Ann 1.t. Supsr. Sonitd Vol. 22, N. 3 (1986). pp. 1125-1128

RPOLO DELLA FLORA BATTERICA INTESTINALE NELL'ENTEROPATIA DA INDOMETACINA NEL RATTO

G. Benoni (a), P. Del Soldato (b), L. Cuzzolin (a). M.G. Raimondi (a) 6 G.P. Velo (a)

) Istituto di Farmacologia, Università degli Studi. Verona, Italia; ) Fomenti Farmaceutici, Dipartimento di Farmacologia. Milano, Italia

iassunto. - E' stata studiata la relazione temporale tra modificazioni della f ora batterica intestinale e lo sviluppo delle lesioni da indometacina nel r tto. E' stato ipotizzato che i batteri aggravino e mantengano la lesione p ecedentemente indotta dal farmaco. In particolare sembrano essere implicati \ 4icrorganismi anaerobi quali Batteroidi e Clostridi.

l

(Role of intestina1 microflora in indomethacin-induced intestinal esions in rats). The aim of this work was to study the temporal relationship

the changes in intestina1 flora pattern and the development of the esions induced by indomethacin in rats. The role of the bacteria is in aggra- ating and maintaining the intestina1 lesions previously induced by the drug. acteroides and Clostridium species seem to be implicated in this damage.

E' stato studiato il ruolo della flora batterica intestinale nell'entero- patia da indometacina nel ratto, somministrando indometacina e indometacina

i rradiata. con radicali ossidrilici, che, oltre ad avere una maggior azione esiva a carico della mucosa intestinale, presenta anche una azione aspecifica ui batteri.

qteriali e Metodi I

1 Ad 8 ratti femmine Sprague-Dawley è stata somministrata per via orale Tdometacina (INDO) e indometacina irradiata (8 mglkg).

La raccolta delle feci e l'esame degli intestini sono stati fatti dopo 7 e d7 ore dalla prima dose e dopo 24 ore dalla seconda e dalla terza dose. Per duantificare ed identificare i microrganismi (API System) sono state utilizzate e usuali tecniche microbiologiche (1). La valutazione della lesione inte- tinale è stata fatta esaminando il tessuto macroscopicamente.

*.a IN W

Inmdhud I N W

! Fig. 1. - Percentuale di animali con lesioni intestinali dopo somministrazione di INDO e di INDO irradiata (8 mgfkg).

I Fig. 2. - Variazioni di alcune specie batteriche aerobie dopo somministrazione i di INDO e INDO irradiata

Risultati

A 7 ore da una dose di INDO non sono presenti lesioni. mentre con 1'INDO irradiata circa il 10% degli animali mostra lievi danni intestinali. Succes- sivamente la percentuale di animali con lesioni è pressoché uguale con le due forme del farmaco, anche se dopo 17 ore da una dose risulta leggermente più elevata con 1'INDO irradiata (Fig. 1). Per quanto riguarda la flora è stato osservato un calo di Batteroides, E.coli 1, S.faecalis 1 a 17 ore dalla sommi- nistrazione di una dose di INDO irradiata rispetto alla sola INDO. La diminu- zione delle specie aerobie (Fig. 2) si mantiene anche 24 ore dopo due dosi di INDO irradiata. I clostridi (Fig. 3) presentano un comportamento simile nel

; tempo con i due tipi di INDO.

Ti.. (h)

ig. 3. - Variazioni di alcune specie batteriche anaerobie dopo somministrazio- ne di INDO e INDO irradiata.

I1 calo della flora batterica aerobia a 17 ore dalla soministrazione di na dose e dopo 24 ore da due dosi di INDO irradiata, quando è gia evidente un

l anno a livello della mucosa intestinale. ci permette di ipotizzare un ruolo ella flora batterica aerobia nella patologia da indometacina secondario alla esione indotta dal farmaco. Possiamo inoltre concludere che l'azione batteri- ida dei radicali liberi presenti nell'INDO irradiata sembra essere rivolta oprattutto verso la flora aerobia.

Gli anaerobi, ed in particolare i Clostridi, sembrano i batteri maggior-

i ente implicati nell'aggravare il danno indotto dal farmaco, in quanto già dopo 7 ore da una dose cominciano a crescere fino a raggiungere livelli elevati sia on INDO normale che con INDO irradiata.

BIBLIOGRAFIA l 1. VEILLEUX, B.G. & ROWLAND, I. 1981. Simulation of the rat intestina1

ecosystem using a two-stage continuous Culture System. J. Gen. Microbiol. i 123: 103-115.

Ann. Iit. Super. Sanità Voi. 22, N. 3 (1986), pp. 1129-1132

4. Verhulst, S. Asselberghs & H. Eyssen

l i qega Institute, Leuven, Belgium

like Clostridium bifermentans, Eubacterium lentum. Eubacterium

aerofaciens, Eubacterium contortum and a Bacteroides in vitro linoleic acid into transvaccenic acid via

acid. Sevaral other species of the genera do 'not perform this reaction. Cl.spo- hydrogenated linoleic acid also &

iassunto (Bioidrogenazione dell'acido linoleico da parte della flora batterica intestinali indigeni come il Clostridium bifer-

il Clostridium sordellii. 1'Eubacterium fissicatena, 1'Eubacterium aerofaciens. 1'Eubacterium Bacteroides sp. idrogenano in vitro l'acido linoleico tramite l'acido 9 - 9 , 11-e-octadecadienoico. Molte

Eubacterium and Bacteroides non eseguono uesta ieazione. 11 Cl. sporogenes, il Cl. bifermentans e il Cl. sordellii id;oge- ano l'acido linoleico anche in vivo nel ratto.

fntroduction I

l Faecal lipids are characterized by a high content of --monoenes and baturated fatty acids. It was shown that preferential absorption and microbial ydrogenation are responsible for this content of saturated far. In earlier tudies we isolated an Eubacterium lentum strain which hydrogenated linoleic cid in vitro and in vivo in the rat (1). Biohydrogenation of linoleic acid was hown to be a genera1 characteristic of the species E.lentum (2). Recently. we ested severa1 other intestina1 species for biohydrogenation of linoleic acid.

pterials and Methods

l uantitative analysis of the transformation products of linoleic acid was obtained by GLC of their methyl esters on a 15% Hi Eff 2BP column.

