I recettori per gli oppiati nell'encefalo sono stati identificati misuran-do il legame specifico di oppiati marcati radioattivamente con fram-menti cellulari da differenti aree cerebrali. Il maggior numero di lega-mi è stato trovato nelle cellule provenienti dal sistema limbico (in colo-re), una serie di regioni primitive dal punto di vista evolutivo, presential centro dell'encefalo e principalmente collegate, nei vertebrati infe-

rioni, con l'odorato e, nell'uomo, con l'insorgenza di emozioni.L'elevata concentrazione di recettori in questo sistema limbico sugge-risce che sia questa la sede nella quale gli oppiati esercitano i loroeffetti euforizzanti e, inoltre, che vi siano una o più sostanze secretedall'organismo e simili agli oppiati le quali possono svolgere una qual-che funzione fisiologica nel modificare la componente emotiva del dolore.

GIRO CINGOLATO FORNICE

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CORPOMAMMILLARE

BULBO OLFATTORI

TRIGONO OLFATTORIO

AMIGDALA

LOBO TEMPORALE GIRO PARAIPPOCAMPALEUNCUS

N

el 1680, il medico inglese ThomasSydenham scriveva: «Tra i rime-di che l'Onnipotente si è com-

piaciuto di offrire all'umanità per lenirele sue sofferenze, nessuno è così univer-sale ed efficace come l'oppio». Con ilpassare dei secoli, però, la fiducia deimedici negli effetti lenitivi dell'oppio edei suoi derivati è stata offuscata dal ri-conoscimento della loro tossicità e del ri-schio che destino tossicomanie. Questofatto, assieme alla mancanza di una qual-siasi altra classe nota di farmaci che eser-citassero una potente azione analgesicacome gli oppiati, ha stimolato una inten-sa ricerca di oppiati sintetici, che avesse-ro le proprietà buone della morfina sen-za averne le cattive. In epoca più recen-te, sostanze morfinosimili naturali sonostate trovate nell'encefalo e promettonodi chiarire come gli oppiati agiscono nelcorpo, quale è il sito specifico della loroazione e per quale motivo provocanoassuefazione.

Per quanto sappiamo l'oppio è statousato come farmaco fin dai tempi dellaGrecia classica, e non solo, naturalmen-te, perché allevia il dolore, ma ancheperché provoca euforia. Il nome derivadal greco opion, che indica il succo delpapavero; la droga è presente nel laticeche si ottiene incidendo la capsula nonancora matura di Papaver sommferum.Nel 1803, un giovane farmacista tedesco,Friedrich Sertiirner, isolò un alcaloidedell'oppio che chiamò morfina, da Mor-feo, il dio greco del sonno; già verso lametà del XIX secolo l'uso di morfinapura al posto dei preparati grezzi di op-pio si era diffuso ampiamente. La tossi-cità della morfina e la sua capacità diprovocare tossicomania furono ricono-sciute solo dopo che questa droga era di-ventata una specialità già affermata nelcampo della terapia medica. Negli StatiUniti, la somministrazione di oppiati aisoldati feriti nel corso della Guerra Civi-le ha fatto sì che la tossicomania provo-cata da queste sostanze diventasse un

problema sociale e ha stimolato la ricer-ca di derivati sintetici dell'oppio che nonavessero questa proprietà.

Ogni tanto i medici accoglievano entu-siasticamente l'avvento di un derivatoche si presupponeva privo di ogni capa-cità di provocare tossicomania, solo peressere di nuovo delusi più tardi quando,avendo somministrato a un numero suf-ficientemente alto di pazienti il farmacoper un tempo abbastanza lungo, questorisultava provocare tossicomania, in al-cuni casi in forma più grave della morfi-na. Nell'ultimo decennio del secolo pas-sato, per esempio, la Bayer introdussel'eroina, un derivato della morfina condue gruppi acetile aggiunti (COCH,) ilquale aveva proprietà analgesiche e si ri-teneva non provocasse tossicomania.D'altra parte, in questo secolo, negli an-ni quaranta, in America la meperidina(nemerol) divenne l'analgesico derivatodall'oppio più comune nella pratica me-dica, perché si riteneva che anch'essanon provocasse tossicomania. Ma il nu-mero crescente di tossicomani da Deme-rol convinse ben presto il Bureau of Nar-cotics che le cose stavano altrimenti. Ineffetti, sembrò fino a non molto tempofa che gli effetti analgesici dei derivatidell'oppio fossero inevitabilmente legatial fatto di dare assuefazione.

T farmaci, gli ormoni e i neuromedia-I tori (sostanze chimiche liberate dalleterminazioni nervose in grado di regolarel'eccitamento di altre cellule nervose oneuroni) producono tutti effetti estrema-mente selettivi a concentrazioni moltobasse. Si ammette generalmente che essiagiscano in corrispondenza di recettorispecifici, costituiti da grosse molecole elocalizzati sulla superficie esterna di cel-lule negli organi bersaglio. Nel caso deglioppiati, una varietà di prove confermaquesto concetto di recettore.

Innanzitutto, tutti gli oppiati attivi co-me analgesici mostrano similitudini fon-damentali nella loro architettura moleco-

lare. La morfina e la maggior parte deglialtri oppiati hanno una struttura rigida aT, con due ampie superfici idrofobe, adangolo retto l'una rispetto all'altra, ungruppo ossidrile (OH), capace di forma-re un legame idrogeno, e un atomo diazoto, dotato di carica elettrica positivae capace di formare un legame ionico:tutto questo suggerisce possibili intera-zioni non covalenti con un recettore geo-metricamente e chimicamente comple-mentare. Inoltre sono stati ideati oppiatisintetici che, pur essendo simili nellastruttura di base, sono molto più potentidegli oppiati naturali. Per esempio, l'eto-morfina è da 5000 a 10 000 volte più po-tente della morfina: provoca euforia elenisce il dolore a una dose di un solodecimilligrammo, il che la rende ancorpiù potente dell'LSD, spesso citato comela più potente sostanza in grado di alte-rare le facoltà mentali. Sicuramente per-ché un farmaco possa agire in dosi cosìpiccole bisogna che essa si leghi a recet-tori estremamente selettivi.

In secondo luogo, la maggior partedegli oppiati esiste in almeno due formedi isomeri ottici: molecole speculari chesono identiche come composizione chi-mica ma, come la mano destra e sinistra,non si possono sovrapporre nello spazio.Gli isomeri ottici si possono distinguerein base alla direzione in cui una loro so-luzione fa ruotare il piano di polarizza-zione in un fascio di luce polarizzata. Ingenere solo l'isomero levogiro, cioè quel-lo che fa ruotare il piano di polarizza-zione verso sinistra, può alleviare il do-lore, stimolare l'euforia o ogni altro ef-fetto associato con i derivati dell'oppio.La stereospecificità dell'azione di questesostanze avvalora l'ipotesi di un recetto-re estr( —, amente specifico, in grado didistinguere il senso di rotazione che lamolecola dell'oppiato può determinare.

In terzo luogo, gli oppiati attivi comeanalgesici possono essere trasformati me-diante lievissime modificazioni moleco-lari in antagonisti, sostanze che blocca-

no in maniera specifica gli effetti anal-gesici ed euforizzanti dei primi senza po-ter sollecitare essi stessi tali effetti. Peresempio, la sostituzione di un gruppometilico (CH,) con un gruppo allilico(CH,-CH = CH 2) sull'azoto della morfi-na trasforma quest'ultima in nalorfina,un potente antagonista che blocca tuttigli effetti farmacologici della morfina.Un animale da laboratorio, o una perso-na in punto di morte per intossicazioneda morfina, può essere riportato in vitaquasi istantaneamente con la sommini-strazione di quantitativi molto più picco-li di nalorfina. Un effetto così rapidosottintende un sito d'azione comune:sembra quasi che gli antagonisti occupi-no i recettori per i derivati dell'oppiobloccando l'accesso agli oppiati attivi.

Per queste ragioni, da tempo i farma-cologi hanno sostenuto che recettori spe-cifici per gli oppiati dovevano esisterenell'encefalo e probabilmente in altri tes-suti. Sintetizzando un'intera serie di de-rivati della morfina e saggiandone in ani-mali gli effetti farmacologici, essi hanno

cominciato a individuare le parti dellamolecola dell'oppiato responsabili deglieffetti fisiologici. Essi hanno anche cer-cato di rappresentare quale poteva esserela forma dell'ipotetico recettore degli op-piati, ma un'identificazione univoca delrecettore stesso non si è ancora potutaraggiungere.

T l grande ostacolo nella caratterizzazio-ne del recettore è stato il fatto che,

come per la maggior parte degli altricomposti, gli oppiati si legano pratica-mente a tutte le membrane biologiche enon biologiche. Così i legami non speci-fici, cioè quei legami non associati conun recettore, superano notevolmente i le-gami con i recettori, i quali pertanto nonhanno potuto neppure essere identificati.Avram Goldstein e collaboratori dellaStanford University School of Medicinehanno cercato di differenziare il legamespecifico da quello non specifico deglioppiati con frammenti di membrana ot-tenuti da cellule omogeneizzate di ence-falo e hanno applicato il criterio della

stereospecificità: hanno confrontato lacapacità di un isomero ottico, farmaco-logicamente attivo, di inibire il legame diun oppiato, marcato radioattivamente,con la capacità dell'isomero ottico inat-tivo di fare la stessa cosa. Pur rappre-sentando questa tecnica un notevole pro-gresso, essi hanno trovato che solo il 2per cento di tutti i legami in provettadegli oppiati con le membrane delle cel-lule encefaliche era stereospecifico. Que-sto risultato è stato scoraggiante perchésottintendeva che l'isolamento della pic-cola quantità di legami specifici con l'i-potetico recettore dalla grande massa dilegami non specifici sarebbe stata un'im-presa pressoché impossibile.

