Identiﬁcare cosa?m.docente.unife.it/.../dispense-corsi/CasiraghiFerrara.pdfMaurizio Casiraghi...

Identificare cosa?

Le entità biologiche nell'era della Next Generation

Maurizio Casiraghi

Università degli Studi di Milano-BicoccaZooPlantLab - Dip. Biotecnologie e Bioscienze

Piazza della Scienza 2 – 20126 [email protected]

www.zooplantlab.btbs.unimib.itSocietà Italiana di

Biologia Evoluzionistica

giovedì 30 ottobre 14

“Ma tu ci credi nel DNA barcoding? ”

(un mio collega nel 2006)


Il processo di identificazione di una specie

Il processo di identificazione include due fasi:

1. il riconoscimento: le “cose” sono differenti;

2. la classificazione: alcune di queste “cose”

condividono tratti comuni che giustificano la

loro riunione in un unico gruppo


Identificare le specie

Il riconoscimento è “reale”, mentre classificazione “non

è reale”: è una costruzione

IL PRIMO PUNTO



Il riconoscimento è (in generale) “reale”, mentre (la

maggior parte della) classificazione “non è reale”: è una

costruzione (umana)

IL PRIMO PUNTO



Il riconoscimento è (in generale) “reale”, mentre (la

maggior parte della) classificazione “non è reale”: è una

costruzione (umana)

IL PRIMO PUNTO

in cucina “pesce” è un termine...

...”molto generale”


riconoscere

identificazione

raggruppare

classificazione



raggruppare

classificazione

DNA barcoding

riconoscere

identificazione



raggruppare

classificazione

DNA barcoding

riconoscere

identificazione


DNA barcoding


Identificare le specieLA DOMANDA

Che cos’è questo mostro?(se non sono uno zoologo o un pescatore)


Paul DN Hebert

Univ. of Guelph

Canada

Identificare le specieIL DNA BARCODING


Carl Woese15 luglio 1928 - 30 dicembre 2012



Paul DN Hebert

Univ. of Guelph

Canada



When fully developed, a COI

identification system will provide a

reliable, cost-effective and

accessible solution to the current

problem of species identification


Paul DN Hebert

Univ. of Guelph

Canada


“Il DNA barcoding è la soluzione per il problema

dell’identificazione delle specie?”


Le specie in certe parti del Tree of Life possono

essere facilmente identificate come queste

nuvole in un cielo blu



Ma in una grande parte del Tree of Life

“l’identifcazione delle nuvole”non è così facile, perché il cielo non è così

blu come mostrato nei quadri di Joseph Mallord

William Turner


J.M.W. Turner, 1833 - Quillebeuf, at the mouth of Seine


DNA barcoding

Ma allora a cosa serve il DNA barcoding?

Il DNA barcoding serve per identificare

(idealmente) le specie, ma NON E’ LA

“solution to the species problem”


“Può il DNA barcoding essere utile nel complesso mondo della identificazione

delle specie?”


DNA barcoding


DNA barcoding- Frammenti standardizzati (semplificato) -

animali


animali

piante



animali

piante

“procarioti”



DNA barcodingil problema dei marcatori!

mtDNA marcatore ideale perché i mitocondri:

1) sono considerati marcatori neutrali;

2) sono trasmessi solo dalle femmine;

3) sono omoplasici;

4) ...e il mtDNA non ricombina



citocromo ossidasi: 13 subunità




3 codificate

nel mt

10 codificate

nel nucleo

almeno altri 20

fattori codificati

nel nucleo+




3 codificate

nel mt

10 codificate

nel nucleo

almeno altri 20

fattori codificati

nel nucleo+

come può tutto ciò essere neutrale?






3) sono omoplasici;




DUI, Doubly Uniparental Inheritance nei bivalvi



stadio a

70-100 cellule

nell’uomo

# cellule

nel topo






3) sono omoplasici;



Comunque il DNA barcoding è oggi estremamente

popolare e sono in corso grandi progetti internazionali


DNA barcoding the international campaing

http://ibol.org


DNA barcoding the international campaing


DNA barcoding il database globale

http://www.barcodinglife.com


DNA barcoding il database globale


Ma quindi, quali sono i punti di forza del DNA barcoding?


DNA barcoding key points

1) Pochi primers per amplificare i frammenti dal maggior numero di

diversi organismi possibile

sequenza di DNA


2) Pochi metodi di analisi bioinformatica del dato [...]




UTOPIA?!?



DNA barcoding- Analisi standardizzata II -

Neighbour joining dopo la correzione di Kimura, uno “standard di fatto” con molti problemi teorici

Evoluzione molecolare dei marcatori...