The position of the double bonds in the unknown reaction products was determined by mass spectrometry of the trimethyl silyl ether derivatives of the corresponding polyols, obtained by hydroxylation of the double bonds, followed by silylation of the resulting hydroxyl groups (3).

To determine the geometry of the double bonds. polyunsaturated fatty acid methyl esters were isolated on AgN03-TLC, hydrolyzed to the free fatty acids l

and subjected to partial reduction with hydrazine in the presence of oxygen l (4). The geometry of the octadecenoic acids in the reduced reaction mixture was determined bv comoarison of their methvl ester derivatives with reference ! compounds on AgNO -TLC. The isolated octadecenoic acids were again subjected to 3 mass spectrometry to confirm the position of the double bonds.

Results

Al1 the positive strains (Table 1) hydrogenated in vitro linoleic acid into transvaccenic acid via 9-cis, Il-trans-octadecadienoic acid (Fig. 1). - - Cl.bifermentans, Cl.sporogenes, and Cl.sordellii hydrogenated linoleic acid also in vivo in gnotobiotic rats (Fig. 2). It was not possible to associate germ-free rats with Bacteroides sp. strain 17616.

Table 1. - In vitro hydrogenation of linoleic acida Species Source Hydrogenation of

linoleic acid

uFMlb; G C; ATCC 25762; ATCC 319; ATCC 691; > 80 X ATCC 155+9; NCTC 534 Dec 2; Dec 8; 17611 ; G~'; ATCC 638; ATCC 19299 > 80 % ATCC 9714: NCIB 6929 > 80 X Rega collection negative ATCC 19754 negative Rega collection negative Rega collection negative NCTC 2909 negative See (2) > 70 % ATCC 22540, Me 44 and ME 47d 1 strain > 70 X,

2 strains nega-

E.aerofaciens ATCC 25986, ATCC 29378 E.fissicatena ATCC 10445, ATCC 10446 E. limosun - n ATCC 10825; W 1 12272; VPI 12247; VPI 12017; negative

VPI 12067 E.alactolyticum VPI 11599; ATCC 17927; ATCC 17928; ATCC 19301; negative

ATCC 23263 E.cylindroides ATCC 47803; ATCC 27804; ATCC 27805; ATCC 27528 negative Bacteroides sp. 17616 > 80 X B. f ragilis NCTC 9343 negative B.furcosus ATCC 25662 negative

a The Clostridium and the Bacteroides strains were tested in supplemented Brain Heart Infusion Broth (BBL no 11059) containing 20 pg/ml of linoleic acid. The Eubacterium strains were tested in the same medium. containing 2 mglml of freeze-dried beef brain and 100 pglml of linoleic acid. b~solated from the caecum of conventional rats. C Isolated from the caecum of mice with a limited anaerobic flora. dObtained from M. Hazenberg. Erasmus University, Rotterdam. The Netherlands.

-0 e 1.0

O W J n P r

-0.5 o m Z V)

2 I

INCUBATION TIME

ig. 1. - Time course of the biohydrogenation of Cl.bifennentans ATCC 638. = linoleic acid; : 9 - e , ll-e-octadecadienoic acid; - transvaccenic acid. Al1 the hydrogenating species followed

the same reaction mechanisms.

Iscussion

% 8 0 r P

, Al1 strains tested hydrogenated linoleic acid into transvaccenic acid 9 cis, ll-trans-octadecadienoic acid. Not one of the strains tested followed l- - a other reaction mechanism to hydrogenate linoleic acid into an octadecenoic a id or saturated linoleic acid completely. Except for Eubacterium contortum, bfohydrogenation of linoleic acid seemed to be a general marker of the positive

was not a general marker of the genera Eubacterium, Clostridium and Since al1 the positive species are indigenous intestinal microor-

that at least part of the great amount of faecal --mono- eges can be explained by microbial hydrogenation of polyunsaturated fatty a+ids.

60-

&O -

! REFERENCES

- Fig. 2. - Faecal unsaturated C-18 fatty acid spectra of genn-free Fisher rats (A) or rats monoasso- ciated with Cl.bifennentans ATCC 638 (B), Cl.sordellii ATCC 9714

1. EYSSEN, H. & PARMENTIER, G. 1979. Influente of the microflora of the rat I

on the metabolism of fatty acids, sterols and bile acids in the intestinal , tract. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskrankh. Hyg. Abt. 1,

SUDO~. 7: 39-44. 2 . EYSSEN, H. & VERHULST, A. 1984. Biohydrogenation of linoleic acid and bile

acids by Eubacterium lentum. Appl. Environ. Microbiol. 47: 39-43.

20 - (C), or Cl.sporogenes ATCC 25762 (D).

1 8 : l 1 1 8 : 2

A B C D