Nel mio laboratorio presso la JohnsHopkins University School of Medicine,Candace B. Pert (allora laureando) e iopensavamo che alcune semplici manipo-lazioni avrebbero potuto ampliare a suf-ficienza il numero di legami con i recet-tori specifici così da renderli misurabili.A questo scopo siamo ricorsi alla meto-dologia, introdotta da Pedro Cuatreca-

I recettori degli oppiatie gli oppiati interni

Sembra che morfina e derivati esercitino i loro effetti legandosi arecettori specifici presenti nell'encefalo e nel midollo. In questisiti agirebbero anche sostanze morfinosimili secrete dall'organismo

di Solomon H. Snyder

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TRASDUTTORE

AGGIUNTADI FARMACO

OSCILLOGRAFOSTRISCIA DIINTESTINO DI CAVIA

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FILO DI PLATINO

BAGNOMARIA A 37° C

ELETTRODOTAPPO DIGOMMA STIMOLATORE

0,1 HERTZ(CICLI AL SECONDO)95 PER CENTO

DI OSSIGENO5 PER CENTODI ANIDRIDECARBONICA

ELETTRODO

1 MILLISEOONDO

–AGGIU NTA

DI MORFINA

I

Apparecchiatura per determinare l'efficacia farmacologica degli oppiati. Essa è stata messa apunto nel laboratorio di José M. Musacchio presso il Ne ss York University Medical Center. Unastrisciolina di intestino ileo di cavia, che possiede notoriamente recettori per gli oppiati simili aquelli presenti nell'encefalo, viene connessa mediante un trasduttore a un oscillograto che neregistra le contrazioni. L'efficacia degli oppiati viene misurata dalla loro capacità di inibire le con-trazioni ritmiche della muscolatura liscia intestinale indotte mediante uno stimolatore elettrico.

OPPIATI ATTIVI OPPIATI ANTAGONISTI

NALORFINA

NALOXONE

LEVALLORFANO

OSSIMORFONE

LEVORFANOLO

ISOMERO LEVOGIRO (ATTIVO) ISOMERO DESTROGIRO (INATTIVO)

Gli isomeri ottici, o forme molecolari speculari, della morfina, un oppiato con attivitàanalgesica, hanno effetti farmacologici molto diversi. Solo l'isomero levogiro, che in soluzionefa ruotare a sinistra il piano della luce polarizzata, produce i caratteristici effetti analgesici delfarmaco; l'isomero destrogiro è totalmente inattivo. Questa stereospecificità dell'effetto deglioppiati convalida l'ipotesi di un recettore in grado di distinguere il senso di rotazione di unamolecola. Nella figura, il carbonio è in nero, l'azoto in grigio, l'ossigeno in colore.

Lievi modificazioni chimiche nella struttura molecolare degli oppiati analgesici, per esempio lasostituzione di un gruppo metilico (CH3 ) con un gruppo allilico (C11,—CH= CH2), possonotrasformare queste sostanze in antagonisti che bloccano gli effetti analgesici degli oppiati in pic-colissime dosi. Sembra che gli antagonisti operino legandosi a una forma inattiva del recettore.

sas della Johns Hopkins, per caratteriz-zare il recettore dell'ormone insulina. E-gli aveva fatto in modo di individuare illegame specifico, marcando l'ormone conuna forte dose di sostanza radioattiva, inmodo da poterne applicare bassissimeconcentrazioni a frammenti delle mem-brane delle cellule bersaglio, posti su fil-tri. L'ormone mostrava una forte affini-tà per il recettore, il che stava a indicareche, utilizzandolo a basse concentrazio-ni, si sarebbe favorito il legame specificorispetto a quello non specifico. Per ri-muovere le molecole che si erano legatein maniera non specifica, Cuatrecasas la-vava abbondantemente, ma rapidamen-te, i frammenti delle membrane dopo illoro legame con l'ormone. Con similitecniche siamo stati in grado di identifi-care siti di legame con affinità elevataper gli oppiati in frammenti di membra-ne cellulari ottenuti da encefalo di rattoe da intestino di cavia e questo con l'aiu-to di naloxone marcato radioattivamen-te, che è un potente oppiato antagonista.Per analizzare la specificità del legame,abbiamo confrontato la capacità degliisomeri ottici attivi e inattivi degli oppia-ti di competere con molecole di naloxonemarcato radioattivamente nel legarsi alrecettore e abbiamo trovato che tutti gliisomeri attivi erano in grado, di fatto, dispostare tali molecole quando già eranolegate alle membrane e che gli isomeriinattivi dal punto di vista farmacologiconon avevano praticamente alcun effettosu tale legame.

T l solo legame stereospecifico, tuttavia,non è sufficiente a stabilire un'asso-

ciazione tra oppiato e recettore. Si po-trebbe pensare che alcuni costituenti deltessuto cerebrale, diversi dai recettori edisposti in maniera simmetrica, siano ingrado di discriminare tra gli isomeri deglioppiati. Horace H. Loh della Universityof California School of Medicine a SanFrancisco ha trovato che un'importanteclasse di lipidi dell'encefalo riesce a di-stinguere gli isomeri ottici degli oppiati.Nel mio laboratorio, Cavril W. Paster-nak ha trovato che questi ultimi si lega-no in maniera stereospecifica perfino adalcuni filtri di vetro.

Per essere sicuri che il legame che ave-vamo osservato in frammenti di encefaloomogeneizzato rappresentava veramenteun'interazione tra oppiato e recettore si-mile a quella che avviene nell'organismo,abbiamo provato a saggiare molti far-maci per stabilire se la loro affinità per irecettori andava in parallelo con la loroattività farmacologica. Il risultato è statoil seguente: oppiati potenti come il levor-fanolo e la morfina hanno per il recetto-re un'affinità molto più elevata di quellipiù deboli, come la meperidina e il pro-possifene (Darvon). Anche evidenti di-screpanze servono come eccezioni checonfermano la regola. Per esempio, l'e-torfina, un analgesico 6000 volte più po-tente della morfina, ha per il recettoreun'affinità che è solo 20 volte quelladella morfina. Tuttavia, essa è 300 voltepiù solubile nei lipidi e ha, di conseguen-

za, un'efficacia più elevata nel penetrarenell'encefalo attraverso la circolazionesanguigna. La combinazione delle dueproprietà, un'affinità 20 volte maggioree una capacità di penetrazione 300 voltepiù grande, può spiegare la maggiore ef-ficacia dell'etorfina.

Alla stessa st: 2gua, la codeina, un de-rivato dell'oppio ampiamente usato perlenire il dolore, la tosse e la diarrea, hanell'uomo una potenza pari a circa il 20per cento della morfina per determinarequesti effetti, mentre la sua capacità dilegarsi ai recettori per gli oppiati è pari ameno dello 0,1 per cento di quella dellamorfina. Questa discrepanza si spiegafaciln lente con il fatto che la codeinaviene metabolizzata in morfina dagli en-zimi del fegato; la morfina penetra quin-di nell'encefalo e spiega gli effetti farma-cologici della codeina. E. Leong Waydella University of California School ofMedicine a San Francisco ha dimostratoche, pur potendo la codeina alleviareefficacemente il dolore nei ratti quandoviene iniettata per via endovenosa, nonha attività analgesiche quando viene in-trodotta direttamente nell'encefalo. So-no queste le condizioni, invece, in cui lamorfina è efficace.

Idealmente si dovrebbero confrontarela potenza e il legame con il recettorenello stesso sistema. Ciò è realizzabilecon gli oppiati in quanto si sa che la lorocapacità di inibire le contrazioni indotteelettricamente nell'intestino di cavia vastrettamente in parallelo con la loro atti-vità analgesica. Inoltre, l'affinità di tuttigli oppiati per i siti di legame dei recetto-ri è molto simile nell'intestino di cavia aquella che si riscontra nell'encefalo. La-vorando con un semplice sistema speri-mentale nel mio laboratorio, Ian Creeseha misurato la capacità inibitoria di di-versi oppiati nei riguardi della contrazio-ne dell'intestino di cavia e l'ha confron-tata con la loro capacità di impedire illegame del naloxone con lo stesso tessu-to. Egli ha trovato che l'affinità per ilrecettore e la potenza farmacologica era-no in buona correlazione nell'intestino dicavia, suggerendo così l'idea che il sitodi legame stereospecifico fosse di fattoun autentico recettore.