Tanti metodi di ricostruzione filogenetica, ma quale è “il migliore” (= veloce, efficiente, potente...)?




3) il DNA barcoding è un metodo di identificazione generalista



pochi marcatori per il maggior

numero di specie possibile

Mantieni il sistema semplice ed economico!




una considerazione importante: un esperto di un certo

gruppo tassonomico probabilmente

NON NECESSITA DEL DNA BARCODING

PER IL SUO LAVORO




MA un esperto di un certo gruppo tassonomico, E’

FONDAMENTALE per fornire alla comunità scientifica un

sistema di DNA barcoding per quel gruppo di organismi




pochi marcatori per il maggior

numero di specie possibile

Mantieni il sistema semplice ed economico!




4) il DNA barcoding introduce una standardizzazione negli approcci al modo

di collezionare, di trattare i campioni, di analizzare e interpretare i dati



metodi comuni,

lo stesso laboratorio può lavorare su diverse tematiche.

Di nuovo, il DNA barcoding è per tutti

4) il DNA barcoding introduce una standardizzazione negli approcci al modo

di collezionare, di trattare i campioni, di analizzare e interpretare i dati



5) il DNA barcoding si basa sulla informatizzazione e sul networking



la standardizzazione e la computerizzazione

rappresentano uno degli sforzi più grandi nella

“democratizzazione” del mondo della ricerca

5) il DNA barcoding si basa sulla informatizzazione e sul networking



DNA barcoding

Sistema di identificazione generalistico

StandardizzazioneDatabase


Qualcosa da dimenticare circa il DNA barcoding

1) il DNA barcoding può discriminare tutti gli organismi viventi


Ricordate la domanda iniziale?

“Cosa sono queste cose?”




protozoo del genere Stentor

Silurus glanis




specie, siamo felici!




genere, abbiamo ridotto

l’incertezza




Eukaryota; Metazoa;

Bilateria; Protostomia; Arthropoda; Mandibulata;

Diptera; Nematocera; Culicimorpha; Culicoidea; Culicidae; Anophelinae; Anopheles;gambiae species complex; Anopheles gambiae gambiae

Hexapoda;

Insecta; Pterygota; Neoptera; Endopterygota;



Eukaryota; Metazoa;



Hexapoda;


il DNA barcoding

non identifica

questo rango



Eukaryota; Metazoa;



Hexapoda;


MA questo rango è

definito su base

molecolare!!!



2) il DNA barcoding può dare oggi un nome a tutti gli organismi viventi





il tricorder




il tricorder

il DNA barcoder


Linneo con il suo

DNA barcoder

personale



14 marzo 2007giovedì 30 ottobre 14

3) il DNA barcoding è rappresentato da degli alberi filogenetici



to tree or not to tree...




un albero, nella nostra mente, è sinonimo di una

ricostruzione filogenetica, ma, in senso stretto, il DNA

barcoding non è una ricostruzione filogenetica




4) il DNA barcoding è solo Neighbour Joining dopo la correzione di Kimura



3) DNA barcoding is only Neighbour Joining following Kimura’s correction



BOLD IDS usa il NJ con un approccio soglia:

ogni cosa con una variabilità inferiore all‘1%

è la stessa unità molecolare




è ben noto: il NJ è approssimativo, ma veloce

[in BOLD IDS al 30/10/2014

sono disponibili 3,473,518 sequenze]




Data analysis in DNA barcoding

DNA barcodingdata analyses

Distance Matrices

Character status based

Phylogenetics

Hybrid systems

Alignment-free



ci sono tanti metodi per analizzare i dati.

L’importante è tenere bene a mente la domanda

corretta: “Cosa voglio fare con questi dati?”

Sto facendo un vero lavoro di DNA barcoding?

Probabilmente nella maggior parte

dei casi il NJ è sufficiente



ci sono tanti metodi per analizzare i dati.

L’importante è tenere bene a mente la domanda

corretta: “Cosa voglio fare con questi dati?”

Sto facendo lavoro filogenetico?

Il NJ è in genere una pessima scelta!



Sto facendo lavoro filogenetico?

Il NJ è in genere una pessima scelta!


Ma che cosa è il DNA barcoding nel 2014?


High throughput sequencing - HTS(Next Generation Sequencing - NGS)


Molecular biology and informatics joined to generate big data

High throughput sequencing - HTS(Next Generation Sequencing - NGS)


Analisi di matrici complesse

∼1750 2014


Analisi di matrici complesse metagenomica


Analisi di matrici complesse DNA metabarcoding


Cosa facciamo noi con ilDNA metabarcoding

Honey bee,

Apis mellifera

Mite,

Varroa destructor



The analysis of water pipelines



EXPO 2015 - Pests Control



Wine microbiome


Ma cosa vedo?


