CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA

PRESSIONE

•Tipi di cromatografo

•Unità di pressione

•Fase mobile

•Rivelatori

•HPLC di adsorbimento

•HPLC di ripartizione

Mauro Sabella

La cromatografia ad alta pressione HPLC (High Performance Liquid

Chromatography o High Pressure Liquid Chromatography) si basa sui

principi generali della cromatografia d’adsorbimento, di ripartizione, di

scambio ionico ecc.; essa permette di analizzare miscele difficilmente

risolvibili con le tradizionali cromatografie.

Le colonne HPLC hanno una maggiore risoluzione dovuta all’impiego di

fasi stazionarie molto finemente suddivise allo scopo di realizzare una

superficie di interazione molto grande ed un migliore impaccamento,

questo comporta che la fase mobile attraversi la fase stazionaria della

colonna ad una pressione molto alta per permettere una eluizione

accettabile nel tempo. Per una simile tecnica cromatografica, la fase

stazionaria, che presenta una granulometria generalmente compresa

tra 5-10 mm, deve avere requisiti particolari per adattarsi al tipo di

separazione da effettuare ed inoltre deve avere come requisiti

indispensabili:

a) essere stabile idroliticamente e termicamente;

b) resistere all’azione meccanica del flusso dell’eluente.

Mauro Sabella

Diversamente dalla gascromatografia, l’HPLC non separa

sostanze che si trovano allo stato di vapore, ma permette la

separazione di tutte quelle sostanze che difficilmente possono

essere vaporizzabili o che in ogni modo possano alterarsi ad una

temperatura più alta di quella ambiente; si può affermare che la

gascromatografia e l’HPLC sono due tecniche cromatografiche

che si completano a vicenda in quanto permettono di separare i

costituenti di una qualsiasi miscela.

I vantaggi dell’HPLC possono essere cosi riassunti:

1. tempi brevi d’esecuzione

2. riproducibilità delle condizioni sperimentali

3. le colonne possono essere usate più volte;

4. possono essere analizzate miscele di sostanze termolabili,

esplosive e non volatili.

5. possono essere evidenziate piccolissime quantità di sostanze

grazie all’alta sensibilità dei rivelatori che si utilizzano;

6. semplicità d’uso

Mauro Sabella

SCHEMA DI UN HPLC

Mauro Sabella

HPLC IN ISOCRATICA

Mauro Sabella

HPLC A GRADIENTE

Mauro Sabella

Le caratteristiche di uno strumento HPLC sono

rappresentate nello schema a blocchi delle figure. II

solvente opportunamente filtrato e depurato, viene inviato

alla colonna; questa operazione viene effettuata tramite

una pompa. Un flussometro, posto dopo la pompa, regolerà

la quantità di eluente che, nelle condizioni d’esercizio

scelte, sarà immesso nella colonna.

Prima della colonna cromatografica viene posto un

iniettore, che permette l’inserimento del campione sciolto in

un solvente opportuno. Per evitare di danneggiare la fase

stazionaria della colonna é opportuno eseguire una

prefiltrazione, attraverso una analoga colonna più piccola

posta in serie, contenente lo stesso tipo di fase stazionaria

con una dimensione delle particelle più grande, allo scopo

di eliminare le impurezze grossolane, le morchie e le

particelle insolubili contenute nel campione da analizzare.

Mauro Sabella

Alla fine della colonna cromatografia viene posto un adatto rivelatore che, attraverso il cromatogramma, darà indicazioni sull’andamento della separazione.

Nel caso in cui si opera in isocratica é sufficiente una sola pompa (figura 1), mentre nel caso in cui si opera a gradiente (figura 2), è necessario usare due pompe per mescolare i solventi ed inviarli alla colonna ad un valore controllato di pressione, le condizioni operative, in questo caso, verranno programmate in anticipo tramite un calcolatore che automaticamente effettuerà le operazioni necessarie. E’ importante osservare che, poiché l’HPLC opera con un alto flusso di fase mobile e quindi in condizioni di alta pressione, tutto il sistema operativo deve essere adatto per lavorare in queste condizioni.