C 'era ancora un'altra importante fontedi errore: negli esperimenti in cui si

agiva sul legame, gli oppiati e i lorocorrispondenti antagonisti sembravanoavere la medesima affinità per il recet-tore, ma si sapeva bene che, negli orga-nismi viventi, gli antagonisti sono moltopiù potenti. Questo paradosso è statorisolto quando abbiamo modificato leg-germente la nostra tecnica per misurareil recettore. Le condizioni nelle quali a-vevamo svolto i nostri esperimenti eranoinnaturali nel senso che mancavano diqualsiasi ione, anche di quelli abbondan-ti come il sodio. Non appena abbiamoincorporato sodio nel nostro procedimen-to, abbiamo osservato spiccate differen-ze nel comportamento degli oppiati. Con-centrazioni di sodio uguali a quelle che sitrovano normalmente nel nostro corpo

stimolavano il legame degli antagonisti eagivano in maniera contraria nei con-fronti degli oppiati ad azione opposta.Questi effetti erano selettivi per il sodio;erano in qualche misura imitati dal litio,che ha un raggio atomico simile, ma nonda altri ioni dotati di carica positiva,come il potassio, il rubidio e il cesio.

Per valutare una vasta gamma di op-piati, abbiamo misurato quanto il sodioaltererebbe la capacità di un dato farma-co di inibire il legame del naloxone con irecettori per gli oppiati. Il nostro «indicesodio» rappresenta il rapporto tra la con-centrazione del farmaco necessaria perinibire il legame del naloxone del 50 percento in presenza di sodio e la concen-trazione del farmaco necessaria in assen-za di sodio. Tanto più alto è questo rap-porto, tanto più il sodio abbassa la capa-cità del farmaco di inibire il legame delnaloxone. In altre parole, un indice so-dio di 2 significa che la capacità di unasostanza di legarsi al recettore per gli op-piati (misurata come inibizione del lega-me del naloxone, da essa provocata) siriduce di metà in presenza di sodio.

L'indice sodio indica con precisione lemodalità di azione di un oppiato. Oppia-ti antagonisti puri, come il naloxone e ilnaltrexone, hanno un indice sodio di I oanche meno, il che significa che il sodionon fa diminuire la loro capacità di le-garsi ai recettori per gli oppiati ma anzi,talvolta, la fa aumentare. Altri oppiatiantagonisti sono lievemente «contamina-ti» dall'attività degli oppiati ad azionecontrapposta. Essi possono lenire il do-lore, ma presumibilmente, per le loroproprietà di antagonisti, non sembrano

provocare tossicomania così facilmentecome gli altri oppiati «puri». I primi far-maci con queste proprietà miste non ave-vano tuttavia alcuna utilità clinica, inquanto presentavano numerosi effetticollaterali dannosi: davano luogo ad an-sietà, agitazione e talvolta anche ad allu-cinazioni. Il miglior esempio di tali so-stanze è dato dalla nalorfina, che è statausata clinicamente per molti anni percurare un superdosaggio di morfina o dieroina. Essa ha un indice sodio di circa2,5, il che significa che il suo legame conil recettore diventa da due a tre volte piùdebole in presenza di sodio. All'altraestremità dello spettro, gli oppiati puri,che non hanno proprietà antagoniste, di-ventano da 12 a 60 volte più deboli inpresenza del sodio. Non è chiaro esatta-mente che cosa determini la variazionetra gli indici sodio nel caso degli oppiatiattivi come analgesici. Un oppiato piùpuro potrebbe lenire più efficacemente ildolore, ma potrebbe anche provocareuna maggiore tossicomania.

I farmaci più interessanti sono quellicon indici sodio compresi tra 3 e 7. Essisono combinazioni di oppiati ad azioneopposta e sono quelli che offrono lamaggiore affidabilità come calmanti chenon provochino tossicomania. La mag-gior parte di questi analgesici relativa-mente sicuri nel non provocare tossico-mania appartiene alla nuova classe dicomposti noti come benzomorfani, otte-nuti da Everette L. May del National In-stitute of Arthritis, Metabolism and Di-gestive Diseases e da altri ricercatori. Ilprototipo è la pentazocina (Talwin), am-piamente usata negli Stati Uniti: essa è

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50INDICE DI SODIO

l'unico potente analgesico oppiato nonsoggetto ai rigidi regolamenti contro ledroghe pericolose. Poiché le sue proprie-tà antagoniste presumibilmente controbi-lanciano quelle opposte, la pentazocinanon viene identificata nel test della pia-stra calda, un tradizionale procedimentodi screening farmacologico in cui alcunitopi trattati con analgesici sono appog-giati su una piastra elettrica calda e l'ef-fetto analgesico del farmaco viene misu-rato dalla rapidità con cui scappano.Malgrado questo, la pentazocina è unanalgesico efficace nell'uomo e si è di-mostrato che, in definitiva, allevia il do-lore anche in altri animali usati cometest. In molti animali è difficile ricono-scere lo sviluppo di una assuefazione allapentazocina e la dipendenza fisica daessa. Nell'uomo è molto meno probabileche provochi tossicomania rispetto aglialtri oppiati, anche se si riportano casi diquesto genere.

A causa delle peculiari proprietà far-macologiche degli analgesici è stato dif-ficile per le ditte farmaceutiche produrli.Non c'è nessun chiaro procedimento chi-mico che permetta di ottenere con sicu-rezza le proprietà desiderate. Non si puòessere neanche sicuri che un dato medici-nale possiederà quella ridotta capacità di

provocare tossicomania, che è auspicabi-le, fino a quando essa non sarà stata va-lutata a grave prezzo nell'uomo. Il misu-rare il legame di un farmaco ai recettoriper gli oppiati nei frammenti di cellulecerebrali in presenza e in assenza di so-dio semplifica notevolmente l'intero pro-cedimento. Invece di sintetizzare i moltigrammi di un composto necessari pertest sugli animali sono sufficienti pochimilligrammi di prodotto. Finora il sem-plice saggio recettore-oppiato ha permes-so di predire il potenziale clinico deglianalgesici misti in maniera altrettantoefficace dei molto più costosi procedi-menti di screening effettuati nelle scim-mie e nell'uomo.

T 'effetto selettivo del sodio sul legametra oppiato e recettore sembra essere

una caratteristica che integra la funzionedel recettore. La presenza dello ione faapparentemente aumentare il numero direcettori per gli antagonisti e diminuirequello dei recettori per gli oppiati adazione opposta. Dato che tutti gli oppiatisono così simili tra loro dal punto di vi-sta chimico, sembra più ragionevole po-stulare che ambedue i tipi di sostanze sileghino allo stesso recettore e che il sitodi legame per gli oppiati possa variare

man mano che il recettore passa da unaconformazione molecolare all'altra e vi-ceversa. Il sodio, che è responsabile dellatransizione tra i due stati, differisce co-me struttura dagli oppiati e pertanto agi-sce presumibilmente, in corrispondenzadi un sito diverso sulla molecola del re-cettore. Nel nostro modello, il legamedel sodio fisserebbe il recettore nella con-formazione propria per l'antagonista, perla quale, cioè, gli antagonisti hanno unaelevata affinità. Allo stesso modo, glioppiati attivi avrebbero una sostanzialeaffinità per la forma «senza sodio» delrecettore. I farmaci misti avrebbero affi-nità intermedie per le due forme.

I tipici effetti da morfina, come l'anal-gesia e l'euforia, si osserverebbero sol-tanto se i farmaci si legassero a un carat-teristico stato del recettore, una condi-zione che offre un semplice meccanismomolecolare per spiegare l'attività dell'op-piato antagonista. Legandosi al recettorenello stato in cui esso lega anche il sodio,gli oppiati antagonisti riducono il nume-ro di recettori capaci di mediare gli effet-ti della morfina. Dato che il liquido chebagna le membrane cellulari dell'encefa-lo è ricco di sodio, si potrebbe pensareche il recettore per gli oppiati esista nor-malmente nello stato che lega il sodio eche è proprio degli antagonisti. Ciò con-corda con il fatto che, negli organismiviventi, gli antagonisti hanno una effica-cia molto superiore a quella degli altrioppiati. In un ambiente privo di sodio, sipotrebbe supporre che entrambi i tipi dioppiati siano parimenti potenti.

Con un semplice, sensibile e specificosistema di analisi dei recettori degli op-piati siamo stati in grado di indagare susvariate questioni non ancora risolte.Molte funzioni encefaliche e sistemi dineuromediatori sono distribuiti nell'en-cefalo. Se la distribuzione dei recettoriper gli oppiati rispecchiasse la distribu-zione di qualche specifica proprietà del-l'encefalo, allora questa proprietà po-trebbe essere implicata nell'attività deglioppiati. Dato 'le queste sostanze provo-cano l'analgesia, le strutture encefalicheinteressate nella percezione del doloresono state quelle su cui naturalmente so-no caduti i maggiori sospetti.

Due importanti vie cerebrali sono im-plicate nella percezione del dolore. Undolore acuto, localizzato, è scarsamentelenito dagli oppiati e sembra essere con-vogliato da una via evolutasi tardi e con-sistente in una serie di ammassi di cellulesituate a lato del talamo, che è un im-portante centro per l'integrazione delleinformazioni sensoriali. Dolori più sor-di, con andamento cronico e meno loca-lizzati sono, invece, ben alleviati daglioppiati e sembrano convogliati da unavia che si è evoluta più precocemente edè formata da molte cellule nervose inter-connesse, la maggior parte delle quali èpriva di guaina mielinica che serve daisolante e, pertanto, conduce piuttostolentamente gli impulsi. Questa via, chia-mata sistema paleospinotalamico, salelungo la linea mediana dell'encefalo; lesue stazioni sono tra l'altro la materia

grigia centrale del tronco cerebrale e laparte centrale del talamo.

