sierotipicaAggiunta di gruppi glucosidici o O-acetilici sugli zuccheri dell’antigene-O grazie ad enzimiespressi specificatamente dal pro-fago con conseguente shift di un batterio da un sierotipo aun altro.

Quello della conversione sierotipica è un meccanismo di protezione del pro-fago.

Modificazioni dell’antigene-O [5]La conversione lisogenica

Agente eziologicoShigella spp.S. flexneri, S. boydii, S. sonnei,S. dysenteriae50 seriotipi

SintomiFebbre, crampi addominaliSangue e muco nelle feci

Trasmissione/Dose infettivaAcqua e cibo contaminati10 – 100 batteri

Sito d’infezioneEpitelio del colon e del retto

Dati epidemiologici170 milioni di casi l’anno1 milione di morti prevalentementenei Paesi in via di sviluppo

La conversione lisogenica: il caso di Shigella [1]

La conversione lisogenica: il caso di Shigella [2]La glicosilazione

In S. flexneri l’antigene-O è una catena tetrasaccaridica

Il batteriofago X di S. flexneri (SfX) permette la conversione del sierotipo Y al sierotipo X Aggiunta di un residuo di glucosio al primo residuo di ramnosio

Serotype X

La conversione lisogenica: il caso di Shigella [3]

Il batteriofago X di S. flexneri (SfX) permette la conversione del sierotipo Y al sierotipo X

Aggiunta di un residuo di glucosio al primo residuo di ramnosio

Sono note le proteine del batteriofago che intervengono nella modifica dell’antigene-O

GtrX: glicosil trasferasi

GtrA: piccola proteina altamente idrofobica responsabile del trasferimento del residuo

di glucosio legato ad un lipide carrier attraverso la membrana

GtrB: enzima che catalizza il trasferimento del residuo di glucosio dall’UDP-glucosio al

lipide carrier

Le modificazioni dell’antigene–O in seguito all’aggiunta di residui di glucosio possono interessareanche gli altri residui di ramnosio e anche l’GlcNac. Questo dipende dalla natura del batteriofago. Ilrisultato è l’insorgenza di nuovi sierotipi.

Modificazioni dell’antigene-O [6]Riprogrammazione dell’espressione genica

L’espressione dei geni che regolano le modificazioni dell’antigene-O può essere regolata in risposta a variazioni dell’ambiente (temperatura, disponibilità di nutrienti, pH)

Nel caso dei patogeni questi meccanismi possono operare in risposta anche ai diversi step della patogenesi.

Possiamo riconoscere due diversi meccanismi:1. Attivazione/Repressione finemente regolata in risposta agli stimoli esterni ( es. sistema sensoriale a due componenti)2. Un meccanismo random di accensione e spegnimento di specifici geni: variazione di fase, anche nota come variazione antigenica

La variazione di fase è un meccanismo che avviene spontaneamente, con un’elevata frequenza (0,5%). È un meccanismo switching on/of reversibile

Il flagello in SalmonellaLe fimbrie di tipi I e i pili Pap di E. colii LOS di H. influenzae e N. meningiditisle proteine Opa di N. gonorrheae

Quattro sono i principali cambiamenti nella struttura dell’antigene-O dovuti a eventi di variazione difase: fucosilazione, glicosilazione, acetilazione e cambiamenti della lunghezza della catenasaccaridica

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