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In particolare la fase stazionaria è posta in una colonnacromatografica fatta con un materiale adatto persopportare pressioni elevate (generalmente sonod’acciaio) e la colonna stessa deve essere inserita in unacamicia all’interno della quale sarà esercitata unapressione tale da equilibrare la pressione esercitata dallafase mobile all’interno della colonna.

Nel caso di una HPLC di tipo preparativo, il rivelatoredarà informazioni sulla separazione della miscela, perraccogliere le varie frazioni di eluito contenente lesostanze purificate. Nel caso in cui la separazione deivari costituenti risulterà parziale, le frazioni raccolte checontengono i componenti puri verranno raccolte, mentrele frazioni che contengono ancora le sostanze in miscelaverranno dirottate con un rubinetto ed inviate allacolonna per essere nuovamente cromatografate.

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Oltre ai vantaggi precedentemente elencati per questotipo di tecnica, l'HPLC costituisce un sistemacromatografico altamente efficiente in quanto:

- usa delle fasi stazionarie altamente perfezionate emolto versatili anche per separazioni particolarmentedifficili,

- usa rivelatori molto sensibili che vengono adattati altipo di sostanza da separare;

- usa un alto flusso delta fase stazionaria che porta aduna esecuzione molto rapida nel tempo ed efficace.

Mauro Sabella

UNITÀ DI PRESSIONE UTILIZZATE PER L’HPLC

Per questa tecnica cromatografia, l’unità di

pressione utilizzata è il pascal (pa)

1 pascal = 1 newton/m2 = 1x105 bar

1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm2

1 Megapascal (Mpa) = 10 bar = 9,869 atm =

10,1971 Kg/cm2

Mauro Sabella

FASE MOBILE

Nell’HPLC Ia fase mobile verrà scelta in funzione dellesostanze da separare e deve presentare alcune caratteristichepeculiari tali da non generare inconvenienti, fra queste:

deve presentare una bassa viscosità, in quanto questo permette dioperare, all'interno della colonna, in condizioni di pressione dieluizione non troppo elevata;

deve essere degasificato prima dell'introduzione in colonna; lapresenza di aria può modificare chimicamente le sostanze daseparare oppure dare alterazioni nella risposta del rivelatore

deve essere puro, perchè la presenza di sostanze estranee puòdanneggiare la colonna;

deve avere una temperatura di ebollizione sufficientemente elevataper evitare fenomeni di volatilizzazione alle temperature usatedurante l'operazione cromatografica.

Mauro Sabella

I SISTEMI DI POMPAGGIO

Le caratteristiche cui devono soddisfare le pompe impiegate per

l’HPLC sono molto restrittive e includono:

o Generazione di pressioni maggiori di 6000 psi (lb/in2)

o Non generare un pressione pulsatile in uscita

o Velocità di flusso variabili in un range di 0.1-10 ml/min

o La riproducibilità del flusso non deve variare più dello 0.5%

o Resistenza alla corrosione verso una grande varietà di solventi

Sono impiegati due tipi di pompe meccaniche: una del tipo a

siringa guidata a vite oppure una pompa alternativa (o a pistone),

mostrata in Figura 3.

La prima produce un flusso senza pulsazione e la velocità del

flusso è facilmente controllabile; ha però lo svantaggio di un alto

volume di riempimento, che diventa un problema quando devono

essere sostituiti i solventi.

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POMPE PER HPLCLe pompe a pistone sono quelle più

comunemente usate e sono costituite da

una piccola camera cilindrica che è

riempita e vuotata dal movimento di un

pistone. Il pompaggio produce un flusso

pulsatile che deve essere

successivamente linearizzato. I vantaggi

delle pompe a pistone sono un piccolo

volume interno, la capacità di generare

alte pressioni in uscita (superiori a

10000 psi), rapida adattabilità al

cambiamento dei gradienti nel corso

dell’analisi, flusso costante e inoltre sono

molto poco sensibili alla viscosità del

solvente e alla pressione in testa alla

colonna.