Assieme a Michael J. Kuhar, Pert e ioabbiamo misurato la distribuzione deirecettori degli oppiati in molte regionidell'encefalo delle scimmie e dell'uomo,ricorrendo sia a tecniche dirette di lega-me con il recettore, sia all'autoradiogra-fia di sezioni di encefalo a cui era statolegato l'oppiato marcato radioattivamen-te. La mappa di distribuzione corrispon-de sorprendentemente alla via paleospi-notalamica di conduzione del dolore. Siosserva anche una elevata densità di le-game degli oppiati con i recettori nell'a-migdala, nel corpo striato e nell'ipotala-mo, tutte parti del sistema limbico, ungruppo di regioni cerebrali che medianoin grande misura il comportamento emo-tivo. Benché queste regioni non sianotradizionalmente associate con la perce-zione del dolore, quando, negli animali,parti di esse vengono stimolate elettrica-mente, quegli animali sembrano impau-riti, come se sentissero dolore. Sembradunque che esse siano la sede della com-ponente emotiva del dolore, e quindi ri-sentano più degli effetti euforizzanti de-gli oppiati, che degli effetti analgesici.

All'interno del midollo spinale, i re-cettori degli oppiati sono localizzati inuna densa banda che corrisponde allasostanza gelatinosa, un'importante sta-zione per la conduzione verso l'alto del-l'informazione sensoriale relativa al do-lore. Quest'osservazione porta alla an-nosa controversia sul fatto se l'analgesiada oppiati sia mediata soltanto nell'ence-falo o anche nel midollo spinale. Sembraora probabile che venga mediata in am-bedue. Recettori sono anche localizzatinella sostanza gelatinosa del nucleo tri-gemino caudale del midollo spinale, unaregione che riceve fibre amieliniche por-tatrici di stimoli dolorosi dalla faccia edalle mani e che fornisce così una via perregolare le sensazioni di dolore prove-nienti da quelle parti dell'organismo. Al-l'interno del tronco cerebrale, i recettoridegli oppiati sono concentrati in quelliche sono chiamati i nuclei solitari, i qualispiegano come gli oppiati possano depri-mere il riflesso della tosse e ridurre la se-crezione gastrica, e nell'area postremadove gli oppiati possono indurre nauseae vomito.

Per approfondire il significato biologi-co dei recettori degli oppiati, abbiamomisurato il legame con questi recettori inuna vasta gamma di specie animali. Ilfenomeno è stato riconosciuto nell'ence-falo di tutti i vertebrati che abbiamo esa-minato, ma era assente in tutti gli inver-tebrati. Altrettanto imprevedibilmentenon si notava alcuna tendenza evolutiva.Nei vertebrati più primitivi come le lam-prede e gli squali abbiamo trovato lostesso numero di legami tra oppiati e re-cettori che nelle scimmie e nell'uomo.Inoltre, i recettori degli oppiati di questivertebrati primitivi mostravano virtual-mente la stessa specificità per tali sostan-ze dei recettori degli oppiati presenti neimammiferi, indicando così che, nel cor-so dell'evoluzione dei vertebrati, la strut-

NORMORFINA

MORFINA

METADONE

LEVORFANOLO

ETORFINA

PENTAZOCINA

NALORFINA

NALOXONE

tura chimica dei recettori aveva subitopochi cambiamenti, seppure ne avevaavuti. Ciò ha fatto pensare che tali recet-tori siano normalmente interessati a «ri-cevere» una molecola mantenutasi iden-tica durante -tutta l'evoluzione.

L'esistenza in tutti i vertebrati di recet-tori specifici per gli oppiati ha indi-

cato la presenza nell'encefalo di una so-stanza naturale morfinosimile, probabil-mente un neuromediatore che agisce incorrispondenza di tali siti. Questa con-gettura è stata convalidata da esperimen-

OPPIATO ANTAGONISTA

v

SODIO oRECETTORE PER GLI OPPIATI

NELLA CONFORMAZIONE CHE LEGA IL SODIO

OPPIATO ATTIVOPURO

OPPIATO ADATTIVITÀ MISTA

VOPPIATO

ANTAGONISTA

ti che hanno preso in considerazione lalocalizzazione dei recettori degli oppiatiall'interno del sistema nervoso.

Gli oppiati, come la maggior partedelle altre sostanze che agiscono sullapsiche, agirebbero in primo luogo in cor-rispondenza delle sinapsi encefaliche,cioè in quelle regioni specializzate in cuila terminazione di una fibra nervosa sicongiunge con la membrana esterna diun'altra cellula nervosa e ne regola chi-micamente l'attività. È possibile frazio-nare il tessuto cerebrale in differenti com-ponenti subcellulari, così da poter loca-

OPPIATO ATTIVO

E

oRECETTORE PER GLI OPPIATI

NELLA CONFORMAZIONECHE NON LEGA IL SODIO

10-5

10-1°

MEPERIDINA •

•

• CODEINAi

PROPOSSIFENE

FENAZOCINA

N1 ETADON E •

• LEVORFANOLO

• DIIDROMORFINA&D OSSIMORFONE

NORMORFINA., • PENTAZOCINA

MORFINA

ETORFINA•

i I I I I I :10-1 ° 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4

INIBIZIONE DELLA CONTRAZIONE DELL'INTESTINO INDOTTA ELETTRICAMENTE (ID„)

Una stretta correlazione tra l'efficacia farmacologica degli oppiati nell'intestino di cavia e laloro affinità per i recettori degli oppiati nello stesso tessuto, dimostra che si tratta di veri epropri recettori specifici. In questo grafico, l'IDs 0 di parecchi oppiati (cioè la concentrazione ne-cessaria per inibire del 50 per cento la contrazione dell'intestino indotta elettricamente) vienemessa in relazione con la K r, di queste sostanze (cioè la concentrazione necessaria per inibire del50 per cento il legame stereospecifico del naloxone radioattivo). I valori relativi alle sostanzedosate sperimentalmente si situano tutti in vicinanza di una linea di correlazione teorica.

La presenza di ioni sodio fa diminuire in maniera drammatica l'affinità dei recettori deglioppiati attivi senza modificarne, invece, l'affinità per gli antagonisti. Gli istogrammi mostranoil rapporto tra la concentrazione di un farmaco, necessaria per inibire del 50 per cento il legamedel naloxone marcato radioattivamente con il recettore in presenza del sodio, e la concentrazio-ne del farmaco, necessaria in assenza di sodio. I valori più bassi indicano una minor riduzionedell'efficacia in presenza di sodio: gli antagonisti «puri» hanno un indice sodio di I o anchemeno, mentre negli oppiati attivi «puri» l'indice può raggiungere valori molto più elevati.

OPPIATO AD ATTIVITÀ MISTA

0 o 0 0 OLITIO SODIO POTASSIO RUBIDIO CESIO

Modello del recettore per gli oppiati proposto dall'autore. Esso spiega l'effetto del sodiopostulando che il recettore possa esistere in due diverse conformazioni: una forma che lega ilsodio e che ha una elevata affinità per gli antagonisti e una forma che non lega il sodio e che haun'elevata affinità per gli oppiati attivi. L'effetto del sodio è selettivo; come mostra il disegno,tra gli altri ioni dotati di una carica positiva solamente il litio ha un effetto analogo a quello del sodio.

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31

SISTEMA LIMBICO(COMPONENTEEMOTIVADEL DOLORE)

ALLA CORTECCIA CEREBRALE

IPOTALAMO

VIA PALEOSPINOTALAMICO(DOLORE SORDO) VIA NEOSPINOTALAMICA

(DOLORE ACUTO)

TALAMO

7777

SOSTANZA GRIGIACHE CIRCONDA L'ACQUEDOTTO

FORMAZIONERETICOLAREMESENCEFALICA

MESENCEFALO (TRONCO CEREBRALE)

TRATTO SPINOTALAMICO

SOSTANZA GELATINOSA

CORNO DORSALE

MIDOLLO SPINALE

'

-

OPPIATOMOLTO ATTIVO FENAZOCINA

OPPIATO ATTIVO MORFINA

OPPIATODEBOLMENTE ATTIVO METADONE

OPPIATO ADATTIVITÀ MISTA PENTAZOCINA

OPPIATOANTAGONISTA

IN PARTEATTIVO

NALORFINA

OPPIATOANTAGONISTA PURO NALOXONE

lizzare i recettori a livello submicroscopi-co. Quando la materia cerebrale vieneomogeneizzata in una soluzione con de-terminate concentrazioni di saccarosio,le terminazioni nervose si saldano tra lo-ro, formando sacchetti detti sinaptoso-mi. Nell'interno di questi ultimi si trova-no le vescicole sinaptiche, le quali imma-gazzinano il contenuto della terminazio-ne nervosa, che funge da neuromediato-re, assieme a parecchi mitocondri, cheforniscono energia per le diverse attività.Quando i sinaptosomi vengono preparaticon procedimenti convenzionali, la mem-brana dell'altra cellula che partecipa allasinapsi aderisce a molti di essi, per cuiun unico sinaptosoma può costituire unaintera sinapsi. I sinaptosomi si possonorompere mediante shock osmotico ponen-doli in acqua. Le vescicole sinaptiche e imitocondri presenti all'interno della ter-minazione nervosa si liberano e le mem-brane che attraversano la sinapsi si disin-tegrano tutte assieme. Centrifugandoquesti frammenti si possono separare ri-spettivamente le vescicole sinaptiche, imitocondri e le membrane sinaptiche.Quando abbiamo applicato tutti questiprocedimenti di frazionamento subcellu-lare al tessuto cerebrale e abbiamo misu-rato nelle varie frazioni il legame recetto-re-oppiato, abbiamo trovato che esso eralimitato in gran parte alle frazioni conte-nenti i sinaptosomi. Quando questi veni-vano rotti, il recettore veniva recuperatoprincipalmente dalle membrane sinapti-che, mentre poco o nulla era associatocon le vescicole sinaptiche.