Ma cosa vedo?

mi piacerebbe vedere le specie...



Etimologia: ciò che appare


African bush elephant(Loxodonta africana)

African forest elephant(Loxodonta cyclotis)

Ci si può fidare di “quello che appare”?


Ci si può fidare di “quello che appare”?


Ma che cosa identifichiamo tramite il DNA barcoding

(ma più in generale usando un approccio molecolare)?


∼1750

Approccio tipologico


∼1750

Approccio tipologico

2014


La classificazione potrebbe essere

parte del problema?


A tale from Bioutopia


Name-users

• small but powerful tribe;

• found in several scattered

ivory towers

• huge but poor tribe;

• found in the swamps

around the towers

two tribes live in Bioutopia

Real taxonomists



• they both worshipped Names, but with different rites.

• the Name-users peacefully adored a huge book made of

granite, in which billions of Names were inscribed for

Eternity.

• the cruel Real-taxonomists sacrifice a name each day after the consulting of their oracle: Phylogenia


Name-users


Real taxonomists


• suddendly, the oracle Phylogenia starts to worship a

new God, called DNA.

• the Real-taxonomists change a lot of name following the

new God, and a war starts in Bioutopia between Name-

users and Real-taxonomists


Name-users


Real taxonomists


• to solve the war, it was consulted another Oracle, called Logic,

and she dictated: “Get rid of the binomial.”

• Every species in Bioutopia will be designated by a single epithet:

a number, or a barcode, the best food for computers:

“It’s an X157YR22297!”


Name-users


Real taxonomists


The Real Taxonomists could then concentrate on more

important matters than scraping Names off granite, and

Phylogenia would be free to change her mind whenever she

liked.

The Name would remain the same, and the Name-users will

be happy too.

Peace would return to Bioutopia


Name-users


Real taxonomists


Conclusioni (forse...)

Identificazione e classificazione sono due processi indipendenti

HTS (e le tecniche moleculari in genere) sono un supporto a questa divisione

Le Specie esistono davvero e/o sono ancora l’unità fondamentale della biologia?


forse sarebbe davvero più opportuno pensare (soprattutto) in termini di

unità in evoluzione e unità osservabili (che non sono necessariamente la stessa cosa)



the unit of



Andrea Galimberti

Maurizio Casiraghi

Monica Pozzi

Valerio Mezzasalma

Antonella BrunoAnna Sandionigi

Ilaria Bruni

Fabrizio De Mattia

Emanuele Ferri

Massimo Labra

Michela Barbuto


Grazie. time for questions?

Maurizio Casiraghi

Università degli Studi di Milano-BicoccaZooPlantLab - Dip. Biotecnologie e Bioscienze

Piazza della Scienza 2 – 20126 [email protected]

www.zooplantlab.btbs.unimib.itSocietà Italiana di

Biologia Evoluzionistica


materiale aggiuntivo


Osservato

individui


individui

Osservato


individui

morfotipi

Single approach taxonomy

Osservato


individui


Osservato

morfotipi


individui


specie

SpecieOsservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTUs

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTUMolecular Operational Taxonomic

Units (MOTUs) are clusters of molecular variability.

Individual specimens were considered to belong to the same MOTU when the

sequenced segment of 450 bases was > 99.5% identical

Osservato

morfotipi


individuals

morphotypes


species

Specie

MOTUs

UCSs

Osservato


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

Groups of individualswithin nominal species showing

large genetic distances,but without further information, are considered Unconfirmed

Candidate Species (UCS) deserving further study

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

DCL

Integrative taxonomyOsservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

DCL

Integrative taxonomy

When additional data indicate that these genealogical units are not

differentiated at the species level, they are flagged as Deep

Conspecific Lineages (DCL)

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

DCL


IOTU

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

DCLs


IOTU

Integrated Operational Taxonomic Units (IOTUs) are entities defined by the

congruence of two or more entries of the so called “taxonomic circle”

Osservato

morfotipi


individui

morphotypes


specie

Specie

MOTUs

UCSs

DCLs


IOTUs

Osservato


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

DCL


IOTU

CCS

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

UCSs

DCLs


IOTU

CCS

Confirmed Candidate Species (CCS), applies to those deep

genealogical lineages that can be considered good species

following standards of divergence for the group under study but that

have not yet been formally described and named

Osservato

morfotipi


individui


specie

Specie

MOTU

UCS

DCL


IOTU

CCS

contenuto informativo

Osservato

morfotipi


E’ un po’ complesso, ma oggi abbiamo i concetti per chiamare le entità con i

nomi corretti quando usiamo il DNA barcoding

(ma in realtà con ogni approccio molecolare)


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