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SISTEMA DI INIEZIONE DEL CAMPIONE

Sebbene nella cromatografia in fase liquida sia spesso usatal’iniezione tramite siringa attraverso un setto costituito di materialeelastomero, questa procedura non è molto riproducibile e si puòusare solo a pressioni di lavoro inferiori a 1500 psi.

Nella iniezione stop-flow il flusso del solvente viene bloccato perpermettere l’asportazione di una piccola quantità di solvente in testaalla colonna e il caricamento del campione, sempre in testa, tramiteuna siringa.

Comunque il metodo di caricamento più usato in HPLC è quelloche usa il sampling loop, come mostrato in Figura 4. Questidispositivi sono equipaggiati di loop intercambiabili di capacitàvariabile dai 5 ai 500 μl. La caratteristica principale delsistema di iniezione tramite loop è l’alta riproducibilità deivolumi iniettati. 3

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Sistemi di iniezione per HPLC.

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SELEZIONE DELLA TECNICA HPLCMauro Sabella

ELUIZIONE ISOCRATICA O IN GRADIENTE

isocratica isocratica gradiente

(più forte) (meno forte)

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COLONNE PER HPLC

Le colonne per HPLC sono di solito

costruite in acciaio, ma esistono

anche in vetro ricoperto di metallo

impiegate soprattutto quando si lavora

a pressioni inferiori a 600 psi. La

lunghezza delle colonne varia da 10 a

30 cm e il diametro interno da 4 a 10

mm. Le colonne sono generalmente

impaccate con particelle di diametro

variabile dai 5 ai 10 μm. Colonne di

questo tipo arrivano generalmente a

contenere dai 40000 ai 60000 piatti

per metro di lunghezza.

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Recentemente sono state introdotte sul mercato

microcolonne lunghe dai 3 ai 6.5 cm e aventi un

diametro interno variabile da 1 a 4.6 mm. Queste

colonne che sono impaccate con particelle di diametro

variabile dai 3 ai 5 μm, contengono più di 100000

piatti per metro e hanno il vantaggio di una maggiore

velocità operativa e di un minore consumo di solvente.

Quest’ultima proprietà è di notevole importanza

perché i solventi ad alta purezza richiesti per questo

tipo di cromatografia sono molto costosi. Con questo

tipo di colonne vi sono esempi di separazione di 8

composti in un tempo di 15 secondi con una colonna

lunga 4 cm con un diametro interno di 4 mm e

impaccata con particelle di 3 μm di diametro. 6

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Il più comune materiale usato per impaccare lecolonne per HPLC è la silice, preparata peragglomerazione di particelle di diametro inferioreal micron sotto condizioni che portano a particellepiù grandi con diametri altamente uniformi.

Le particelle risultanti sono spesso rivestite consottili film di composti organici, che sono legatialla superficie tramite legami chimici o fisici.

Altri materiali usati per impaccare le colonne sono le particelle di albumina, di polimeri microporosi e resine a scambio ionico.

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RIVELATORI PER HPLC

Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti

Solute properties: si misura una caratteristica del soluto

Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis)

UV-visibile con Diode-array (UV-DAD)

Spettrofotometrico IR

Fluorimetrico

Indice di rifrazione (RID)

Elettrochimico (ED)

Spettrometria di massa (MS)

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RIVELATORI

I tipi di rivelatori che possono essere utilizzati per l'HPLC

sono diversi,

l'uso di ciascuno in relazione alla natura delle sostanze che

debbono essere evidenziate. E' evidente che, qualunque sia il

rivelatore usato, la fase mobile non deve in alcun

modo interferire nella determinazione ed il rumore di fondo

dello strumento non deve essere superiore al segnale più

basso dovuto alle varie sostanze da analizzare.

I rivelatori più comunemente usati sono:

•spettrofotometrici, (IR, UV ecc.), concentrazione minima

rilevabile 10-8 - 10-9 g/ml;

•fluorimetrici, concentrazione minima rilevabile 10-10 - 10-11

g/ml;

•a indice di rifrazione, un rivelatore a bassa sensibiIità

•a ionizzazione di fiamma.