Poiché i neuromediatori agiscono incorrispondenza delle sinapsi, è parso chei recettori per gli oppiati funzionasseroin maniera molto simile ai recettori peruna sostanza neuromediatrice naturalepresente nell'encefalo e, in effetti, espe-rimenti effettuati da John Hughes e HansW. Kosterlitz dell'Università di Aberdeenhanno fornito prove dirette sull'esistenza

Gli oppiati qui illustrati suggeriscono le possi-bili relazioni esistenti tra struttura molecolaree attività farmacologica. L'anello benzenico Ae l'azoto (in grigio) si trovano in tutti glioppiati e apparentemente hanno un'importan-za cruciale per tutti i loro effetti, sia nel casoche il recettore si trovi nella conformazione daantagonista, sia nel caso contrario. Inoltre, laforma attiva sembra avere un sito di legamespecifico per l'anello F degli oppiati più attiviquali, per esempio, la fenazocina. La morfinaha solo un'efficacia moderata perché mancadell'anello F. Il metadone ha gli anelli A e F,ma è un oppiato debole perché non può as-sumere l'orientamento critico dei due anelli,che è necessario per potersi legare fortementeal recettore. La catena laterale degli antago-nisti sembra legarsi a un sito speciale sullaforma da antagonista del recettore. In com-posti ad attività mista, quali sono la nalor-fina o la pentazocina, tale catena è flessibilee ruota liberamente, per cui in qualsiasi mo-mento alcune molecole sono nella forma an-tagonista e altre no. Negli antagonisti «pu-ri» come il naloxone, la presenza di un grup-po ossidrilico adiacente riduce la rotazionelibera della catena laterale, fissandola nel-la posizione adatta per legare l'antagonista.

di un simile mediatore morfinosimile.Per anni, Hughes e Kosterlitz avevanostudiato gli effetti della morfina sui mu-scoli involontari, per esempio quelli del-l'intestino di cavia o dei vasi deferenti ditopo, cioè di quei dotti che si contraggo-no e che trasportano lo sperma dai testi-coli all'uretra. Come nell'intestino di ca-via, le contrazioni indotte elettricamentenei vasi deferenti di topo sono soppressedagli oppiati. Hughes e Kosterlitz hannoscoperto che estratti di tessuto cerebralepotevano imitare tale effetto, che erastereospecifico e veniva inibito da basseconcentrazioni dell'antagonista naloxo-ne, per cui il fattore cerebrale morfinosi-mile si legava chiaramente ai recettoriper gli oppiati. Lars Terenius dell'Uni-versità di Uppsala, Pasternak e io abbia-mo identificato tutti indipendentementela stessa sostanza negli estratti cerebrali,rivelandone la capacità di competere congli oppiati radioattivi nel legame con irecettori degli oppiati stessi.

In seguito, Hughes e Kosterlitz hannoisolato il fattore morfinosimile dall'ence-falo di maiale e hanno trovato che consi-steva di due corti peptidi molto affini,ambedue costituiti da cinque unità am-minoacidiche. Per essi i due ricercatorihanno coniato l'unico nome di encefali-na. Uno dei due peptidi, la metioninen-cefalina, è caratterizzata dalla sequenzaNH2-tirosina-glicina-glicina-fenilalanina--metionina-COOH. L'altro, la leucinen-cefalina, ha gli stessi primi quattro am-minoacidi, ma la leucina sostituisce lametionina. Hughes e Kosterlitz hannoanche trovato che l'encefalo di maialecontiene circa quattro volte più metio-ninencefalina che leucinencefalina. Inve-ce, nel mio laboratorio, Rabi Simantov eio abbiamo purificato indipendentemen-te le due encefaline dall'encefalo di bovi-ni e abbiamo trovato che il rapporto tra idue peptidi è invertito. Dato che il codi-ce genetico per la leucina e per la metio-nina differisce solo per un nucleotide sutre, la discrepanza tra le specie può esse-re semplicemente un risultato di derivagenetica casuale. D'altra parte, è statodimostrato che il rapporto tra le dueencefaline varia da una regione encefali-ca all'altra, suggerendo che la lieve diffe-renza strutturale tra i due peptidi puòsvolgere una funzione regolatrice.

Numerosi esperimenti dimostrano chele encefaline sono neuromediatori

di sistemi specifici, presenti nell'encefaloe capaci di mediare l'integrazione del-l'informazione sensoriale che ha a chefare con il dolore e con il comportamen-to emotivo, e che svolgono anche funzio-ni non ancora identificate. Le variazionisecondo le varie zone nei livelli di ence-falina tendono ad andare in parallelocon la distribuzione dei recettori deglioppiati. Le encefaline sembrano inoltrelocalizzate in corrispondenza delle termi-nazioni nervose. Nel mio laboratorio,Simantov le ha purificate tutte e due,estraendole dall'encefalo di bovini e neha ottenuto gli anticorpi iniettandole incavie. Egli e Kuhar, come del resto Tho-

RECETTORI PER IL DOLORE (NOCICETTORI)

Le vie nervose per il dolore, che portano l'informazione dalla periferia del sistema nervosoall'encefalo sono distinte in due tipi: la via neospinotalamica localizzata lateralmente e chetrasmette sensazioni dolorose acute e localizzate e la via paleospinotalamica (in colore), chetrasmette il dolore sordo meno localizzato. Questo dolore è lenito dagli oppiati e, infatti, recet-tori per gli oppiati sono concentrati nella sostanza gelatinosa e nella porzione centrale del talamo.

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METIONINENCEFALINA

rMETIONINENCEFALINA

\i/

NALOXONE

\l/

9 1 ? MINUTI

MORFINA NALOXONE

111111 11111 L'encefalina agisce in maniera simile alla morfina inibendo, come dimostrano queste registra-zioni, le contrazioni dell'intestino di cavia indotte elettricamente. L'inibizione dell'encefalina,come quella della morfina, viene bloccata dall'antagonista naloxone. La similitudine degli effettiprovocati dai due composti fa pensare che essi agiscano in corrispondenza dello stesso recettore.

I modelli molecolari spaziali della morfina (in basso) e della metio-nin-encefalina (in alto), una sostanza morfinosimile presente nell'en-cefalo, hanno alcune caratteristiche in comune. L'anello benzenico Adella morfina, che presenta un gruppo ossidrilico, ha lo stesso orienta-mento dell'anello benzenico della tirosina presente a un'estremità

della catena peptidica dell'encefalina, suggerendo che sia questo grup-po a legarsi in entrambi i casi al recettore per gli oppiati. Il secondoanello sulla molecola dell'encefalina è quello delja fenilalanina: essosembra interagire con la conformazione del recettore per gli oppiati inmodo uguale a quello dell'anello benzenico F degli oppiati più attivi.

GLICINA

TIROSINA

FENILALANINA

ANELLO A

CARBONIO

IDROGENO

OSSIGENO

AZOTO

ZOLFO

mas ~eli del Karolinska Institutet diStoccolma, le hanno localizzate nel tes-suto nervoso fissando un colorante fluo-rescente sulle molecole degli anticorpi, inmodo che i complessi encefalina-anticor-pi potessero emettere luminescenza unavolta irradiati con luce ultravioletta. Inquesti esperimenti, Simantov e Kuharhanno osservato che la fluorescenza eralimitata alle terminazióni nervose dellecellule cerebrali, il che era in accordocon l'ipotesi che l'encefalina fosse unneuromediatore. La distribuzione delleterminazioni nervose che producono en-cefalina, determinata con la tecnica degli

anticorpi fluorescenti, è molto simile aquella dei recettori degli oppiati qualel'hanno rivelata le mappe autoradiogra-fiche: le terminazioni sono concentratenella sostanza gelatinosa del midollo spi-nale, dell'amigdala del sistema limbico edella parte centrale del talamo.

Al di fuori dell'encefalo, l'encefalina èstata individuata nel tratto gastrointesti-nale di molte specie, mentre non è statadimostrata in quantità misurabili in nes-sun altro tessuto. La sua sorprendentelocalizzazione sia nell'intestino sia nel-l'encefalo assomiglia a quella di altri pep-tidi che sembrano svolgere un ruolo or-

monosimile nell'intestino e agire da neu-romediatori nell'encefalo; tra questi ri-cordiamo la somatostatina e la sostanza P.

Come può l'encefalina agire sulle cel-lule cerebrali? Quando determinati op-piati vengono diretti su neuroni che pos-siedono i recettori specifici, la velocitàcon cui queste cellule nervose si eccitanoviene generalmente inibita e una simileinibizione può essere dovuta a uno qual-siasi di numerosi meccanismi. Si ritieneconvenzionalmente che i neuromediatorisi leghino a recettori presenti sulla mem-brana del neurone ricevente, scatenandoqualche alterazione delle proprietà della

membrana stessa, per esempio un cam-biamento nella permeabilità che essa hanei riguardi degli ioni. Nello stato di ri-poso la membrana è polarizzata elettri-camente: il lato esterno è positivo rispet-to all'interno. La massima parte dei bennoti mediatori eccitatori, come l'acetil-colina e il glutammato, facilitano l'ecci-tamento del neurone ricevente producen-do un flusso depolarizzante di ioni so-dio, dotati di carica positiva, attraversola membrana cellulare. Mediatori inibi-tori chiaramente identificati, come la gli-cina e il GABA, rendono la membranapiù resistente alla depolarizzazione daparte di mediatori eccitatori aumentandola sua permeabilità agli ioni cloro, dotatidi carica negativa e quindi iperpolariz-zandola.

Cosa davvero sorprendente, l'azioneinibitrice dell'encefalina sembra esserenettamente diversa da quella della glicinao del GABA. Walter Zieglgansberger eAlbert Herz del Max Planck Institut fiirPsychiatrie di Monaco di Baviera hannodimostrato, inserendo alcuni elettrodi nel-la cellula ricevente, che essa non vieneiperpolarizzata dall'encefalina o dagli op-piati; l'inibizione è provocata invece dauna riduzione del flusso depolarizzantedel sodio attraverso la membrana. Ziegl-gansberger e Herz hanno concluso chegli oppiati e l'encefalina inibiscono l'at-tività nervosa in alcuni sistemi, bloccan-do il flusso di sodio provocato dai neu-romediatori eccitatori e agendo in manie-ra diretta in corrispondenza dei canalipresenti nella membrana della cellula ri-cevente, attraverso cui passa il sodio.

Nuove prove suggeriscono che l'ence-falina possa avere un altro meccanismod'inibizione. Un recente esperimento ese-guito da Carol C. LaMotte, Pert e iostesso ha dimostrato che i recettori pergli oppiati non sono limitati alle cellulericeventi. Abbiamo lesionato la radicedorsale del midollo spinale di scimmia inmodo che i nervi sensitivi afferenti dege-nerassero; le cellule bersaglio presenti al-l'interno della sostanza gelatinosa nel mi-dollo spinale sono rimaste tuttavia intat-te; vi è stata invece una significativadiminuzione nel numero di recettori mi-surabili degli oppiati, il che indica chequesti recettori devono essere localizzatisia sulle terminazioni nervose, sia sullecellule riceventi. La scoperta di questirecettori ha suggerito un nuovo modelloper l'inibizione dell'encefalina.

È noto che la liberazione di un neuro-mediatore da parte di una terminazionenervosa viene scatenata dalla depolariz-zazione della membrana di tale termina-zione, che si verifica quando l'impulsonervoso si propaga all'estremità della fi-bra nervosa. La quantità del mediatoreliberata sembra essere proporzionale algrado di depolarizzazione; quanto più lamembrana viene depolarizzata, tanto piùmediatore viene secreto. È possibile che ineuroni che liberano encefalina forminodelle sinapsi sulle terminazioni dei neu-roni eccitatori: l'encefalina liberata incorrispondenza di tali sinapsi si leghe-rebbe ai recettori per gli oppiati presenti

sulla terminazione nervosa eccitatrice, fa-cendo aumentare così la conduttanza delsodio attraverso la membrana della ter-minazione e depolarizzandola parzial-mente. Allora, quando un impulso ner-voso raggiungesse la terminazione, la de-polarizzazione netta che esso genera ver-rebbe ridotta e vi sarebbe una corrispon-dente diminuzione nel quantitativo di me-diatore eccitatorio liberato. Benché quil'azione dell'encefalina sia essa stessa ec-citatrice, facendo aumentare il flusso delsodio attraverso la membrana della ter-minazione nervosa, l'effetto definitivosulla cellula, che riceve le terminazioninervose eccitatorie, sarebbe d'inibizione,riducendosi la quantità del mediatore ec-citatorio che ne influenza l'attività.

Quest'ultimo modello si adegua bene atutte le nozioni apprese circa la funzionedei recettori per gli oppiati negli esperi-menti in vitro. Come ho già ricordato, ilsodio altera notevolmente il legame deglioppiati, facendo aumentare l'affinità deirecettori degli oppiati per gli antagonisti.In vivo il sistema opera probabilmenteall'inverso, agendo sul legame degli op-piati, o delle encefaline, con i recettori inmaniera da modificare l'affinità per ilsodio, alterando quindi la permeabilitàdella membrana allo ione. Nel modelloche spiega l'inibizione della terminazionenervosa, l'accresciuta conduttanza delsodio depolarizzerebbe la terminazionedi un neurone eccitatorio, riducendo lasecrezione del neuromediatore che pro-voca l'eccitazione. Nei sistemi studiati daZieglgansberger e Herz, la conduttanzaper il sodio invece diminuirebbe. Ambe-

due questi effetti si adeguano bene alleindagini biochimiche che correlano il so-dio con i recettori degli oppiati.

È un fatto significativo che, quando iratti assuefatti alla morfina ricevonoquesta sostanza, l'attività delle loro cel-lule cerebrali non viene inibita; anzi puòaddirittura essere eccitata. Dato che que-sti fenomeni avvengono tutti a livellodella membrana cellulare che possiede irecettori per gli oppiati, sembra che ilmeccanismo che provoca la tossicomaniaper queste sostanze sia da cercare a que-sto livello.

Jl termine tossicomania non si definisce

i facilmente, ma in tutti i casi esso simanifesta con fenomeni di assuefazionee di dipendenza fisica. L'assuefazione siriferisce a quella condizione per cui, do-po la ripetuta somministrazione di unadroga, sono necessarie dosi più elevateper ottenere gli stessi effetti che primavenivano prodotti da dosi molto più pic-cole. L'assuefazione può insorgere conmolte sostanze, sia con quelle che nonprovocano tossicomania, sia con quelleche la provocano. Un meccanismo del-l'assuefazione è metabolico; la droga sti-mola nel fegato la sintesi di enzimi chepoi la distruggono. Allora sono necessa-rie dosi sempre più massicce per raggiun-gere nel sangue e nei tessuti gli stessi li-velli che in precedenza erano raggiunticon dosi più piccole. Una forma piùimportante di assuefazione, particolar-mente nel caso di droghe che provocanotossicomania, si chiama assuefazione cel-lulare. Dopo continua esposizione a so-

34 35

ADENILATO-CICLASI

cAMP cAMP cAMP

CELLULA IBRIDAIBRIDANEUROBLASTOMA-GLIOMA

MEMBRANA CELLULARENN

V RECETTOREPER L'ORMONE

LIVELLONORMALE

—111—•

•a

ESPOSIZIONE CRONICA AGLI OPPIATI (TOSSICOMANIA)

INIBIZIONE

INIBIZIONE-DELL'ADENILATO-

CICLASI

SINTESI DIADENILATOCICLASI

CASSUEFAZIONE

v SINDROMEDA PRIVAZIONE

RECETTORI NEURONEECCITATORIO

ACETILCOLINA O ALTROMEDIATORE ECCITATORIO

CELLULA RICEVENTE

•••

RECETTORI PER GLI OPPIATI

NEURONE CHEPRODUCE ENCEFALINA

ENCEFALINA

Il meccanismo dell'inibizione da encefalina può essere indiretto. Invece di agire direttamentesulla cellula nervosa ricevente, la sostanza può bloccare la liberazione di neuromediatorieccitatori come l'acetilcolina e il glutammato, riducendo così gli impulsi eccitatori che giungonoalla cellula ricevente. Secondo il modello dell'autore, l'encefalina liberata da un neurone si legaai recettori per gli oppiati situati sulla terminazione di un neurone eccitatore, depolarizzandoparzialmente la membrana terminale e riducendo la depolarizzazione netta prodotta dall'arrivodi un impulso nervoso. La quantità di neuromediatore liberata dalla terminazione è proporzio-nale alla depolarizzazione netta, per cui viene liberato meno mediatore eccitatorio. La cellularicevente viene quindi esposta a una stimolazione minore. Questo sistema inibitore regolal'attività delle vie dolorifiche ascendenti nel midollo spinale e nell'encefalo. Gli oppiati agi-rebbero legandosi ai recettori per l'encefalina rimasti liberi, potenziando così il sistema.

stanze come alcool, barbiturici e oppiati,anche le elevate dosi di esse che si riscon-trano nel cervello non sono più efficaci,per cui si rendono progressivamente ne-cessarie dosi più forti.

La dipendenza fisica è ancor più inti-mamente associata con la tossicomania.Si dice che compare quando, essendoterminata la somministrazione di unadroga, il consumatore mostra gravi sin-tomi di alterazione. Nel caso di un alco-lizzato grave, i sintomi includono tremi-to, convulsioni e allucinazioni visive dadelirium tremens; nel caso di un tossico-mane da oppio, si osservano crampi allostomaco, diarrea, insonnia e eccitazionenervosa con pupille dilatate e pelle d'oca.

C'è anche il fenomeno dell'assuefazio-ne incrociata tra droghe di una determi-nata classe. Tossicomani assuefatti a unoppiato lo saranno anche a un altro, percui i medici possono curare un drogatodi eroina con altri oppiati, per esempio ilmetadone. L'alcool, i barbiturici e gliansiolitici, come il clordiazepossido (Li-brium) o il diazepam (Valium) sembranoavere gli stessi meccanismi cerebrali ri-guardo all'assuefazione e alla dipenden-za fisica. Così il delirium tremens di unalcolizzato si può calmare non solo som-ministrandogli alcool, ma anche barbitu-rici e farmaci ansiolitici. Non si ha assue-fazione incrociata, invece, tra la classedegli oppiati e la classe dell'alcool, deibarbiturici e degli ansiolitici. Cionondi-meno, in senso formale, i processi diassuefazione e di dipendenza fisica sonogli stessi per la massima parte delle classidi droghe. Pertanto, se si potessero capi-re, per una classe - per esempio quelladegli oppiati - i meccanismi biochimici

implicati, si saprebbe qualcosa anche diquello che succede con le altre classi.