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RIVELATORE SPETTROFOTOMETRICO UV-VISIBILE

il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione)

basato sull’assorbimento di luce nel range UV-visibile

sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm)

sensibilità tipica: 0.1 ppb

è un sistema non distruttivo

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GRUPPI CROMOFORI

Cromoforo Formula lmax (nm) e

aldeide -CHO 210 1.500

amino -NH2 195 2.800

azo -N=N- 285-400 3-25

bromuro -Br 208 300

carbossile -COOH 200-210 50-70

chetone -C=O 195 1.000

disolfuro -S-S- 194 5.500

estere -COOR 205 50

etere -O- 185 1.000

etilene -C=C- 190 6.000

fenile -C6H5 202, 255

naftile 220, 275

nitrato -ONO2 270 12

nitrito -ONO 220-230 1.000-2.000

nitrile -C=N 160 -

nitro -NO2 210 forte

SCELTA DELLA LUNGHEZZA D’ONDA

La l del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni:

massimizzare sensibilità e specificità

il solvente della fase mobile può causare shifts in lmax (2-5 nm)

controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile

i solventi per fase mobile hanno cutoff (valore di soglia) nell’UV

operando sotto la lcutoff può:

ridurre la sensibilità

introdurre rumore sulla linea di base

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RIVELATORE A INDICE DI RIFRAZIONE

basato sulla

misura

del’indice di

rifrazione

dell’eluato

(tipico rivelatore

bulk)

non adatto con

eluizione in

gradiente

• sensibilità tipica: 0. 1 ppm

• completamente aspecifico

• necessita di termostatazione accuratissima

• si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri)

• è un sistema non distruttivo

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HPLC DI ADSORBIMENTO

I principi su cui si basa la cromatografia di adsorbimento sono stati già trattati nella parte generale. Si può operare in fase normale o in fase inversa in funzione del materiale che si usa per la fase stazionaria. La fase stazionaria può essere caratterizzata, in relazione alla sua struttura fisica, in due categorie:

materiale poroso sia in superficie che all’interno contraddistinto in

microporous, se la dimensione vana fra 5-10 mm;

macroporous, se la dimensione varia fra 50-100 mm

materiale, di dimensione compresa fra 20-40 mm, compatto nella parte interna e con una pellicola porosa in superficie dello spessore compreso fra 1-2 mm, che viene definito pellicular.

I macroporous e i pellicular vengono generalmente utilizzati per cromatografie preparative.

I materiali più comunemente utilizzati sono: gel di silice, allumina, poliamidi, cellulosa, acetato di cellulosa, chromosorb(polimeri del vinil- e divinilbenzene).

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HPLC DL RIPARTIZIONE

Per questo tipo di cromatografia la fase stazionaria écostituita da un liquido che può essere legato ad unsupporto inerte fisicamente o chimicamente. Nel caso in cuila fase stazionaria è legata fisicamente, può verificarsi untrascinamento di essa da parte della fase mobile; per evitarequesto, che porterebbe ad una cromatografia nonperfettamente efficiente si usa saturare la fase mobile conla fase stazionaria.

In generale per evitare trascinamenti della fase stazionariasi usa operare legando chimicamente la fase stazionariainerte che in genere è costituita da gel di silice, in particolarevengono funzionalizzati in vario modo i gruppi silanolici(figura 3)

Mauro Sabella

Mauro Sabella

ALCUNI METODI DI FUNZIONALIZZAZIONE VENGONO RIPORTATI

NELLO SCHEMA SEGUENTE:

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Se si adopera come fase stazionaria silice legata

chimicamente con gruppi funzionali (bonded phase

chromatography) si può operare sia in fase normale che in

fase inversa in funzione della polarità dei gruppi legati al

supporto, si avrà così: fase normale: silice legata a gruppi

cianopropilici; fase inversa: silice legata a -C18, -C8, -fenile.

L’ordine di polarità dei vari gruppi legati alla silice varia

secondo la seguente scala di polarità: -CN > -NH2 > -C(CH3)2

> -C8> -fenile

Si può operare sia in fase normale che in fase inversa,

tenendo conto del tipo di fase mobile da usare in funzione del

tipo di fase stazionaria.

Mauro Sabella