La scoperta dell'encefalina ha suggeri-to l'ipotesi che i neuroni che la conten-gono siano coinvolti nella tossicomaniada oppiati. Un semplice modello puòspiegare come cambiamenti nella velo-cità di eccitamento dei neuroni che li-berano encefalina giustificherebbero al-meno in parte le manifestazioni compor-tamentali dell'assuefazione e della dipen-denza fisica. In condizioni di riposo, irecettori per gli oppiati sono esposti a uncerto livello base di encefalina. La mor-fina, somministrata dall'esterno, si legaai recettori in genere non occupati, po-tenziando così gli effetti analgesici delsistema encefalinico. In seguito a un trat-tamento continuato con morfina, le cel-lule che possiedono recettori per gli op-piati si trovano sovraccaricate di mate-riale oppiatosimile e, grazie a qualcheipotetico meccanismo a retroazione, por-tano un messaggio ai neuroni che libera-no l'encefalina perché smettano di ecci-tarsi e di liberare questa sostanza. Quan-do ciò accade, le cellule riceventi sonoesposte soltanto alla morfina, per cui nepossono tollerare quantità maggiori percontrobilanciare l'assenza di encefalinache non ricevono più. Quando si arrestaanche la somministrazione di morfina, irecettori per gli oppiati si trovano senzamorfina e senza encefalina e questa ca-renza dà inizio a una sequenza di eventiche danno luogo ai sintomi da privazione.

-p sperimenti recenti hanno confermatoquesto modello. In altri sistemi di

neuromediatori dell'encefalo, la cessazio-ne dell'eccitamento nervoso si associa

con un aumento del contenuto di neuro-mediatore nell'encefalo semplicementeperché esso continua a essere sintetizza-to, anche se non viene poi più liberato.Se lo stesso avviene con i sistemi perl'encefalina, ci si aspetterebbe che i livel-li di quest'ultima si alzino durante ilgraduale sviluppo del fenomeno di as-suefazione e di dipendenza fisica. Dopoche agli animali è stata sottratta la mor-fina e sono cessate le manifestazioni daprivazione, i livelli dell'encefalina do-vrebbero tornare normali. Queste previ-sioni sono state confermate da esperimentieffettuati da Simantov e da me stesso. Inratti ai quali viene somministrata rego-larmente la morfina, nella fase in cui siinstaura in essi uno stato di tossicoma-nia, i livelli di encefalina raddoppiano.Quando i sintomi di privazione vengonoaccelerati per somministrazione di nalo-xone, gli animali che li presentano mo-strano una varietà di sintomi che scom-paiono nello spazio di un'ora quando ilivelli di encefalina ritornano normali.

Come potrebbe essere veicolata all'in-terno di un neurone l'informazione cheriguarda la presenza o l'assenza di op-piati o di encefalina in corrispondenzadei recettori per gli oppiati? Può farparte del meccanismo un cambiamentonella conduttanza del sodio. Anche lesostanze note come nucleotidi ciclici pos-sono intervenire, come fanno nei con-fronti di altri neuromediatori e ormoni,che mediano gli effetti intracellulari diquesti composti dopo che si sono legatiai recettori sulla parete esterna della cel-lula. I nucleotidi ciclici adenosinmonofo-sfato ciclico (AMP ciclico) e guanosin-monofosfato ciclico (GMP ciclico) sonosintetizzati rispettivamente dagli enzimiciclasi adenilica e ciclasi guanilica. Si ri-tiene che questi enzimi siano liberamentesospesi nel doppio strato di molecole li-pidiche che costituiscono la membranacellulare. Quando incontrano un recetto-re proteico a cui si lega una molecola delneuromediatore appropriato, vengono at-tivati e cominciano a sintetizzare l'AMPciclico o il GMP ciclico. Sembra spessoche i due nucleotidi ciclici siano in anta-gonismo l'uno rispetto all'altro nel me-diare gli effetti intracellulari degli ormo-ni che hanno effetti opposti sullo stessosistema. Per esempio, l'acetilcolina, chefa contrarre la muscolatura involontaria,produce nelle cellule bersaglio un aumen-to del livello di GMP ciclico e una dimi-nuzione del livello di AMP ciclico. D'al-tra parte, l'adrenalina, che provoca ilrilassamento della muscolatura involon-taria, produce nelle stesse cellule un au-mento di AMP ciclico e una diminuzionedi GMP ciclico. Ambedue i mediatorioperano presumibilmente modificando leattività relative della ciclasi adenilica edella ciclasi guanilica.

Parecchie sostanze che alterano i livelliintracellulari dei nucleotidi ciclici influi-scono sulle attività degli oppiati e posso-no persino imitare fenomeni da privazio-ne di oppiati. Inoltre, nell'encefalo, glistessi oppiati deprimono il livello dellaciclasi adenilica e inibiscono anche la sti-

molazione della sintesi di questo enzimada parte di certi ormoni. È significativoil fatto che le capacità relative degli op-piati nell'inibire la sintesi della ciclasiadenilica vanno in parallelo con gli effet-ti che queste sostanze hanno sul legamecon i recettori nelle stesse cellule. Glioppiati elevano anche simultaneamente illivello intracellulare di GMP ciclico, pre-sumibilmente attivando in maniera selet-tiva la ciclasi guanilica. Così, in modoanalogo a quanto avviene in altri sistemibiologici, sembra che queste droghe in-fluiscano in opposte direzioni sui dueprincipali nucleotidi ciclici.

Gli esperimenti di Marshall W. Niren-berg e di Werner A. Klee dei NationalInstitutes of Health con colture di cellulenervose neoplastiche hanno suggerito chegli effetti degli oppiati sui livelli dei nu-cleotidi ciclici possono spiegare alcuniaspetti della tossicomania. Le cellule ce-rebrali non si dividono e si moltiplicanocome la maggior parte degli altri tipi dicellule, per cui non si possono coltivarein vitro quando sono nello stato norma-le. Tuttavia, le cellule nervose neopla-stiche, ottenute da un tumore del sistemanervoso noto come neuroblastoma, pos-sono venire coltivate. Per i loro esperi-menti, Nirenberg e Klee hanno usatocellule ibride ottenute fondendo celluledi neuroblastoma con cellule gliali rica-vate da un altro tipo di tumore cerebra-le. Operando con questi ibridi cellulegliali-neuroblastoma, Nirenberg e Kleehanno osservato gli effetti di una esposi-zione cronica alla morfina o all'encefali-na sui livelli intracellulari dei nucleotidiciclici e hanno trovato che la ciclasi ade-nilica viene inibita dagli oppiati ma che,per lunghi periodi di esposizione, le cel-lule operano una compensazione sintetiz-zando un maggior numero di molecole diquesto enzima. Come risultato, sono ne-cessarie concentrazioni più elevate di op-piati per produrre diminuzioni di AMPciclico, in quanto le molecole in più diciclasi adenilica sostituiscono quelle Mi-bite dagli oppiati.

Il sistema sembra così «assuefarsi»: leconcentrazioni di morfina che abbassanoi livelli di AMP ciclico non modificanoquei livelli dopo un massiccio trattamen-to con morfina o con encefalina. Doposottrazione di morfina, i livelli dell'AMPciclico si innalzano in maniera marcatain quanto le molecole appena sintetizzatedi ciclasi adenilica non vengono più ini-bite. Questa produzione eccessiva di AMPciclico potrebbe spiegare dal punto di vi-sta biochimico la sindrome da privazione.Nelle stesse cellule in coltura, invece, untrattamento continuato con oppiati noninfluisce sul numero di recettori o sullegame degli oppiati con questi, indican-do così che i recettori stessi non sonoprobabilmente la sede della modificazio-ne biochimica fondamentale che si veri-fica nella tossicomania.

I cambiamenti nei nucleotidi ciclici chesi verificano nella tossicomania non sonostati ancora dimostrati nel tessuto cere-brale, ma gli oppiati e l'encefalina innal-zano i livelli di GMP ciclico e abbassano

ORMONE LIVELLI DIAMP CICLICO

V

ENCEFALINA OD OPPIATI

IMPROVVISA RIMOZIONE DEGLI OPPIATI

RITORNO ALLOALLO STATO NORMALE

Un modello per spiegare la tossicomania è fornito dai cambiamenti biochimici che accompagna-no la somministrazione di morfina nelle cellule nervose neoplastiche coltivate in vitro. Dietrostimolazione da parte di determinati ormoni, l'enzima adenilatociclasi, incluso nella membrana,sintetizza il messaggero intracellulare adenosinmonofosfato ciclico (AMP ciclico), che mediagli effetti fisiologici dell'ormone (a). La somministrazione di oppiati inibisce l'adenilatociclasi,riducendo i livelli di AMP ciclico (b). In seguito a continua esposizione agli oppiati, lacellula si adatta sintetizzando più molecole dell'enzima, per cui si produce una quantità normaledi AMP ciclico (c). A questo punto la cellula si è «assuefatta» alla dose dell'oppiato. Quandocessa la somministrazione della droga, tutte le molecole dell'enzima diventano attive e sin-tetizzano un eccesso di AMP ciclico (d): questo eccesso può causare la sindrome da privazione.

-v-

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• NH2 —Giu — Leu —Ala —Gly — Ala —Pro— Pro —Glu— Pro —Ala —Arg —Asp— Pro —Glu —Ala — Pro—Ala Gly

10 15

20 — Ala

Ala

— Ala —Ala —Gin —Ala—Glu —Ala— Val — Leu —Gly —Tyr —Glu — Leu — Glu —Ala—Arg—Ala

Lys 35

30 25

Lys —40

ASp

—Lys— Met —Giu— Phe —Arg —Trp—Gly — Ser — PrO —Pro — Lys—Asp

Lys45

50 55

60— Arg

11r/

--Phe — Leu —Thr—Val — Leu —Pro—Thr—Gln—Ser— lys— Giu—Ser—Thr— Met —Phe —Gly —Gly ___Iz

L s I I I75

70 65

Asn

Ala

—80

Val —Lys—Asn —Ala —His — Lys —Lys—Gly—Gln —COO H

85

90

quelli di AMP ciclico in sezioni di tessu-to cerebrale in vitro. È dunque ragione-vole supporre che gli effetti cronici che siosservano nella tossicomania potrebberoessere simili a quelli che Nirenberg e Kleehanno osservato nelle colture di cellulenervose. I cambiamenti che si verificanonella disposizione dei nucleotidi ciclicinei neuroni che possiedono recettori pergli oppiati potrebbero probabilmente ser-vire come segnale per il meccanismo aretroazione, postulato per alterare la ve-locità con cui entrano in eccitamento ineuroni che producono l'encefalina, dan-do così inizio al processo che porta al-l'assuefazione e alla dipendenza.

nuesti modelli per spiegare la tossico-`e mania sono divenuti un po' più com-plessi negli anni recenti in seguito allascoperta che le encefaline non sono gliunici peptidi naturali simili agli oppiati.Anche prima della loro scoperta, Gold-stein aveva riferito che l'ipofisi, embrio-logicamente e strutturalmente distinta dalsistema nervoso, contiene un fattore coneffetti simili a quelli degli oppiati. Que-

GAMMA-LIPOTROPINA

BETA-MELANOTROPINA

BETA-EN DORFINA

sto risultato divenne particolarmente in-teressante quando Hughes e Kosterlitznotarono una curiosa connessione: la se-quenza amminoacidica della metioninen-cefalina corrispondeva a un segmentodell'ormone peptidico ipofisario beta-li-potropina, il quale è normalmente asso-ciato con il meccanismo di demolizionedei grassi. Choh Hao Li della Universityof California School of Medicine di SanFrancisco aveva già isolato dall'ipofisi dicammello un frammento di beta-lipotro-pina formato da 31 amminoacidi e la cuifunzione era alquanto misteriosa: avevauna scarsissima attività metabolizzantenei riguardi dei grassi, ma incorporava lasequenza della metioninencefalina. Gold-stein ottenne campioni del peptide di Lie trovò che avevano effetti simili a quellidegli oppiati.

Li chiamò il suo peptide beta-endorfi-na, a significare che si trattava di unamorfina endogena. Era una sostanza conun grado elevato di attività analgesica:48 volte più efficace della morfina seiniettata direttamente nell'encefalo di a-nimali di laboratorio e tre volte più effi-

cace iniettata per via endovenosa. Inol-tre, la sua attività veniva bloccata dalnaloxone, un oppiato antagonista speci-fico. Roger Guillemin del Salk Institute èriuscito a isolare due altri peptidi, e lastessa beta-endorfina, da una miscela ditessuto ipotalamico e ipofisario di maia-le. Uno di questi peptidi, chiamato al-fa-endorfina, ha una sequenza corrispon-dente agli amminoacidi dal 61 al 76 dellabeta-lipotropina e presenta negli animalieffetti analgesici e tranquillanti. L'altro,designato come gamma-endorfina, hauna sequenza corrispondente agli ammi-noacidi dal 61 al 77 della beta lipotropi-na. Iniettato nei ratti, induce un com-portamento violento.

La funzione biologica delle endorfineipofisarie è un poco misteriosa. È impro-babile che esse passino dall'ipofisi al cer-vello, non essendovi tra i due organialcuna comunicazione diretta. Ragione-volmente essi regolano le funzioni ipofi-sarie che sono notoriamente alterate da-gli oppiati. Per esempio, la morfina libe-ra dall'ipofisi posteriore (neuroipofisi)l'ormone antidiuretico (ADH). Il fatto

che l'ipofisi possieda recettori per glioppiati, simili - come proprietà - a quellipresenti nel cervello, suggerisce che l'in-fluenza degli oppiati sulla funzione del-l'ipofisi posteriore, qual è per esempio laliberazione di ADH, può interessare glistessi recettori degli oppiati presenti nel-l'ipofisi.

Quali sono i rapporti tra la beta-lipo-tropina, le endorfine e l'encefalina? Ipeptidi biologicamente attivi sono sinte-tizzati di solito per scissione da precur-sori peptidici più grossi. Si potrebbe pen-sare che la beta-lipotropina o una suasequenza parziale possa servire nel cer-vello come precursore dell'encefalina.Tuttavia c'è il fatto che la beta-endorfi-na può essere identificata nel tessuto ce-rebrale solo in piccole quantità e che labeta-lipotropina non è mai stata trovatanel cervello. È dunque probabile che ipeptidi più grossi come la beta-endorfinasvolgano nell'ipofisi il loro ruolo piùimportante e che l'encefalina sia confi-nata all'encefalo e al midollo spinale.Poiché gli effetti analgesici ed euforiz-zanti degli oppiati sono mediati solo nelcervello e nel midollo spinale, sembrache le attività analgesiche delle endorfinesiano casuali e non correlate alla loronormale funzione.

L'encefalina viene degradata molto ra-pidamente da enzimi proteolitici, per

cui è difficile valutare il suo potenzialeanalgesico quando viene iniettata in unanimale per via endovenosa o addiritturadirettamente nei ventricoli cerebrali. Concomposti analoghi alle encefaline, cheresistono alla demolizione metabolica, èstato tuttavia possibile dimostrare che leencefaline hanno una potenza analgesicasimile a quella della morfina.

Il fatto che esse possano produrre a-nalgesia fa pensare che analoghi appro-priati potrebbero essere gli analgesici dalungo cercati, privi della capacità di in-durre tossicomania. Sicuramente l'uomonon diventa un tossicomane nei confron-ti delle sostanze che egli stesso produce.Oppure sì? Cosa che sorprende, quandoi ventricoli cerebrali dei ratti vengonoripetutamente iniettati con encefalina ocon beta-endorfina, come lo sono statinegli esperimenti effettuati da Eddie T.F. Wei e da Loh presso la University ofCalifornia School of Medicine a SanFrancisco, essi hanno dimostrato sintomidi assuefazione e di dipendenza fisica. Èdifficile valutare se i ratti diventino o nodei tossicomani così come avviene nel-l'uomo. Dato che risposte soggettive nonsi possono sollecitare negli animali, sipossono solo misurare i sintomi da pri-vazione, quali convulsioni e diarrea. Ve-rosimilmente la natura della effettiva di-pendenza, provocata da una continuataesposizione ai peptidi naturali simili aglioppiati, è qualitativamente diversa dallanatura di quella dipendenza che è causa-ta proprio dagli oppiati. Se così stannole cose, una miscela ottenuta a partiredalle encefaline, potrebbe costituire unpromettente analgesico che non causatossicomania.

ALF A-ENDORFIN A

M ETIONIN ENCEFALINA

Phe FENILALANINAAla ALANINA Gly GLICINA Pro PROLI NAArg ARGININA Ile ISOLEUCINA Ser SERINAAsn ASPARAGI NA His ISTIDINA Thr TREONINAAsp ACIDO ASPARTICO Leu LEUCINA Trp TRIPTOFANOGin GLUTAMMINA Lys LISINA Tyr TIROSINAGlu ACIDO GLUTAMMICO Met METIONINA Val VALINA

La beta-lipotropina, un ormone peptidico ipofisario formato da 91amminoacidi ha sequenze amminoacidiche con parecchie funzioni fi-siologiche distinte. La catena peptidica nel suo complesso regola ilmetabolismo lipidico, così come fa il segmento chiamato gamma-lipo-tropina (unità amminoacidiche da 1 a 58). La sequenza dall'amminoa-cido 41 all'amminoacido 58 è quella dell'ormone beta-melanotropina,che svolge una funzione nella pigmentazione cutanea. La sequenzadall'amminoacido 61 all'amminoacido 91 è quella della beta-endorfi-na, un peptide ipofisario che ha effetti analgesici quando vieneiniettato per via endovenosa o direttamente nell'encefalo. Un secondopeptide ipofisario, designato come alfa-endorfina (amminoacidi da 61a 76) ha effetti simili ma meno energici. La sequenza della beta-lipo-tropina dall'amminoacido 61 all'amminoacido 65 è identica a quelladella metioninencefalina, un peptide morfosimile che si trova nell'en-cefalo, nel midollo spinale e nell'intestino. Non conosciamo qua-le rapporto esista tra i peptidi oppiato-simili e la beta-lipotropina.

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